세포 구조 및 기능의 교란을 위해 게놈 편집 된 세포주 세포주 간의 세포 융합

요약

이 프로토콜의 목적은 하이브리드 셀을 만들기 위해 두 개의 서로 다른 세포 유형을 융합하는 것입니다. 융합 된 세포의 형광 현미경 분석은 세포 소기관의 기원의 세포를 추적하는 데 사용됩니다. 이 분석은 세포 구조와 기능이 세포 융합에 의한 교란에 어떻게 반응하는지 탐구하는 데 사용될 수 있습니다.

초록

생활은 세포와 세포기관 내부의 뚜렷한 분자 상태의 분리된 형성을 허용하기 위하여 지질 막 내의 공간적으로 분할됩니다. 세포 융합은 단일 세포를 형성하기 위해 2개 이상의 세포를 합병하는 것이다. 여기에서 우리는 2개의 다른 세포 모형의 세포 융합을 위한 프로토콜을 제공합니다. 융합된 하이브리드 세포는 유세포분석 기반 선별에 의해 농축되고, 하이브리드 세포 구조 및 기능의 형광 현미경 검사법에 이어 풍부하다. 게놈 편집에 의해 생성된 형광 태그가 붙은 단백질은 융합된 세포 안쪽에 심상하게, 세포 구조물이 형광 방출에 근거를 둔 확인되고 기원의 세포 모형에 다시 참조되는 것을 허용합니다. 이 강력하고 일반적인 방법은 기본적인 생물학 질문의 범위에 걸쳐 세포 구조 및 기능을 이해하기 위하여 관심있는 다른 세포 모형 또는 세포기관에 적용될 수 있습니다.

서문

세포 구조의 적시성 유지는 삶에 매우 중요합니다. 세포에는 특징적인 형태, 세포 소기관 수 및 내부 생화학 적 조성이 있습니다. 이러한 근본적인 특성이 어떻게 생성되는지, 그리고 질병 중에 어떻게 엉망이 되는지 이해하려면 실험실 도구가 필요합니다.

세포 융합은 2개 이상의 분리된 세포의 병합이다. 세포 융합은 진핵 생명의 출현에 중요했을 수 있습니다^1. 인체에서 세포 융합은 비교적 드물며, 수정 또는 근육, 뼈 및 태반의 형성과 같은 제한된 발달 상황 및 조직 유형 동안 발생한다^2. 이 프로토콜은 세포 구조 및 기능을 제어하는 메커니즘을 이해하는 도구로 서, 분별적으로 표지 된 세포기관과 조직 배양 세포 주에서 세포 융합의 유도를 설명합니다.

시험관내 유도 세포-세포 융합은 생물학적 연구 및 질병 치료를 위한 중요한 도구인 단일클론 항체^3의생산의 중심이다. 세포 융합은 또한 세포 주기 우호에 관하여 많은 다른 근본적인 세포 생물학 질문을 하기 위하여 이용되었습니다^4,aneuploidy^5,6,세포 재프로그래밍^7,8,손상된 신경의 수선^9,바이러스성 증식^10,세포증^11,종양발생^12,세포골격역학^13,및 막 융합^14,15. 세포-세포 융합을 유도하는 실험실 기반 방법^{16,17,18,19는} 두 개의 이중층의 물리적 병합을 통해 지질막 유착을 유도한다. 세포 융합은 전기^18,바이러스 기반 방법^17,열플라스모닉 가열^20,트랜스젠 발현^19,폴리에틸렌 글리콜(PEG)^16,21,22에의해 유도될 수 있다.

