基因组编辑细胞系细胞融合，用于细胞结构和功能的扰动

摘要

该协议的目的是融合两种不同的细胞类型，以创建混合细胞。熔融细胞的荧光显微镜分析用于跟踪细胞细胞器来源细胞。此测定可用于探索细胞结构和功能如何对细胞融合对扰动的反应。

摘要

生命在脂质膜内的空间划分，允许细胞和细胞器内分离形成不同的分子状态。细胞融合是两个或多个细胞的合并，形成单个细胞。在这里，我们提供了两种不同细胞类型的细胞融合协议。融合混合细胞通过基于流式细胞学的分类进行浓缩，然后是混合细胞结构和功能的荧光显微镜。基因组编辑产生的荧光标记蛋白在融合细胞内成像，允许根据荧光发射识别细胞结构，并引用回源细胞类型。这种稳健和一般的方法可以应用于不同的细胞类型或感兴趣的细胞器，以了解细胞结构和功能跨越一系列的基本生物学问题。

引言

细胞结构的静时维持对生命至关重要。细胞具有特征形态、亚细胞细胞细胞数和内部生化组合物。了解这些基本特性是如何产生的，以及它们在疾病期间是如何出错的，这需要实验室工具来干扰它们。

细胞融合是两个或多个独立细胞的融合。细胞融合可能是真^核生物1的出现的关键。在人体内，细胞融合是比较少见的，发生在受限发育环境和组织类型，如受精期间或形成肌肉，骨骼和胎盘^2。该协议描述了细胞-细胞融合在组织培养细胞系的诱导与微分荧光标记的细胞器，作为一个工具，了解控制细胞结构和功能的机制。

体外诱导细胞融合是单克隆抗体³的产生中心，是生物研究和疾病治疗的重要工具。细胞融合还被用来问许多不同的基本细胞生物学问题，关于细胞周期支配^4，非倍体^5，6，细胞重新编程^7，8，修复受损的神经元^9，病毒增殖^10，凋亡^11，肿瘤发生^12，细胞骨骼动力学^13，和膜融合^14，15。基于实验室的方法诱导细胞融合16、17、18、19通过物理合并两个双层细胞合并成一个脂质膜。细胞融合可以由电诱导^18，基于病毒的方法^17，热质加热^20，转基因表达^19，以及包括聚乙烯乙二醇（PEG）16、21、22在内的化学物质。

中心体是控制细胞形状、运动、极化和除²³的微管组织中心。中生菌根是纤维结构，延伸自含有蛋白质根蛋白²⁴的中源体（由基因CROCC编码）。我们最近使用细胞融合来了解在异体内与父母细胞²⁴相比，中位位置和数量是如何变化的。使用这种方法的原理是跟踪在微分荧光标记的亲子细胞融合后，在异体细胞内的根源细胞，从而成像细胞融合和裂变。荧光标记的蛋白质根蛋白-meGFP或根蛋白-mscarlet-I通过基因组编辑在单独的细胞系中产生，然后通过PEG介导的细胞融合融合。我们描述了使用细胞染料（材料表）来识别融合细胞通过流式细胞学和随后的荧光显微镜鉴定的中源体细胞的起源和形态（图1）。这种方法是一种强大而独特的方法，用于研究细胞状态的重大变化，包括细胞细胞数量如何影响细胞平衡。

研究方案

1. 差分荧光细胞标签

1. 使用 CRISPR Cas9 进行基因标记
   1. 使用CRISPR Cas9基因组编辑将根蛋白（或其他感兴趣的基因）与人类癌细胞系中的荧光蛋白meGFP或mscarlet-I标记。
      注:基因组编辑的详细方案在24、25、26日其他部分进行。
2. 荧光染料标签
   1. 在Dulbeco的改性Eagle培养基（DMEM）中生长Cal51人类癌细胞，在加湿培养箱中辅以10%胎儿牛血清（FBS）、L-谷氨酰胺和100μg/mL青霉素/链霉素37°C和5%CO2加湿培养箱。
      注:必须确保定期检查细胞是否不存在支原体污染，以及细胞系的身份。不要使用在培养中广泛传递的单元格（>15 段落）。细胞必须健康，并且呈指数级增长。避免汇合不足或过度汇合。
   2. 播种每个细胞类型（根letin-meGFP，根letin-mscarlet-I和父母未标记的Cal51细胞），这样，每个样本的第二天出现+6 x 10⁶细胞，在70-90%的汇合处出现。
      注:这是大约一个T75组织培养瓶或一个10厘米盘每个细胞类型。父未标记的单元格在协议的后面作为负控制是必需的。该协议允许生产 20，000 个熔融细胞，但可以通过增加批处理数量来扩大协议数量来增加这一数量。
   3. 第二天，将DMEM、胰蛋白酶和1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）置于37°C的水浴中。
   4. 通过浇注或吸气介质，并用 10 mL 的 PBS 替换，在 PBS 中清洗根耳-meGFP 和根letin-mscarlet-I 细胞 2x。
   5. 在PBS中加入500 nM紫细胞染料（材料表），在室温（RT）下加入1分钟，为Cal51根肠-meGFP细胞贴上标签。
   6. 在PBS中加入200 nM远红细胞染料（材料表），在RT处添加1分钟，从而标记Cal51根肠-mscarlet-I细胞。
      注:在荧光染色后，尽可能保持样品的光线遮挡，以避免荧光的光漂白。
   7. 加入10 mL的DMEM5分钟，停止染料标签反应。
   8. 从培养箱中删除未标记的家长 Cal51 细胞（从步骤 1.2.2 开始）。
      注:这些单元格稍后将用作未标记的负对照（步骤 3.3.2）。
   9. 通过倒出生长培养基并更换10 mL的PBS，洗净所有细胞一次。
   10. 倒入PBS，在培养条件下孵育5分钟，预加热1x胰蛋白酶1mL。
   11. 将细胞转移到15 mL塑料锥形管和离心机在1000 x g5分钟。
   12. 用移液器小心地从细胞颗粒中取出和丢弃胰蛋白酶。
   13. 在 1 mL 的 PBS 中轻轻重新悬浮紫色和远红色标记的细胞颗粒。
   14. 在 DMEM 的 1 mL 中轻轻重新悬浮亲子（非荧光）细胞颗粒，然后返回到培养箱。
       注:该样品不会进行细胞融合，但稍后将在流式细胞测定期间使用。

