細胞構造と機能の摂動のためのゲノム編集細胞株の細胞融合

要約

このプロトコルの目的は、2 つの異なるセルタイプを融合してハイブリッドセルを作成することです。融合細胞の蛍光顕微鏡分析は、細胞オルガネラの起源の細胞を追跡するために使用されます。このアッセイは、細胞の構造と機能が細胞融合による摂動にどのように反応するかを調べるために使用できます。

要約

生命は、細胞およびオルガネラの中の異なる分子状態の単離された形成を可能にするために、脂質膜内で空間的に分配される。細胞融合は、2つ以上の細胞を合併して単一の細胞を形成する。ここでは、2種類の異なる細胞融合のためのプロトコルを提供する。融合したハイブリッド細胞は、フローサイトメトリーベースのソーティングによって濃縮され、続いてハイブリッド細胞構造と機能の蛍光顕微鏡検査が行われる。ゲノム編集によって生成された蛍光タグ付きタンパク質は、融合細胞内で画像化され、蛍光発光に基づいて細胞構造を同定し、細胞の起源型に逆戻りすることができます。この堅牢で一般的な方法は、興味のある異なる細胞タイプまたはオルガネラに適用することができ、基本的な生物学的問題の範囲にわたって細胞構造および機能を理解する。

概要

細胞構造の恒静維持は生命にとって重要である。細胞は、特徴的な形態、細胞下オルガネラ数、および内部生化学組成物を有する。これらの基本的な特性がどのように生成され、病気の間にどのように苦労するかを理解するには、それらを摂動するための実験室ツールが必要です。

細胞融合は、2つ以上の別個の細胞の融合である。細胞融合は真核生物¹の出現に重要であったかもしれない。人体において、細胞融合は比較的稀であり、受精中や筋肉、骨および胎盤²の形成中などの発達の制限された状況および組織型の間に起こる。このプロトコルは、細胞の構造および機能を制御するメカニズムを理解するツールとして、微分蛍光標識オルガネラを有する組織培養細胞株における細胞融合の誘導を記述する。

インビトロ誘導細胞融合は、モノクローナル抗体³の産生の中心であり、生物学的研究および疾患治療のための重要なツールである。細胞融合はまた、細胞周期優位性^に関する多くの異なる基本的な細胞生物学的質問を尋ねるために使用されてきた, アネプロイド^5,6, 細胞リプログラミング^7,8, 損傷ニューロンの修復⁹, ウイルス増殖¹⁰, アポトーシス¹¹, 腫瘍形成¹², サイト骨格ダイナミクス¹³, および膜融合^14,15.細胞融合16、17、18、19を誘導する実験室ベースの方法は、2つの二重層を1つに物理的に結合させることによって脂質膜合体を誘導する。細胞融合は、電気^18、ウイルスベースの方法^17、サーモプラズモン加熱^20、トランスジーン発現^19、およびポリエチレングリコール(PEG)16、21、22を含む化学物質によって誘導され得る。

セントロソームは、細胞形状、運動性、偏光、および分裂²³を制御する微小管組織化センターである。心分離根は、タンパク質ルートレットイン²⁴を含むセントロソーム(遺伝子CROCCによってコードされる)から延びる線維構造である。我々は最近、細胞融合を用いて、親細胞²⁴に対するヘテロコン内の重心の位置と数がどのように変化するかを理解した。この方法の使用の背後にある根拠は、微分蛍光タグ付き親細胞の融合後にヘテロカリオン内の根の起源の細胞を追跡し、したがって、オルガネラ融合と核分裂を画像化することです。蛍光タグ付きタンパク質のルートレチン-meGFPまたはルートレチン-mScarlet-Iは、PEG媒介細胞融合によって融合された別々の細胞株でゲノム編集によって作成されます。細胞染色体(材料表)を用いて、フローサイトメトリーおよびその後の蛍光顕微鏡による起源および形態のセントロソーム細胞の同定によって融合細胞を同定する(図1)。このアプローチは、オルガネラ数を含む細胞状態の大きな変化が細胞恒常性にどのように影響するかを研究するための堅牢でユニークな方法です。