중원체는 세포 모양, 운동성, 편광 및 분열^23을제어하는 미세소관 조직 센터입니다. 중심도 뿌리는 단백질^{뿌리줄기(24)를} 함유하는 중심으로부터 연장되는 섬유질 구조이다(유전자 CROCC에의해 인코딩). 우리는 최근에 세포 세포 융합을 사용하여 부모 세포^24에비해 중도위치및 수가 이종내의 다른 지 를 이해했습니다. 이 방법의 사용 뒤에 근거는 차별적으로 형광 태그 부모 세포의 융합 후 이종 내 뿌리의 기원의 세포를 추적하고, 따라서 이미지 세포 간 융합 및 핵분열이다. 형광 태그단백질 뿌리레틴-meGFP 또는 rootletin-mScarlet-I는 PEG 매개 세포 융합에 의해 융합되는 별도의 세포주에서 게놈 편집에 의해 생성됩니다. 우리는 유세포분석및 유래세포의 후속 형광 현미경 식별에 의한 융합세포를 식별하기 위해 세포염료(자료표)의사용을 설명한다(그림1). 이 접근은 세포 기관 번호를 포함하여 세포 상태에 있는 중요한 변경이 세포 항상성에 어떻게 영향을 미치는지 연구하는 강력하고 유일한 방법입니다.

프로토콜

1. 차등 형광 세포 라벨링

1. CRISPR Cas9로 유전자 태그 지정
   1. CRISPR Cas9 게놈 편집을 사용하여 인간 암 세포주에서 형광 단백질 meGFP 또는 mScarlet-I와 함께 뿌리 줄기 (또는 관심 있는 다른 유전자)를 태그합니다.
      참고: 게놈 편집을 위한 상세한 프로토콜은 다른 곳에서^24,25,26을다룹니다.
2. 형광 염료 라벨링
   1. Dulbecco의 수정된 독수리 배지(DMEM)에서 Cal51 인간 암 세포를 10% 태아 소 혈청(FBS), L-글루타민 및 100 μg/mL 페니실린/스트렙토마이신을 가습된 인큐베이터에서 37°C및 5%_CO2로 성장시다.
      참고: 세포가 mycoplasma 오염의 부재, 그리고 세포주의 정체성에 대해 정기적으로 검사되도록하는 것이 중요합니다. 배양에서 광범위하게 통과된 세포를 사용하지 마십시오(>15 구절). 세포는 건강하고 기하급수적으로 성장해야합니다. 과소 합류 또는 과잉 합류를 피하십시오.
   2. 종자 각 세포 유형 (뿌리 -meGFP, 뿌리 - mScarlet-I 및 부모의 태그되지 않은 Cal51 세포) ~ 6 x 10⁶ 세포가 70-90 %의 합류에서 각 샘플에 대해 다음날 존재하도록합니다.
      참고: 이것은 대략 1개의 T75 조직 배양 플라스크 또는 세포 모형 당 10 cm 접시입니다. 어버이날 태그가 지정되지 않은 셀은 프로토콜의 나중에 부정적인 제어로 필요합니다. 이 프로토콜은 ~ 20,000 개의 융합 된 셀을 생산 할 수 있지만 배치 수가 증가하여 프로토콜을 확장하여이 수를 늘릴 수 있습니다.
   3. 다음날, 37°C에서 수조에 배치하여 DMEM, 트립신 및 1x 인산완충식염수(PBS)를 미리 따뜻하게 한다.
   4. 피루레틴-meGFP 및 루틀레틴-mScarlet-I 세포를 PBS에서 2배 씻어 내거나 매질을 흡인하고 10 mL의 PBS로 교체합니다.
   5. 라벨 Cal51 루레틴-meGFP 세포를 실온(RT)에서 1분 동안 PBS에 500 nM 바이올렛 세포 염료(재료표)를첨가하였다.
   6. 라벨 Cal51 루틀레틴-mScarlet-I 세포를 RT에서 1분 동안 PBS에 200 nM 원거리 적혈구염료(물자 표)를첨가하였다.
      참고: 형광 염색 후 가능한 한 빛으로부터 시료를 차폐하여 형광표백을 방지하십시오.
   7. 5 분 동안 10 mL의 DMEM을 추가하여 염료 라벨링 반응을 중지하십시오.
   8. 인큐베이터에서 라벨이 부착되지 않은 보호자 Cal51 세포를 제거합니다(1.2.2단계).
      참고: 이러한 셀은 나중에 레이블이 지정되지 않은 음성 대조군으로 사용됩니다(단계 3.3.2).
   9. 성장 배지를 붓고 PBS 10 mL로 교체하여 모든 세포를 한 번 씻어 내보시고.
   10. 미리 데운 1x 트립신 1 mL로 배양 조건에서 PBS를 붓고 배양 조건에서 5 분 동안 배양하십시오.
   11. 세포를 15 mL 플라스틱 원점 튜브와 원심분리기로 1000 x g에서 5 분 동안 옮긴다.
   12. 조심스럽게 제거하고 파이펫세포 펠릿에서 트립신을 폐기.
   13. PBS의 1 mL에 보라색과 멀리 빨간 표지 된 세포 펠릿을 부드럽게 다시 일시 중단하십시오.
   14. DMEM 의 1 mL에서 부모 (비 형광) 세포 펠릿을 부드럽게 다시 중단하고 인큐베이터로 돌아갑니다.
       참고: 이 견본은 세포 세포 융합을 겪지 않을 것입니다 그러나 유세포 분석 도중 나중에 이용될 것입니다.

