Fusione cellulare di linee cellulari modificate per la perturbazione della struttura cellulare e della funzione

Riepilogo

Lo scopo di questo protocollo è quello di fondere due diversi tipi di cellule per creare cellule ibride. L'analisi della microscopia a fluorescenza delle cellule fuse viene utilizzata per tracciare la cellula di origine degli organelli cellulari. Questo saggio può essere usato per esplorare come la struttura cellulare e la funzione rispondono alla perturbazione con la fusione cellulare.

Abstract

La vita è suddivisa spazialmente all'interno di membrane lipidiche per consentire la formazione isolata di stati molecolari distinti all'interno di cellule e organelli. La fusione cellulare è la fusione di due o più cellule per formare una singola cellula. Qui forniamo un protocollo per la fusione cellulare di due diversi tipi di cellule. Le cellule ibride fuse sono arricchite da uno smistamento a base di citometria di flusso, seguito dalla microscopia a fluorescenza della struttura e funzione delle cellule ibride. Le proteine fluorescenti etichettate generate dall'editing del genoma sono immagini all'interno delle cellule fuse, consentendo di identificare le strutture cellulari in base all'emissione di fluorescenza e di tornare al tipo di origine della cellula. Questo metodo robusto e generale può essere applicato a diversi tipi di cellule o organelli di interesse, per comprendere la struttura cellulare e la funzione in una serie di domande biologiche fondamentali.

Introduzione

La manutenzione omeostatica della struttura cellulare è fondamentale per la vita. Le cellule hanno morfologie caratteristiche, numeri di orgelli subcellulari e composizione biochimica interna. Comprendere come vengono generate queste proprietà fondamentali e come vanno in stato di sfago durante la malattia richiede strumenti di laboratorio per perturbarli.

La fusione cellulare è la fusione di due o più celle separate. La fusione cellulare potrebbe essere stata fondamentale per l'emergere della vita eucarica¹. Nel corpo umano, la fusione cellulare è relativamente rara, che si verifica durante circostanze di sviluppo e tipi di tessuto limitati, come durante la fecondazione o la formazione di muscoli, ossa e placenta². Questo protocollo descrive l'induzione della fusione cellulare-cellula nelle linee cellulari di coltura dei tessuti con organelli etichettati in modo differenziale fluorescente, come strumento per comprendere i meccanismi che controllano la struttura e la funzione delle cellule.

La fusione cellulare-cellula indotta in vitro è fondamentale per la produzione di anticorpi monoclonali^3,uno strumento importante per la ricerca biologica e il trattamento delle malattie. La fusione cellulare è stata utilizzata anche per porre molte diverse domande biologiche fondamentali delle cellule sulla dominanza del ciclo cellulare⁴, aneeuploidy^5,6, riprogrammazione cellulare^7,8, riparazione dei neuroni danneggiati⁹, proliferazione virale¹⁰, apoptosi¹¹, tumorigenesi¹², dinamiche citoscheletriche¹³e fusione della membrana^14,15. Metodi basati su laboratorio per indurre la fusione cellulare-cellula^16,17,18,19 indurre coalescenza della membrana lipidica attraverso la fusione fisica di due bistrati in uno. La fusione cellulare può essere indotta dall'elettricità¹⁸, dai metodi a base virale¹⁷, dal riscaldamento termoplascio^20,dall'espressione transgenica¹⁹e da sostanze chimiche tra cui il glicole di polietilene (PEG)^16,21,22.