2. 细胞融合

1. 使用 1 mL 移液器将 3 x 10⁶紫色标记细胞与 3 x 10⁶远红色标记细胞混合在 15 mL 管中，轻轻移液每个细胞类型的 0.5 mL。
2. 在步骤2.1处将剩余的未混合细胞在1，000 x g下离心5分钟，然后倒出PBS，将颗粒重新悬浮在1 mL的DMEM中，然后返回到孵化器。
   注:这些剩余的未混合单标签样品稍后将用作协议第 3 节中的负和补偿控制。
3. 将混合细胞从步骤 2.1 在 1，000 x g下离心 5 分钟，并使用 1 mL 移液器小心吸气。
4. 使用 1 mL 移液器在 30 s 的时间段内，以滴滴方式向细胞颗粒（步骤 2.3）添加 0.7 mL 的 50% 1450 PEG 溶液。
5. 在 RT 上离开 3.5 分钟。
   注:PEG的孵育时间可以根据细胞类型进行优化，但请注意，较长的孵育时间会增加细胞毒性。
6. 加入10 mL无血清DMEM滴30秒，并在孵化器中离开10分钟。
7. 以 1，000 x g下旋转 5 分钟，丢弃上清液，并在 1 mL 的完整介质（包含 FBS 的 DMEM）中轻轻重新悬浮。
   注:直接转到第 3 节。与PEG暴露相关的毒性，然后是流式细胞学和成像，因此通过在步骤之间快速前进，尽可能保持细胞在培养条件下。

3. 荧光激活细胞分拣 （FACS） 以丰富熔融细胞

1. 通过 70 μm 过滤器将每个样品分别移液到 FACS 管中，为所有细胞制备流动细胞测定。
   注:需要四个样本:融合细胞、单标记远红细胞、单标记紫罗兰细胞、未标记的亲子细胞。一旦从无菌组织培养罩中取出，细胞就有能力被感染，因此从此处开始，将样品接触非无菌环境的时间降至最低。单元格以完整的 DMEM 介质排序。
2. 使用能够单细胞分拣的细胞仪。
   1. 为无菌排序设置单元分拣机。根据制造商的建议执行仪器质量控制。
   2. 绘制正向散点与侧散射的图解和双精度区分图。
3. 创建门以识别融合的细胞。
   1. 以 405 nm 和 635 nm 的波长激发荧光染料。检测在450纳米和660纳米（紫色和远红色波长，分别）。绘制远红色与紫色波长。
   2. 通过细胞仪运行未标记的亲子细胞并记录荧光强度。
      注:高于此基线的值定义染色的正向性。
   3. 通过细胞仪运行单个标记的紫色细胞。确认没有紫罗兰溢出到远红色通道。
   4. 通过细胞仪运行单个标有远红的细胞，并确认没有溢出远红进入紫罗兰通道。
      注:对于所示的代表性数据，在配备 100 μm 喷嘴的分拣器上，细胞按 20 psi 排序。
   5. 简要运行融合示例，以确认融合细胞在步骤 3.3 中创建的浇口中可见。
4. 将分拣流集中对齐到 8 well 成像盘中。
5. FACS将融合细胞分类，作为双阳性紫罗兰和远红色标记细胞直接放入含有100μL生长培养基的8井成像盘中。
   注:建议的最大细胞数为每8口菜50，000欧元。在分拣期间确保细胞健康。细胞汇合会影响细胞健康，因此通过为成像培养皿对适当数量的细胞进行排序，使细胞在分拣后保持在20-90%的汇合度之间。每个已分拣的液滴包含大约 3 nL 的护套液。确保护套液在分拣过程中不会显著稀释生长介质。
6. 分类后，将细胞带回孵化器，离开>2小时或过夜。
   注:在此期间，粘附细胞会逐渐重新粘附在盖玻片上，从分拣开始，因此，如果直接进入显微镜，其形态会随时间而变化。