2. 세포 세포 융합

1. ^1mL 파이펫을 사용하여 각 세포 유형의 0.5 mL을 부드럽게 파이펫팅하여 3 x 10 6 10⁶ 원거리 적색 라벨셀을 15 mL 튜브에 혼합합니다.
2. 1,000 x g에서 5 분 동안 2.1 단계에서 나머지 혼합되지 않은 세포를 원심 분리한 다음 PBS를 부어 DMEM의 1 mL에서 펠릿을 다시 중단하고 인큐베이터로 돌아갑니다.
   참고: 이러한 나머지 혼합되지 않은 단일 라벨 샘플은 나중에 프로토콜의 섹션 3에서 음수 및 보정 제어로 사용됩니다.
3. 혼합 세포를 1,000 x g에서 1,000 x g에서 5분 동안 원심분리하고 1 mL 파이펫을 사용하여 PBS를 조심스럽게 흡인한다.
4. 0.7 mL의 50% 1450 PEG 용액을 30s의 기간에 걸쳐 1 mL 파이펫을 사용하여 세포 펠릿(단계 2.3)에 드롭와이즈 방식으로 첨가한다.
5. RT에서 3.5 분 동안 둡니다.
   참고: PEG를 가진 배양 시간은 세포 모형에 따라서, 더 긴 배양 시간이 세포 독성을 증가한다는 것을 주의하더라도, 최적화될 수 있습니다.
6. 30s에 대해 10 mL의 무혈청 DMEM을 넣고 10 분 동안 인큐베이터에 둡니다.
7. 1,000 x g에서 5분 동안 스핀다운하고, 상급물질을 버리고, 1mL의 완전한 매체(FBS를 함유한 DMEM)에서 부드럽게 다시 돌립니다.
   참고: 섹션 3으로 바로 이동합니다. PEG 노출과 관련된 독성이 있고 유세포 분석 및 이미징이 뒤따르므로 단계 간에 빠르게 진행하여 배양 조건에서 세포를 가능한 한 많이 유지하십시오.

3. 융합 세포를 풍부하게하는 형광 활성화 세포 선별 (FACS)