I centrosori sono centri di organizzazione dei microtubuli che controllano la forma cellulare, la motilità, la polarizzazione e la divisione²³. Le radici centrosomiche sono strutture fibrose che si estendono dai centrosomi contenenti la radice della proteina²⁴ (codificata dal gene CROCC). Recentemente abbiamo usato la fusione cellulare-cellula per capire come la posizione e il numero del centrosome varialli all'interno degli etokaryon rispetto alle cellule parentali²⁴. La logica alla base dell'uso di questo metodo è quella di tracciare la cellula di origine delle radici all'interno di un eterokaryon dopo la fusione di cellule parentali marcate in modo differenziale fluorescente, e quindi per immagini di fusione e fissione dell'organello. Le proteine fluorescenti etichettate rootletin-meGFP o rootletin-mScarlet-I sono create dall'editing del genoma in linee cellulari separate che vengono poi fuse dalla fusione cellulare mediata da PEG. Descriviamo l'uso di coloranti cellulari (Tabella dei materiali) per identificare le cellule fuse per citometria di flusso e successiva identificazione della microscopia a fluorescenza della cellula centrosoria di origine e morfologia ( Figura1). Questo approccio è un metodo robusto e unico per studiare come i grandi cambiamenti nello stato cellulare, tra cui il numero di organelle, incidono sull'omeostasi cellulare.

Protocollo

1. Etichettatura differenziale delle cellule fluorescenti

1. Tagging genico con CRISPR Cas9
   1. Utilizzare l'editing del genoma di CRISPR Cas9 per taggare la radiceletina (o altri geni di interesse) con le proteine fluorescenti meGFP o mScarlet-I nelle linee cellulari del cancro umano.
      NOT: I protocolli dettagliati per l'editing del genoma sono coperti altrove^24,25,26.
2. Etichettatura dei dinescenti fluorescente
   1. Crescere le cellule tumorali dell'aquila (DMEM) modificate da Dulbecco e 100 penicillina di Dulbecco a 37 gradi centigradi e il 5% di CO₂ in un'incubatrice umidificata.
      NOT: È importante assicurarsi che le cellule siano regolarmente controllate per l'assenza di contaminazione da micoplasma e per l'identità della linea cellulare. Non utilizzare cellule che sono state ampiamente passate nella coltura (>15 passaggi). Le cellule devono essere sane e in crescita esponenziale. Evitare la sottoconfluenza o l'esordibilità.
   2. Seme ogni tipo di cella (rootletin-meGFP, rootletin-mScarlet-I e cellule Cal51 senza tag parentali) in modo tale che 6 x 10⁶ celle sono presenti il giorno successivo per ogni campione, con una confluenza di 70-90%.
      NOT: Si tratta di circa un pallone di coltura tissutale T75 o un piatto di 10 cm per tipo di cellula. Le celle senza tag dei genitori sono necessarie come controllo negativo più avanti nel protocollo. Questo protocollo consente la produzione di celle fuse da 20.000 dollari, ma questo numero potrebbe essere aumentato aumentando aumentando il protocollo con un numero maggiore di batch.
   3. Il giorno successivo, preriscaldare DMEM, trypsin e 1x salina con buffer di fosfato (PBS) mettendole in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi.
   4. Lavare le celle rootletin-meGFP e rootletin-mScarlet-I 2x in PBS versando o aspirando al di fuori del mezzo e sostituendo con 10 mL di PBS.
   5. Etichettare le celle cal51 rootletin-meGFP aggiungendo 500 nM di colorante violetto (Tabella dei materiali) in PBS per 1 min a temperatura ambiente (RT).
   6. Etichettare le celle Cal51 rootletin-mScarlet-I aggiungendo 200 nM di colorante per celle rosse (Tabella dei materiali) in PBS per 1 min in RT.
      NOT: Conservare i campioni schermati dalla luce, ove possibile dopo una colorazione fluorescente, per evitare il fotosbiancamento della fluorescenza.
   7. Interrompere le reazioni di etichettatura del colore aggiungendo 10 mL di DMEM per 5 min.
   8. Rimuovere le cellule Cal51 parentali non etichettate dall'incubatrice (dal punto 1.2.2).
      NOT: Queste celle verranno utilizzate in un secondo momento come controlli negativi senza etichetta (passaggio 3.3.2).
   9. Lavare tutte le cellule una volta versando il mezzo di crescita e sostituendo con 10 mL di PBS.
   10. Versare PBS e incubare per 5 min in condizioni di coltura con 1 mL di 1x trypsin preriscaldato.
   11. Trasferire le cellule in un tubo conico in plastica da 15 ml e centrifugare a 1000 x g per 5 min.
   12. Rimuovere e scartare con attenzione la trypsin dal pellet cellulare con una pipetta.
   13. Risospendere delicatamente i pellet cellulari viola e molto rosso etichettati in 1 mL di PBS.
   14. Risospendere delicatamente il pellet cellulare parentale (non fluorescente) in 1 mL di DMEM e tornare all'incubatrice.
       NOT: Questo esempio non verrà sottoposto a fusione cellulare-cellula, ma verrà utilizzato in un secondo momento durante la citometria di flusso.