4. 细胞融合的免疫荧光染色和成像

注:融合细胞可以实时成像或固定后，并进一步荧光染色（或两者），具体取决于所需的实验和测量。

1. 活细胞成像
   1. 用无苯酚红（材料表）的成像介质代替生长培养基，然后直接进行成像。
2. 固定和染色
   1. 在PBS中制备新鲜的4%甲醛（PFA）。
   2. 在RT时，在100μL的4%PFA中孵育细胞15分钟，在RT.15分钟后取出PFA，修复细胞。
      警告:PFA 吸入时有毒，因此此步骤应在烟气罩中执行，并配备适当的个人防护设备。
      注:固定后，可以暂停实验，并在需要时稍后重新启动。如果需要，将样品存放在 4°C，防止光线照射。
   3. 在RT时，在PBS的200μL中洗涤细胞3倍。
   4. 在200μL0.1%非离子表面活性剂（材料表）和0.1%非离子洗涤剂（材料表）中稀释的RT中渗透细胞10分钟。
   5. 在PBS中块200μL的3%牛血清白蛋白，在RT时30分钟。
   6. 在150 μL的PBS中孵育抗体，含有3%牛血清白蛋白和0.1%非离子表面活性剂和0.05%非离子洗涤剂，在RT为1小时。
      注:用于产生代表性结果的主要抗体是荧光结合抗GFP nanobody（在1:400稀释时使用）和荧光结合抗mscarlet-I nanobody（在1:500稀释时使用）。这些增强已经荧光蛋白的信号。
   7. 在 300 μL 的 PBS 中洗涤 2 次 5 分钟，然后在 200 μL 的 PBS 中离开。
      注:样品在 PBS 中成像。样品可储存在4°C，防止光线照射。
3. 图像采集
   1. 使用适当的荧光显微镜获取图像，该显微镜具有四色成像能力（例如，共聚焦、宽场、结构化照明）。
   2. 分别使用 488 nm 和 561 nm 波长激光器激发 meGFP 和 mscarlet-I 通道。设置探测器，以 ±505*550 nm 和 ±590*650 nm 进行检测。分别使用 405 nm 和 633 nm 激光激发紫色和远红色染料通道。设置探测器，以在 +430×500 nm 和 +660*750 nm 处进行检测。
   3. 经验确定激光强度，这样就不会发生显著的光漂白，并且细胞保持健康（如果活细胞成像）。
   4. 经验确定增益，这样信号在不饱和或人为剪切像素值的情况下获得。
   5. 收集 Z 堆栈数据，使图像是三维的，覆盖范围为 20~60 μm，步长大小为 ±500 μm。
      注:代表性数据中显示的图像由共聚焦（图2B）、Airyscan（图2C）或结构化照明显微镜（图2D）获取。如果每个细胞都含有紫罗兰和远红染料，则其在细胞质中重叠，则每个细胞都是真正的异体素。

结果

在流式细胞测量过程中，荧光信号高于未标记的控制细胞（图2A）。盖茨被设置为对双阳性细胞进行分类，将这个群体直接浓缩成成像皿，以便进行进一步的微观分析。熔融细胞可检测为明显的双荧光阳性细胞，约占种群的±1%。

融合通过将两个细胞混合成一个（图

讨论

我们演示了一种简单且经济高效的方案，用于融合细胞，并用显微镜可视化细胞混合的后续架构，从开始到结束大约需要两天时间。该协议的关键部分是通过细胞分拣富化熔融细胞（协议第3节），以及通过显微镜对熔融细胞进行仔细验证（协议第4节）。这些部分确保熔融细胞容易获得，是真正的异体。应坚持浓度和孵育时间。例如，当在较高浓度或较长的孵育时间下使用时，细胞染料在流式细?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 ml tube	Sarstedt	62554502
37% formaldehyde solution	Sigma-Aldrich	F8875
880 Laser Scanning Confocal Airyscan Microscope	Carl Zeiss
8-well imaging dishes	Ibidi	80826
Anti-GFP alpaca GFP booster nanobody	Chromotek	gba-488
BD Influx Cell Sorter	BD Biosciences
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Cell Filters (70um)	Biofil	CSS010070
CellTrace Far Red	ThermoFisher Scientific	C34572
CellTrace Violet	ThermoFisher Scientific	C34571
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate	ThermoFisher Scientific	31966021
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	10270-106
FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobody	NanoTag Biotechnologies	N1302-At565
L15 CO2 independent imaging medium	Sigma-Aldrich	21083027
Penicillin/streptomycin	Sigma-Aldrich	15140122
Phenol red free DMEM, high glucose	ThermoFisher Scientific	21063029
Phosphate buffered saline (1 x PBS)			8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2HPO4, dH2O up to 1L
Polyethylene Glycol Hybri-Max 1450	Sigma-Aldrich	P7181
Polypropylene tubes	BD Falcon	352063
Triton X-100	Fisher BioReagents	BP151	nonionic surfactant
Trypsin	Sigma-Aldrich	T4049
Tween 20	Fisher BioReagents	BP337	nonionic detergent