1. 70 μm 필터를 통해 각 샘플을 FACS 튜브에 개별적으로 부드럽게 피펫팅하여 유세포 측정을 위해 모든 세포를 준비합니다.
   참고: 4개의 견본은 요구됩니다: 융합한 세포, 단 하나 표지된 멀리 적혈구, 단 하나 표지된 보라색 세포, 표지되지 않은 부모 세포. 일단 멸균 조직 배양 후드에서 제거되면, 세포는 감염될 수 있는 능력을 가지므로, 여기에서부터 비멸균 환경에 대한 시료의 노출 시간을 최소화한다. 셀은 완전한 DMEM 배지로 정렬됩니다.
2. 단일 셀 선별이 가능한 세포계를 사용합니다.
   1. 무균 정렬을 위해 셀 선별기를 설정합니다. 제조업체의 권장 사항에 따라 기기 품질 관리를 수행합니다.
   2. 전방 분산 과 측면 분산 및 이중 분산 플롯의 플롯을 그립니다.
3. 융합 된 셀을 식별하기 위해 게이트를 만듭니다.
   1. 405 nm 및 635 nm의 파장에서 형광 염료를 흥분시킵니다. 450 nm 및 660 nm (보라색 및 원적 파장)에서 각각 감지합니다. 보라색 파장 대 멀리 빨간색을 플롯합니다.
   2. 세포계를 통해 레이블이 지정되지 않은 부모 세포를 실행하고 형광 강도를 기록합니다.
      참고: 이 기준선 위의 값은 염료 염색에 대한 양성을 정의합니다.
   3. 세포계를 통해 단일 라벨 이표시된 보라색 세포를 실행합니다. 멀리 빨간 채널에 보라색이 흘러 넘치지 않는지 확인합니다.
   4. 세포계를 통해 단일 라벨 멀리 적혈구를 실행하고 보라색 채널에 멀리 빨간색의 유출이 없는지 확인합니다.
      참고: 도시된 대표적인 데이터의 경우, 세포는 100 μm 노즐이 장착된 선별기에서 20psi로 분류하였다.
   5. 융합 샘플을 간략하게 실행하여 융합 된 세포가 3.3 단계에서 생성 된 게이트와 함께 보이는지 확인하십시오.
4. 선별 스트림을 중앙에서 8웰 이미징 접시에 맞춥습니다.
5. FACS는 이중 양성 보라색으로 존재하는 융합 세포를 분류하고, 성장 배지의 100 μL을 포함하는 8 웰 이미징 접시에 직접 적색 라벨이 붙은 세포를 분류합니다.
   참고: 세포의 최대 권장 수는 8 웰 접시 당 ~ 50,000입니다. 분류 하는 동안 세포 상태를 확인 합니다. 세포 융합은 세포 건강에 영향을 미칠 수 있으므로 이미징 접시에 대한 적절한 수의 세포를 분류하여 20-90 % 컨플루언스 사후 분류 사이에 세포를 유지합니다. 각 정렬 된 물방울에는 약 3 nL의 칼집 유체가 들어 있습니다. 선별 중에 칼집 유체가 성장 매체를 크게 희석시키지 않도록 하십시오.
6. 직접 선별 한 후 세포를 인큐베이터로 다시 가져 와서 >2 시간 또는 하룻밤 동안 둡니다.
   참고: 부착 세포는 점차적으로 이 기간 도중 표지슬립에 다시 부착할 것이고, 따라서 그들의 형태는 현미경에 직접 취해지면 시간이 지남에 따라 변화할 것입니다.

4. 세포 융합의 면역 형광 염색 및 이미징

참고: 융합 된 세포는 필요한 실험 및 측정에 따라 라이브 또는 고정 후 추가 형광 염색 (또는 둘 다)을 이미지 화 할 수 있습니다.

