תא תא פיוז'ן של הגנום בעריכה קווי תאים עבור פרטורבציה של מבנה הסלולר ותפקוד

Summary

מטרת פרוטוקול זה היא לנתיך שני סוגי תאים שונים כדי ליצור תאים היברידיים. ניתוח מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית של תאים התמזגו משמש כדי לעקוב אחר התא של המקור של אורגלים הסלולר. ניתן להשתמש באפשרות זו כדי לחקור כיצד המבנה התאי והפונקציה מגיבים להפרעות באיחוי התאים.

Abstract

החיים מחולק למחיצות בתוך קרום השומנים כדי לאפשר היווצרות מבודדת של מצבים מולקולריים ברורים בתוך תאים ואורגלים. Fusion תא הוא מיזוג של שני תאים או יותר כדי ליצור תא בודד. כאן אנו מספקים פרוטוקול למיזוג תאים של שני סוגי תאים שונים. תאים היברידית התמזגו מועשרים על ידי מיון cy, מבוססי הזרמת הזרם, ואחריו מיקרוסקופ פלואורסצנטית של מבנה תאים היברידית ותפקוד. פלואור שתייגת חלבונים שנוצרו על ידי עריכת הגנום הם התמונה בתוך תאים התמזגו, המאפשר מבנים סלולריים להיות מזוהה מבוסס על פליטת הזריחה והפניה בחזרה לסוג התא של המקור. השיטה האיתנה והכללית יכולה להיות מוחלת על סוגי תאים שונים או על-ידי אורגלים של עניין, להבין את המבנה התאי והתפקוד על-פני מגוון של שאלות ביולוגיות בסיסיות.

Introduction

הומסטטי תחזוקה של מבנה הסלולר הוא קריטי לחיים. לתאים יש מורפולוגיות אופייניות, מספרי משנה-תאית וקומפוזיציה ביוכימית פנימית. הבנת האופן שבו מאפיינים בסיסיים אלה נוצרים וכיצד הם משתבש במהלך המחלה מחייב כלי מעבדה כדי לperturb אותם.

Fusion תא הוא המיזוג בין שני תאים נפרדים או יותר. היתוך תא אולי היה קריטי הופעתה של חיים איקריוטית¹. בגוף האדם, פיוז'ן התא הוא נדיר יחסית, המתרחשים בנסיבות התפתחותיות מוגבלות סוגי רקמות, כגון במהלך הפריה או היווצרות של שריר, עצם השליה². פרוטוקול זה מתאר את האינדוקציה של היתוך תא התא בקווי תרבות של רקמה עם שורות מפורטות בצורה מסודרת, ככלי להבנת המנגנונים השולטים במבנה התאים ובתפקוד.

בהשפעת מחוץ לגוף היתוך תא התא הוא מרכזי לייצור נוגדנים חד שבטיים³, כלי חשוב עבור מחקר ביולוגי וטיפול במחלות. הפיוז תא גם שימש כדי לשאול שאלות רבות שונות ביולוגית תא ביולוגי על מחזור התא הדומיננטיות⁴, אנאפלואידיה^5,6, הסלולר מחדש^7,8, תיקון של נוירונים פגומים⁹, ויראלי התפשטות¹⁰, אפופטוזיס¹¹, tuמוריגנזה¹², ציטושלד דינמיקה¹³, ו ממברנה פיוז'ן^14,15. מעבדה מבוסס שיטות כדי לגרום היתוך תא תא^16,17,18,19 לגרום לשומנים הממברנה ממברנה דרך המיזוג הפיזי של שני bilayers לתוך אחד. היתוך תא יכול להיגרם על ידי חשמל¹⁸, שיטות ויראלי מבוסס¹⁷, חימום תרמוטרמונית²⁰, הביטוי הטרנסגנטי¹⁹, וכימיקלים כולל פוליאתילן גליקול (יתד)^16,21,22.