プロトコル

1. 微分蛍光細胞標識

1. CRISPR Cas9を使用した遺伝子タグ付け
   1. CRISPR Cas9ゲノム編集を使用して、ヒトがん細胞株の蛍光タンパク質meGFPまたはmScarlet-Iでルートレチン(または他の目的遺伝子)にタグを付けます。
      注:ゲノム編集のための詳細なプロトコルは、他の場所でカバーされています^24,25,26.
2. 蛍光色素標識
   1. 10%の胎児ウシ血清(FBS)、L-グルタミン、および100μg/mLペニシリン/ストレプトマイシンを加湿したインキュベー_ターで100μg/mLペニシリン/ストレプトマイシンを添加したダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)でCal51ヒト癌細胞を増殖させる。
      注:マイコプラズマ汚染の有無や細胞株の同一性について、細胞が定期的にチェックされるようにすることが重要です。培養物(>15節)に広範囲に通行した細胞は使用しないでください。細胞は健康で指数関数的に成長している必要があります。過結合や過度の結合は避けてください。
   2. 各細胞タイプ(ルートレチン-meGFP、ルートレチン-mScarlet-Iおよび親のタグなしCal51細胞)を播種し、〜6 x 10⁶細胞が各サンプルに対して翌日存在し、70−90%の合流性で存在する。
      注:これは、約1つのT75組織培養フラスコまたは細胞タイプあたり10cm皿です。親のタグなしセルは、プロトコルの後半で負のコントロールとして必要とされます。このプロトコルは、約 20,000 個の融合セルの生産を可能にしますが、バッチ数が増え、プロトコルをスケールアップすることでこの数を増やすことができる。
   3. 翌日、前温DMEM、トリプシン及び1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を37°Cの水浴中に入れる。
   4. モルトレチンmeGFPとルートレチンmScarlet-I細胞をPBSで2x洗浄し、培地を流し降ろして10mLのPBSに交換します。
   5. 標識Cal51ルートレチン-meGFP細胞は、室温で1分間PBSに500nM紫色細胞色素(材料表)を添加した。
   6. 標識Cal51ルートレチン-mScarlet-I細胞は、RTで1分間PBSに200 nMの遠赤色細胞色素(材料の表)を加えることによって。
      注:蛍光染色後、可能な限り光から保護されたサンプルを保ち、蛍光の光脱色を避けてください。
   7. 5分間DMEMを10mL加えて色素標識反応を停止します。
   8. インキュベーターからラベルなしの親 Cal51 細胞を削除します (ステップ 1.2.2 から)。
      注:これらのセルは、後でラベルなしの負のコントロールとして使用されます (手順 3.3.2)。
   9. 成長培地を注ぎ出し、10mLのPBSに置き換えて、すべての細胞を一度洗浄します。
   10. PBSを注ぎ、1mLの予温された1xトリプシンで培養条件で5分間インキュベートします。
   11. 細胞を15 mLプラスチック円錐管に移し、1000 x gで5分間遠心分離機を送る。
   12. 慎重に取り外し、ピペットで細胞ペレットからトリプシンを廃棄します。
   13. PBSの1 mLでバイオレットと遠赤色の標識された細胞ペレットを穏やかに再サスペンドします。
   14. 親(非蛍光)細胞ペレットをDMEMの1mLで軽く再サスペンドし、インキュベーターに戻します。
       注:このサンプルは細胞間融合を受けないようにするが、後でフローサイトメトリー中に使用される。

2. 細胞融合

1. 1 mL ピペットを使用して各セル タイプの 0.5 mL を穏やかにピペットすることで、3 x 10⁶の遠赤色のラベル付きセルを 15 mL チューブに含む 3 x 10⁶紫色のラベル付きセルを混合します。
2. 残りの未混合細胞をステップ2.1から1,000 x gで5分間遠心分離し、次いでPBSを注ぎ、ペレットをDMEMの1 mLで再スレドし、インキュベーターに戻す。
   注:これらの残りの単一ラベル付きサンプルは、後でプロトコルのセクション 3 の負および補正制御として使用されます。
3. ステップ2.1から混合細胞を1,000 x gで5分間遠心分離し、1mLピペットを用いて慎重にPBSを吸引する。
4. 30sの期間にわたって1 mLピペットを使用して、セルペレット(ステップ2.3)にドロップワイズで50%1450 PEG溶液の0.7 mLを追加します。
5. RTで3.5分放置します。
   注:PEGによるインキュベーション時間は細胞の種類に応じて最適化され得るが、インキュベーション時間が長いほど細胞毒性が高まることに注意する。
6. 10 mL の無血清 DMEM を 30 s のドロップワイズに加え、インキュベーターに 10 分間放置します。
7. 1,000 x gで5分間スピンダウンし、上清を廃棄し、1 mLの完全な培地(FBSを含むDMEM)で穏やかに再サスペンドします。
   注:セクション 3 に直接進みます。PEG暴露に伴う毒性があり、その後にフローサイトメトリーとイメージングが続くため、細胞をステップ間を迅速に進めることで、可能な限り培養状態に保ちます。