1. 라이브 셀 이미징
   1. 성장 배지를 페놀적색(재료표)이없는 이미징 배지로 교체하고 이미징으로 직접 진행합니다.
2. 고정 및 얼룩
   1. PBS에서 신선한 4% 파라포름알데히드(PFA)를 준비합니다.
   2. RT에서 15 분 동안 4 % PFA의 100 μL에서 세포를 배양하여 세포를 고정시고 15 분 후에 PFA를 제거하십시오.
      주의 사항: PFA는 흡입시 독성이 있으므로 이 단계는 적절한 개인 보호 장비가있는 연기 후드에서 수행되어야합니다.
      참고: 고정 후 실험을 일시 중지하고 필요한 경우 나중에 다시 시작할 수 있습니다. 필요한 경우 빛을 로부터 보호 된 4 °C에서 샘플을 저장합니다.
   3. RT에서 PBS의 200 μL에서 세포를 3 배 세척하십시오.
   4. RT에서 10분 동안 투과세포를 0.1% nonionic 계면활성제(재료표)와 0.1% 난오성 세제(재료표)로 희석하였다.
   5. RT에서 30 분 동안 PBS에서 3 % 소 혈청 알부민의 200 μL에서 차단하십시오.
   6. 3% 소 혈청 알부민 및 0.1% 난오계면활성제 및 0.05% 난오성 세제를 함유하는 PBS의 150 μL에서 항체와 배양RT에서 1시간 동안 배양하였다.
      참고: 대표적인 결과를 생성하는 데 사용되는 1차 항체는 형광공반-GFP 나노노(1:400 희석에서 사용됨)와 형광공태 반-mScarlet-I 나노노(1:500 희석에서 사용됨)이다. 이들은 이미 형광 성 단백질의 신호를 향상시킵니다.
   7. PBS 300 μL에서 5분 동안 2x를 씻은 다음 200 μL의 PBS에 둡니다.
      참고: 샘플은 PBS로 이미지화됩니다. 시료는 빛으로부터 보호된 4°C에서 보관할 수 있습니다.
3. 이미지 수집
   1. 4색 이미징이 가능한 적절한 형광 현미경으로 이미지를 획득합니다(예: 공초점, 광시야, 구조화 조명).
   2. meGFP 및 mScarlet-I 채널을 각각 488 nm 및 561 nm 파장 레이저로 자극합니다. 검출기를 ~505−550 nm 및 ~590−650 nm에서 감지하도록 설정합니다. 각각 405 nm 및 633 nm 레이저로 보라색 및 원거리 적색 염료 채널을 자극합니다. 검출기를 ~430−500 nm 및 ~660−750 nm에서 감지하도록 설정합니다.
   3. 경험적으로 중요한 광 표백이 발생하지 않고 세포가 건강하게 유지되도록 레이저 강도를 결정합니다 (살아있는 세포 이미징의 경우).
   4. 픽셀 값을 포화하거나 인위적으로 클리핑하지 않고 신호가 얻어지는지 여부에 따라 경험적으로 게인을 결정합니다.
   5. ~500 μm 스텝 크기와 20-60 μm의 범위를 포함하는 이미지가 3차원이되도록 Z 스택 데이터를 수집합니다.
      참고: 대표적인 자료에 나타난 이미지는 공초점(도2B),Airyscan(도2C)또는 구조화 조명 현미경(도2D)에의해 획득되었다. 각 세포는 세포질에 겹치는 보라색과 멀리 빨간 염료를 모두 포함하는 경우에 선의의 이종입니다.

결과

적절하게 표지된 세포는 표지되지 않은 대조군 세포보다 더 높은 형광 신호에 의해 유세포분석 중에 볼 수있다(도 2A). 게이츠는 이중 양성 세포의 선별을 위해 설정되어 있으며, 이 집단을 이미징 접시에 직접 풍부하게 하여 추가적인 현미경 분석을 제공합니다. 융합된 세포는 뚜렷한 이중 형광 양성 세포로서 검출가능하며 인구의 약 ~1%...

토론

우리는 세포를 융합하고 현미경 검사법으로 세포 하이브리드의 후속 아키텍처를 시각화하기 위한 효과적이고 비용 효율적인 프로토콜을 시연하며, 처음부터 끝까지 약 2일이 소요됩니다. 이 프로토콜의 중요한 부분은 세포 선별 (프로토콜 섹션 3)에 의한 융합 세포의 농축 및 현미경 검사법에 의한 융합 세포의 신중한 검증 (프로토콜 섹션 4)입니다. 이 단면도는 융합한 세포가 쉽게 장악되고 선의...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 ml tube	Sarstedt	62554502
37% formaldehyde solution	Sigma-Aldrich	F8875
880 Laser Scanning Confocal Airyscan Microscope	Carl Zeiss
8-well imaging dishes	Ibidi	80826
Anti-GFP alpaca GFP booster nanobody	Chromotek	gba-488
BD Influx Cell Sorter	BD Biosciences
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Cell Filters (70um)	Biofil	CSS010070
CellTrace Far Red	ThermoFisher Scientific	C34572
CellTrace Violet	ThermoFisher Scientific	C34571
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate	ThermoFisher Scientific	31966021
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	10270-106
FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobody	NanoTag Biotechnologies	N1302-At565
L15 CO2 independent imaging medium	Sigma-Aldrich	21083027
Penicillin/streptomycin	Sigma-Aldrich	15140122
Phenol red free DMEM, high glucose	ThermoFisher Scientific	21063029
Phosphate buffered saline (1 x PBS)			8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2HPO4, dH2O up to 1L
Polyethylene Glycol Hybri-Max 1450	Sigma-Aldrich	P7181
Polypropylene tubes	BD Falcon	352063
Triton X-100	Fisher BioReagents	BP151	nonionic surfactant
Trypsin	Sigma-Aldrich	T4049
Tween 20	Fisher BioReagents	BP337	nonionic detergent