הסנטזומים הם מרכזי ארגון השולטים בצורה התאית, בתנועתיות, בקיטוב ובחטיבה²³. השורשים הסנטורזומוניים הם מבנים סיבי הארכת מ סנטרוזומים המכילים את החלבון שורטלטין²⁴ (מקודד על ידי הגנים crocc). השתמשנו לאחרונה היתוך תא התא כדי להבין כיצד centrosome מיקום ומספר משתנה בתוך heterokaryons יחסית לתאי הורים²⁴. הרציונל מאחורי השימוש בשיטה זו היא לעקוב אחר התא של המקור של שורשים בתוך הטרולויון לאחר היתוך של מתויג באופן שולי בתאי הורים מסומנים, ובכך היתוך אורגונל התמונה ביקוע. הפלואור מתויג בעזרת חלבונים שרוסטין-ממגה או שורטלטין-mScarlet-I נוצר על ידי עריכת הגנום בקווים נפרדים תאים אשר התמזגו אז על ידי היתוך תא יתד בתיווך. אנו מתארים את השימוש בצבעי תאים (טבלה של חומרים) כדי לזהות תאים התמזגו על ידי זרימה cy, ולאחר מכן זיהוי המיקרוסקופיה של מיקרוסקופ של תא של מקור ומורפולוגיה (איור 1). גישה זו היא שיטה איתנה וייחודית ללמוד כיצד השינויים העיקריים במצב הסלולר, כולל מספר ארגונית המגלגל על הומאוסטזיס התאים.

Protocol

1. תא פלורסנט משלים התיוג

1. התיוג הגנטי עם Cas9
   1. השתמש ב-CRISPR Cas9 הגנום עריכה לתייג שורטלטין (או גנים אחרים של עניין) עם חלבונים פלורסנט meGFP או mScarlet-I בתאי הסרטן האנושי.
      הערה: פרוטוקולים מפורטים עבור עריכת הגנום מכוסים במקום אחר^24,25,26.
2. תוויות צבע פלורסנט
   1. לגדול Cal51 תאים סרטניים אנושיים במדיום שונה של מדיום הנשר (DMEM) שיושלם עם 10% סרום עוברי (FBS), L-גלוטמין, ו 100 μg/mL פניצילין/סטרפטומיצין ב 37 ° צ' ו 5% CO₂ באינקובטור מחולל.
      הערה: חשוב לוודא כי התאים נבדקים באופן קבוע להעדר זיהום mycoplasma, ולזהות קו התא. אין להשתמש בתאים שעברו בהרחבה בתרבות (> 15 מעברים). התאים חייבים להיות בריאים וגדלים באופן אקספוננציאלי. הימנע בשטף או בשטף.
   2. זרע כל סוג תא (וורטלטין-מגלוקס, שורטלטין-משני-אני והורי Cal51 תאים) כגון ~ 6 x 10⁶ תאים נמצאים למחרת עבור כל דגימה, בשטף של 70 ל-90%.
      הערה: זה כ 1 T75 התרבות רקמה בקבוקון או 1 10 ס"מ צלחת לכל סוג תא. התאים הלא מתויגים של ההורים נדרשים כפקד שלילי בהמשך הפרוטוקול. פרוטוקול זה מאפשר ייצור של ~ 20,000 תאים התמזגו, אבל מספר זה יכול להיות מוגבר באמצעות שינוי גודל הפרוטוקול עם מספר גדל של אצוות.
   3. למחרת היום, DMEM לחמם את הבית, טריפסין ו-1x פוספט באגירה מלוחים (PBS) על ידי הצבת אותם באמבט מים ב 37 ° c.
   4. שטוף שורטלטין-מגלוקס ושורטלטין-מני תאים 2x בערוץ הpbs על ידי שפיכת או לשטוף את המדיום והחלפת עם 10 מ ל של PBS.
   5. תווית Cal51 ורטלטין-מגלוב תאים על ידי הוספת 500 ננומטר לצבוע תא (טבלת חומרים) ב-PBS עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
   6. התווית Cal51 ורטלטין-משני תאי-I על-ידי הוספת 200 ננומטר לצביעת תא אדום רחוק (טבלת חומרים) ב-PBS עבור 1 דקות בשעה RT.
      הערה: לשמור דגימות מוגן מפני אור בכל מקום שניתן לאחר כתמים פלורסנט, כדי למנוע הלבנה של זריחה.
   7. להפסיק את התגובות תוויות הצבע על ידי הוספת 10 מ ל DMEM עבור 5 דקות.
   8. הסר תאים Cal51 הורים ללא תווית מהאינקובטור (משלב 1.2.2).
      הערה: תאים אלה ישמשו מאוחר יותר כפקדים שליליים שאינם מסומנים בתווית (step 3.3.2).
   9. לשטוף את כל התאים פעם אחת על ידי שפיכת הצמיחה בינונית והחלפה עם 10 מ ל של PBS.
   10. יוצקים את PBS ו-דגירה עבור 5 דקות בתנאי התרבות עם 1 מ ל של מחומם טרום טריפסין 1x.
   11. העברת תאים ל 15 מ"ל שפופרת פלסטיק חרוטי ו צנטריפוגה ב 1000 x g עבור 5 דקות.
   12. בזהירות להסיר ולמחוק טריפסין מתוך הגלולה תא עם פיפטה.
   13. השהה מחדש בעדינות את כדורי התאים הסגולים המוצגים באדום ובמרחק של 1 מ ל של PBS.
   14. השהה מחדש בעדינות את הגלולה של תא הורים (לא פלורסנט) ב-1 מ ל של DMEM וחזור לחממה.
       הערה: מדגם זה לא יעבור היתוך תא התא אך יהיה בשימוש מאוחר יותר במהלך הזרימה cy, לנסות.