3. 蛍光活性化細胞選別(FACS)による融合細胞の濃縮

1. 70 μm フィルターを介して各サンプルを FACS チューブに別々にピトインしてフロー サイトメトリーのすべてのセルを準備します。
   注:4つのサンプルが必要です:融合細胞、単一の標識された遠赤色細胞、単一の標識された紫色細胞、非ラベル化された親細胞。滅菌組織培養フードから取り出すと、細胞は感染する能力を持っているので、これからは非滅菌環境へのサンプルの暴露時間を最小限に抑えます。セルは完全なDMEM培地でソートされる。
2. 単一セルの並べ替えが可能なサイトメーターを使用します。
   1. 無菌ソートのセルソーターを設定します。メーカーの推奨に従って計測器の品質管理を行います。
   2. 前方散乱対側散布図と二重判別プロットを描きます。
3. 融合したセルを識別するゲートを作成します。
   1. 405 nmおよび635 nmの波長で蛍光色素を励起する。450 nmおよび660 nm(それぞれ紫色および遠赤色波長)で検出します。遠い赤と紫色の波長をプロットします。
   2. 細胞計を介してラベルのない親細胞を実行し、蛍光強度を記録します。
      注:このベースラインを超える値は、染料染色の陽性度を定義します。
   3. 細胞計を通して単一のラベル付き紫色細胞を実行します。遠くの赤いチャネルにバイオレットのこぼれがないことを確認します。
   4. 細胞計を通して遠くの赤い細胞を単一のラベルで走り、紫色チャネルに遠い赤のこぼれがないことを確認します。
      注:示された代表的なデータについて、細胞は100μmノズルを備えたソーター上で20psiでソートした。
   5. 融合サンプルを簡単に実行して、融合されたセルがステップ 3.3 で作成したゲートと共に表示されることを確認します。
4. 並べ替えストリームを中央に揃えて 8 ウェルイメージング皿にします。
5. FACSは、融合細胞を選別し、2重陽性紫色および遠赤色標識細胞として直接100μLの増殖培地を含む8ウェルイメージング皿に存在する。
   注:推奨される細胞の最大数は、8ウェル皿あたり約50,000です。並べ替え中にセルの正常性を確保します。細胞の結合は細胞の健康に影響を与える可能性があるため、イメージング皿に適した数の細胞を選別することで、細胞を20~90%の共力の後ソートの間に保ちます。各ソートされた液滴は、約3 nLのシース流体を含む。シース液が選別中に成長培地を大幅に希釈しないことを確認します。
6. 並べ替えの直後に、セルをインキュベーターに戻し、>2 時間または一晩放置します。
   注:付着細胞は、この期間中に徐々にカバースリップに再び付着し、その後、ソートから、したがって、顕微鏡に直接取り込めば、その形態は時間の経過とともに変化します。