2. Fusione cellulare

1. Mescolare 3 x 10⁶ cellule viola etichettate con 3 x 10⁶ celle etichettate di gran lunga rosse in un tubo da 15 mL pipettando delicatamente insieme 0,5 mL di ogni tipo di cellula utilizzando una pipetta da 1 mL.
2. Centrifugare le cellule non miscelate rimanenti dal passo 2,1 a 1.000 x g per 5 minuti, quindi versare PBS, rimettere in sospensione il pellet in 1 mL di DMEM e tornare all'incubatrice.
   NOT: Questi campioni a marchio singolo rimanenti non miscelati saranno utilizzati in seguito come controlli negativi e di compensazione nella sezione 3 del protocollo.
3. Centrifugare le cellule miste da passo 2.1 a 1.000 x g per 5 min e aspirare con attenzione PBS utilizzando una pipetta da 1 mL.
4. Aggiungere al pellet cellulare (passaggio 2.3) una pipetta da 1 mL per un periodo di 30 s.
5. Lasciare agire per 3,5 min al RT.
   NOT: Il tempo di incubazione con PEG può essere ottimizzato a seconda del tipo di cellula, anche se si noti che il tempo di incubazione più lungo aumenta la tossicità cellulare.
6. Aggiungere 10 mL di dMEM senza siero gocciolante per 30 s e lasciare in incubatrice per 10 min.
7. Girare verso il basso a 1.000 x g per 5 min, scartare supernatante, e respendere delicatamente in 1 mL di mezzo completo (DMEM contenente FBS).
   NOT: Procedere direttamente alla sezione 3. C'è tossicità associata all'esposizione al PIO seguita da citometria di flusso e imaging, in modo da mantenere le cellule in condizioni di coltura il più possibile procedendo rapidamente tra una differenza di passo.

3. Ordinamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) per arricchire le celle fuse

1. Preparare tutte le cellule per la citometria di flusso pipettando delicatamente ogni campione separatamente attraverso un filtro di 70 m in un tubo FACS.
   NOT: Sono necessari quattro campioni: cellule fuse, singoli globuli rossi etichettati, cellule viola con etichetta singola, cellule parentali senza etichetta. Una volta rimosse dal cofano di coltura dei tessuti sterili, le cellule hanno la capacità di infettarsi, quindi riduci al minimo il tempo di esposizione dei campioni in un ambiente non sterile da qui in poi. Le celle sono ordinate in un supporto DMEM completo.
2. Utilizzare un citometro in grado di eseguire lo smistamento di una singola cella.
   1. Impostare l'ordinamento cellulare per un ordinamento asettico. Eseguire il controllo di qualità dello strumento come base alla raccomandazione del produttore.
   2. Disegnare un grafico tra dispersione in avanti e dispersione laterale e un grafico di discriminazione del doppietto.
3. Creare porte per identificare le celle fuse.
   1. Eccitare i coloranti fluorescenti a lunghezze d'onda di 405 nm e 635 nm. Rileva a 450 nm e 660 nm (rispettivamente lunghezze d'onda viola e farrossa). Traccia lunghezze d'onda di gran lunga rosse contro viola.
   2. Eseguire le cellule parentali non etichettate attraverso il citometro e registrare l'intensità di fluorescenza.
      NOT: I valori al di sopra di questa linea di base definiscono la positività per la colorazione.
   3. Eseguire singole cellule viola etichettate attraverso il citometro. Confermate che non vi è alcun a comparsa di viola nel canale molto rosso.
   4. Eseguire singole celle di gran lunga rosse etichettate attraverso il citometro e confermare che non vi è alcun versamento di molto rosso nel canale viola.
      NOT: Per i dati rappresentativi mostrati, le celle sono state ordinate a 20 psi su una selezionatrice dotata di un ugello di 100 m.
   5. Eseguire brevemente il campione di fusione per verificare che le cellule fuse siano visibili con i cancelli creati nel passaggio 3.3.
4. Allineare il flusso di smistamento centralmente in un piatto di imaging a 8 bennottari.
5. Le cellule fuse di smistamento FACS, presenti come cellule etichettate come viola doppio positivo e rosso lontano direttamente in un piatto di imaging a 8 pozze contenenti 100 l di mezzo di crescita.
   NOT: Il numero massimo consigliato di cellule è di 50.000 dollari per piatto di 8 pozzetti. Garantire l'integrità delle celle durante l'ordinamento. La confluenza cellulare può influenzare la salute delle cellule, quindi mantenere le cellule tra il 20-90% di confluenza post-ordinamento ordinando un numero appropriato di cellule per il piatto di imaging. Ogni goccia ordinata contiene circa 3 nL di liquido di neath. Assicurarsi che il fluido di guaina non diluisce in modo significativo il mezzo di crescita durante lo smistamento.
6. Direttamente dopo lo smistamento, riportare le cellule nell'incubatrice e lasciare per >2 h o durante la notte.
   NOT: Le cellule aderenti aderiscono gradualmente al coperchio durante questo periodo, dallo smistamento in poi, e quindi la loro morfologia cambierà nel tempo se presa direttamente al microscopio.

4. Colorazione immunofluorescente e imaging di fusioni a celle cellulari

NOT: Le cellule fuse possono essere immagini vive o dopo la fissazione e un'ulteriore colorazione fluorescente (o entrambe), a seconda degli esperimenti e delle misurazioni necessarie.

1. Imaging a celle vive
   1. Sostituire il mezzo di crescita con un mezzo di imaging senza fenolo rosso (Tabella dei materiali)e procedere direttamente all'imaging.
2. Fissaggio e colorazione
   1. Preparare fresco 4% paraformaldeide (PFA) in PBS.
   2. Fissare le cellule incubandole in 100 :L di 4% PFA per 15 min a RT. Rimuovere PFA dopo 15 min.
      ATTENZIONE: Il PFA è tossico quando viene inalato, quindi questo passaggio deve essere eseguito in una cappa di fumi con attrezzature protettive personali appropriate.
      NOT: Dopo la correzione, l'esperimento può essere sospeso e riavviato in un secondo momento, se necessario. Se necessario, conservare il campione a 4 gradi centigradi, protetto dalla luce.
   3. Lavare le cellule 3x in 200 - L di PBS a RT.
   4. Permeabilizzare le cellule per 10 min a RT in 200 , luna dello 0,1% di surfactant nonionico (Tabella dei materiali) e dello 0,1% di detersivo nonionico ( Tabella deimateriali) diluito in PBS.
   5. Bloccare in 200 - L di 3% di siero bovino albumina in PBS per 30 min a RT.
   6. Incubare con anticorpi in 150 gradi L di PBS contenente il 3% di albumina del siero bovino e lo 0,1% di surfactant nonionico e lo 0,05% del detergente nonionico per 1 h a RT.
      NOT: Gli anticorpi primari utilizzati per generare i risultati rappresentativi sono l'anti-GFP nanobody coniugato fluorescentmente (utilizzato a 1:400 di diluizione), e l'anti-mScarlet-I nanobody (utilizzato a 1:500 diluizione). Questi migliorano il segnale delle proteine già fluorescenti.
   7. Lavare 2x per 5 min in 300 - L di PBS e poi lasciare in 200 -L di PBS.
      NOT: I campioni sono immagini in PBS. I campioni possono essere conservati a 4 gradi centigradi protetti dalla luce.
3. Acquisizione di immagini
   1. Acquisire immagini con un microscopio a fluorescenza appropriato in grado di imaging a quattro colori (ad esempio, confocale, widefield, illuminazione strutturata).
   2. Eccitare i canali meGFP e mScarlet-I con 488 nm e 561 nm laser a lunghezze d'onda, rispettivamente. Impostare i rivelatori in modo che rilevino i 505,550 nm e 590-650 nm. Emoziono canali di tinture viola e molto rosso con laser da 405 nm e 633 nm, rispettivamente. Impostare i rilevatori in modo che rilevino i 430,500 nm e i 660-750 nm.
   3. Empiricamente determinano l'intensità del laser in modo tale che non si verifichi il fotobleaching significativo e che le cellule rimangano sane (se l'imaging delle cellule vive).
   4. Empiricamente determinare guadagno tale che il segnale si ottiene senza saturare o ritagliare artificialmente i valori dei pixel.
   5. Raccogliere i dati dello stack z, in modo che le immagini siano tridimensionali, coprendo un intervallo di 20-60 m con dimensioni del passo di 500 m.
      NOT: Le immagini mostrate nei dati rappresentativi sono state acquisite da confocal (Figura 2B), Airyscan (Figura 2C) o microscopia ad illuminazione strutturata (Figura 2D). Ogni cellula è un eterokario in buona fede se contiene coloranti sia viola che rosso lontano che si sovrappongono nel citoplasma.