2. תא תאים פיוז'ן

1. מערבבים 3 x 10⁶ תאים סגול מתויג עם 3 x 10⁶ תאים אדומים הרבה מתויג בצינור 15 מ ל על ידי ליטוף בעדינות ביחד 0.5 mL של כל סוג תא באמצעות פיפטה 1 mL.
2. צנטריפוגה את התאים הנותרים שלא התערבבו משלב 2.1 בשעה 1,000 x g עבור 5 דקות, ואז לשפוך את PBS, להשעות את הגלולה ב 1 מ ל של dmem ולחזור לחממה.
   הערה: הדגימות הנותרות שאינן מעורבות בתווית אחת ישמשו מאוחר יותר כפקדים שליליים ופיצוי בסעיף 3 של הפרוטוקול.
3. צנטריפוגה את התאים המעורבים משלב 2.1 בשעה 1,000 x g עבור 5 דקות ובזהירות לאכול PBS באמצעות פיפטה 1 mL.
4. הוסף 0.7 mL של 50% 1450 הפתרון יתד בצורה dropwise אל הגלולה תא (שלב 2.3) באמצעות פיפטה 1 mL על פני תקופה של 30 s.
5. השאירו 3.5 דקות בשעה RT.
   הערה: דגירה זמן עם פג עשוי להיות ממוטב בהתאם לסוג התא, למרות הערה כי זמן הדגירה ארוך יותר מגביר רעילות התאים.
6. הוסף 10 מ ל של הסרום-free DMEM dropwise עבור 30 s ולעזוב בחממה עבור 10 דקות.
7. ספין למטה ב 1,000 x g עבור 5 דקות, למחוק supernatant, ולהשעות בעדינות 1 מ ל של בינוני מלא (dmem המכיל fbs).
   הערה: . המשך ישירות לאגף 3 יש רעילות הקשורים לחשיפה יתד ואחריו הזרמת cy, הדמיה, כך לשמור על תאים בתנאי התרבות ככל האפשר על ידי הליך במהירות בין שלבים.