4. 細胞細胞融合の免疫蛍光染色とイメージング

注:融合細胞は、必要な実験および測定に応じて、生きた後または固定後およびさらに蛍光染色(あるいはその両方)を画像化することができる。

1. 生細胞イメージング
   1. 成長培地をフェノールレッド(材料表)なしでイメージング媒体に交換し、直接イメージングに進みます。
2. 固定と染色
   1. 新鮮な4%パラホルムアルデヒド(PFA)をPBSで調製します。
   2. RTで15分間、4%PFAの100 μLで細胞をインキュベートして固定し、15分後にPFAを取り除きます。
      注意:PFAは吸入すると有毒であるため、このステップは適切な個人的な保護装置を備えたヒュームフードで行う必要があります。
      注:固定後、実験を一時停止し、必要に応じて後で再開できます。必要に応じて、光から保護された4°Cでサンプルを保管してください。
   3. 細胞を200μLのPBSでRTで洗浄する。
   4. PBSで希釈した200μLの200μLでRTで10分間細胞を透過し、0.1%の非イオン性界面活性剤(材料表)および0.1%の非イオン性洗剤(材料の表)を希釈する。
   5. RTで30分間PBS中の3%ウシ血清アルブミンの200μLでブロックする。
   6. 3%ウシ血清アルブミンおよび0.1%の非イオン性界面活性剤および0.05%の非イオン性洗剤を含むPBSの150μLの抗体を用いてインキュベートし、RTで1時間
      注:代表的な結果を生成するために使用される一次抗体は、蛍光共役抗GFPナノーネ(1:400希釈時に使用)であり、蛍光共役抗mScarlet-I nanobody(1:500希釈時に使用)である。これらは、既に蛍光タンパク質のシグナルを増強する。
   7. 2xを300°LのPBSで5分間洗浄し、200μLのPBSをそのままにします。
      注:サンプルはPBSで画像化される。サンプルは光から保護される4 °Cで貯えることができる。
3. 画像取得
   1. 4色イメージングが可能な適切な蛍光顕微鏡(例えば、共焦点、広視野、構造化照明)で画像を取得します。
   2. それぞれ488 nmおよび561 nm波長レーザーを備えたエキサイトなmeGFPおよびmScarlet-Iチャンネル。検出器を~505−550 nmおよび~590−650 nmで検出するように設定します。405 nmおよび633 nmレーザーがそれぞれ付いている励起バイオレットおよび遠赤色染料チャネル。検出器を~430−500 nmおよび~660−750 nmで検出するように設定します。
   3. 重要な光白化が起こらないままで細胞が健康である(生細胞イメージングの場合)ようにレーザー強度を経験的に決定する。
   4. ピクセル値を飽和または人工的にクリッピングすることなく信号が得られるようなゲインを経験的に決定します。
   5. 画像が3次元となるようなZスタックデータを収集し、20~60μmの範囲を~500μmのステップサイズでカバーします。
      注:代表的なデータに示す画像は、共焦点(図2B)、エアイスキャン(図2C)または構造化照明顕微鏡(図2D)のいずれかによって取得された。各細胞は、細胞質内で重なり合う紫色と遠赤色の色素の両方を含む場合、ボナフィデスヘテロカリオンである。

結果

標識されていない対照細胞よりも高い蛍光シグナルによりフローサイトメトリー中に適切に標識された細胞が見える(図2A)。ゲートは二重陽性細胞の選別のために設定され、この集団を画像化皿に直接濃縮し、さらなる顕微鏡分析を行います。融合細胞は、明確な二重蛍光陽性細胞として検出可能であり、集団の約1%を構成する。

...

ディスカッション

細胞を融合し、その後の細胞ハイブリッドのアーキテクチャを顕微鏡で可視化し、開始から終了まで約2日を要する、ファシリティで費用対効果の高いプロトコルを実証します。このプロトコルの重要な部分は、細胞選別による融合細胞の濃縮(プロトコルセクション3)、および顕微鏡による融合細胞の慎重な検証(プロトコルセクション4)である。これらのセクションは、融合された細胞が容易...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 ml tube	Sarstedt	62554502
37% formaldehyde solution	Sigma-Aldrich	F8875
880 Laser Scanning Confocal Airyscan Microscope	Carl Zeiss
8-well imaging dishes	Ibidi	80826
Anti-GFP alpaca GFP booster nanobody	Chromotek	gba-488
BD Influx Cell Sorter	BD Biosciences
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Cell Filters (70um)	Biofil	CSS010070
CellTrace Far Red	ThermoFisher Scientific	C34572
CellTrace Violet	ThermoFisher Scientific	C34571
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate	ThermoFisher Scientific	31966021
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	10270-106
FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobody	NanoTag Biotechnologies	N1302-At565
L15 CO2 independent imaging medium	Sigma-Aldrich	21083027
Penicillin/streptomycin	Sigma-Aldrich	15140122
Phenol red free DMEM, high glucose	ThermoFisher Scientific	21063029
Phosphate buffered saline (1 x PBS)			8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2HPO4, dH2O up to 1L
Polyethylene Glycol Hybri-Max 1450	Sigma-Aldrich	P7181
Polypropylene tubes	BD Falcon	352063
Triton X-100	Fisher BioReagents	BP151	nonionic surfactant
Trypsin	Sigma-Aldrich	T4049
Tween 20	Fisher BioReagents	BP337	nonionic detergent