Risultati

Le celle etichettate in modo appropriato sono visibili durante la citometria di flusso mediante segnale di fluorescenza superiore alle celle di controllo non etichettate (Figura 2A). I cancelli sono impostati per la selezione di cellule doppie positive, arricchendo questa popolazione direttamente in piatti di imaging per ulteriori analisi microscopiche. Le cellule fuse sono rilevabili come cellule doppie fluorescenti fluorescenti distinte e c...

Discussione

Dimostriamo un protocollo facile ed economico per fondere le cellule e visualizzare la successiva architettura di ibridi cellulari con microscopia, impiegando circa due giorni dall'inizio alla fine. Le parti critiche di questo protocollo sono l'arricchimento delle cellule fuse mediante l'ordinamento delle cellule (sezione protocollo 3) e un'attenta convalida delle cellule fuse mediante microscopia (sezione protocollo 4). Queste sezioni assicurano che le cellule fuse siano facilmente ottenute e siano eteoka fideeeoni. Le ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 ml tube	Sarstedt	62554502
37% formaldehyde solution	Sigma-Aldrich	F8875
880 Laser Scanning Confocal Airyscan Microscope	Carl Zeiss
8-well imaging dishes	Ibidi	80826
Anti-GFP alpaca GFP booster nanobody	Chromotek	gba-488
BD Influx Cell Sorter	BD Biosciences
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Cell Filters (70um)	Biofil	CSS010070
CellTrace Far Red	ThermoFisher Scientific	C34572
CellTrace Violet	ThermoFisher Scientific	C34571
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate	ThermoFisher Scientific	31966021
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	10270-106
FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobody	NanoTag Biotechnologies	N1302-At565
L15 CO2 independent imaging medium	Sigma-Aldrich	21083027
Penicillin/streptomycin	Sigma-Aldrich	15140122
Phenol red free DMEM, high glucose	ThermoFisher Scientific	21063029
Phosphate buffered saline (1 x PBS)			8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2HPO4, dH2O up to 1L
Polyethylene Glycol Hybri-Max 1450	Sigma-Aldrich	P7181
Polypropylene tubes	BD Falcon	352063
Triton X-100	Fisher BioReagents	BP151	nonionic surfactant
Trypsin	Sigma-Aldrich	T4049
Tween 20	Fisher BioReagents	BP337	nonionic detergent