3. מיון תאים פלואורסצנטית-מופעל (FACS) כדי להעשיר את התאים התמזגו

1. הכינו את כל התאים להזרמת cy, בעדינות על ידי ליטוף כל מדגם בנפרד באמצעות מסנן 70 יקרומטר לתוך צינור facs.
   הערה: ארבע דגימות נדרשות: תאים מוהתמזגו, תאים אדומים הרחק מסומנים בודדים, תאים סגולים שסומנו בלבד, תאים הורים ללא תווית. לאחר שהוסר ממכסה המנוע של הרקמה הסטרילית, לתאים יש את היכולת להידבק, ולכן מזער את זמן החשיפה של דגימות לסביבה לא סטרילית מכאן ואילך. תאים ממוינים במדיום DMEM מלאה.
2. השתמש cytometer מסוגל מיון תא יחיד.
   1. הגדר את סדרן התא עבור מיון אספטי. בצע את בקרת איכות המכשיר לפי המלצת היצרן.
   2. ציירו מגרש של פיזור לפנים לעומת פיזור בצד והעלילה האפליה מספק.
3. ליצור שערים כדי לזהות תאים התמזגו.
   1. לרגש את צבעי פלורסנט באורכי גל של 405 ננומטר ו 635 ננומטר. זיהוי ב 450 ננומטר ו 660 nm (סגול ואורכי גל אדום, בהתאמה). מתווה אדום הרבה לעומת אורכי גל סגול.
   2. הפעל תאים הורים ללא תווית דרך cytometer ולהקליט את עוצמת הקרינה.
      הערה: ערכים מעל תוכנית בסיסית זו מגדירים חיוביות לצביעת צבע.
   3. הפעל בודד שמסומנת בתאים סגולים דרך הציטומטר. ודא כי אין לשפוך-מעל של סגול לתוך הערוץ האדום הרחוק.
   4. הפעל בודד מתויג תאים אדומים רחוק דרך cytometer וודא כי אין לשפוך-מעל של הרבה אדום לתוך הערוץ הסגול.
      הערה: עבור נתוני המייצג המוצג, תאים ממוינים ב 20 psi על סדרן מצויד זרבובית יקרומטר 100.
   5. הפעל בקצרה את דגימת ההיתוך כדי לוודא שהתאים התמזגו גלויים עם השערים שנוצרו בשלב 3.3.
4. יישר את זרם המיון במיקום מרכזי לתוך צלחת הדמיה של 8 היטב.
5. FACS מיון תאים התמזגו, הנוכחי כפול חיובי סגול ותאים המסומנת באדום הרבה ישירות לתוך הצלחת 8-להדמיה המכיל 100 μL של גידול בינוני.
   הערה: מספר התאים המקסימלי המומלץ הוא ~ 50,000 לכל מאכל 8-והכל. ודא שתקינות התא במהלך המיון. שטף התא יכול להשפיע על בריאות התא כך לשמור על תאים בין 20 ל 90% השטף לאחר מיון על ידי מיון מספר מתאים של תאים לצלחת ההדמיה. כל droplet ממוין מכיל כ-3 nL של נוזל נדן. ודא כי נוזל מעטפת אינו מדלל באופן משמעותי את מדיום הצמיחה במהלך מיון.
6. ישירות לאחר מיון, לקחת תאים בחזרה לחממה ולעזוב > 2 h או לילה.
   הערה: תאים חסיד יהיה מחדש בהדרגה לדבוק שמיכות במהלך תקופה זו, מיון ואילך, ומכאן המבנה שלהם ישתנה לאורך זמן אם נלקח ישירות למיקרוסקופ.

4. מכשירי כתמים והדמיה של תא-תא Fusions

הערה: תאים התמזגו יכול להיות התמונה חי או לאחר קיבעון וכתמים פלורסנט נוסף (או שניהם), בהתאם לניסויים ומדידות הנדרשים.

1. הדמיית תאים בשידור חי
   1. החלף בינונית צמיחה עם מדיום הדמיה ללא פנול אדום (לוח חומרים) ולהמשיך ישירות להדמיה.
2. קיבוע וצביעת
   1. הכן טרי 4% פאראפורמלדהיד (בכיוון הבמה) ב-PBS.
   2. תקן את התאים על-ידי דגירה אותם ב-100 μL של 4% כלפי מע עבור 15 דקות ב-RT. הוצא את הכדורגלן לאחר 15 דקות.
      זהירות: הקליולית היא רעילה כאשר היא שאפה כך ששלב זה צריך להתבצע בתוך מכסה עם ציוד הגנה אישי מתאים.
      הערה: לאחר הקיבעון, ניתן להשהות את הניסוי ולהפעיל אותו מחדש במקרה הצורך. אחסן את המדגם ב -4 ° צ' מוגן מפני אור במידת הצורך.
   3. לשטוף את התאים 3x ב 200 μL של PBS ב RT.
   4. תאים הניתנים לחדירות עבור 10 דקות ב-RT ב 200 μL של 0.1% nonionic (טבלת חומרים) ו 0.1% nonionic אבקת (טבלת חומרים) מדולל ב-PBS.
   5. לחסום ב 200 μL של 3% בסרום שור הערוץ ב-PBS עבור 30 דקות ב-RT.
   6. דגירה עם נוגדנים ב-150 μL של PBS המכיל 3% בסרום בקר אלבומין ו 0.1% nonionic סורסטנט ו 0.05% nonionic ניקוי עבור 1 h ב RT.
      הערה: הנוגדנים העיקריים המשמשים כדי לייצר את התוצאות הנציגים הם fluorescently מעלה מעלה אנטי GFP ננוגוף (משמש ב 1:400 דילול), ו fluorescently מעלה מעלה אנטי mScarlet-I ננוגוף (משמש ב 1:500 דילול). אלה לשפר את האות של חלבונים כבר פלורסנט.
   7. לשטוף 2x עבור 5 דקות ב 300 μL של PBS ולאחר מכן לעזוב ב 200 μL של PBS.
      הערה: דגימות מתמונות מתמונות ב-PBS. ניתן לאחסן דגימות ב -4 ° c מוגן מפני אור.
3. רכישת תמונה
   1. לרכוש תמונות עם מיקרוסקופ המתאים לקרינה פלואורסצנטית מסוגל הדמיה ארבעה צבעים (למשל, confocal וקד, שטח, תאורה מובנית).
   2. לרגש meGFP ו mScarlet-I עם 488 ננומטר ו 561 לייזרים באורך גל ננומטר, בהתאמה. הגדר גלאים כדי לזהות ב ~ 505-550 ננומטר ו ~ 590-650 ננומטר. לרגש סגול וצבע אדום הרחוק עם 405 ננומטר ו 633 לייזרים nm, בהתאמה. הגדר גלאים לזיהוי ב-~ 430-500 ננומטר ו-~ 660-750 ננומטר.
   3. באופן אמפירי לקבוע עוצמת לייזר כגון photobleaching לבנה משמעותית לא מתרחשת, כי תאים נשארים בריאים (אם לחיות הדמיה תא).
   4. האופן האמפירי קובע את הרווח כך שהאות מתקבל ללא שיקוף או באופן מלאכותי מסיכה ערכי פיקסלים.
   5. איסוף נתוני מחסנית Z, כגון תמונות הן תלת-ממדיות, כיסוי טווח של 20 עד 60 יקרומטר עם גודל השלב ~ 500 יקרומטר.
      הערה: התמונות המוצגות בנתונים מייצגים נרכשו על ידי קונפוקלית וקד (איור 2B), airyscan (איור 2ג) או מיקרוסקופ תאורה מובנית (איור 2ד). כל תא הוא הטרואוארייון בתום ובכן אם הוא מכיל הן סגול והן צבעים אדומים הרבה חופפים בציטופלסמה.

תוצאות

תאים מסומנים כראוי גלויים במהלך הזרימה cy, לנסות על ידי אות פלואורסצנטית גבוה יותר מאשר בתאי בקרה בלתי מסומן (איור 2א). גייטס מוגדר למיון תאים חיוביים כפולים, העשרת האוכלוסייה הזאת ישירות לתוך מנות הדמיה לניתוח מיקרוסקופי נוסף. תאים התמזגו הם לזיה?...

Discussion

אנו מדגימים נתיישב ופרוטוקול חסכוני עבור תאים פיוזינג ומדמיין את הארכיטקטורה הבאה של תאים היברידיות עם מיקרוסקופ, לוקח בערך יומיים מתחילתו ועד סופו. חלקים קריטיים של פרוטוקול זה הם העשרת התאים המוחלקים על-ידי מיון התאים (מקטע פרוטוקול 3) ואימות קפדני של תאים מוחלקים באמצעות מיקרוסקופ (פרו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 ml tube	Sarstedt	62554502
37% formaldehyde solution	Sigma-Aldrich	F8875
880 Laser Scanning Confocal Airyscan Microscope	Carl Zeiss
8-well imaging dishes	Ibidi	80826
Anti-GFP alpaca GFP booster nanobody	Chromotek	gba-488
BD Influx Cell Sorter	BD Biosciences
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Cell Filters (70um)	Biofil	CSS010070
CellTrace Far Red	ThermoFisher Scientific	C34572
CellTrace Violet	ThermoFisher Scientific	C34571
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate	ThermoFisher Scientific	31966021
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	10270-106
FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobody	NanoTag Biotechnologies	N1302-At565
L15 CO2 independent imaging medium	Sigma-Aldrich	21083027
Penicillin/streptomycin	Sigma-Aldrich	15140122
Phenol red free DMEM, high glucose	ThermoFisher Scientific	21063029
Phosphate buffered saline (1 x PBS)			8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2HPO4, dH2O up to 1L
Polyethylene Glycol Hybri-Max 1450	Sigma-Aldrich	P7181
Polypropylene tubes	BD Falcon	352063
Triton X-100	Fisher BioReagents	BP151	nonionic surfactant
Trypsin	Sigma-Aldrich	T4049
Tween 20	Fisher BioReagents	BP337	nonionic detergent