Слияние клеток генома Отредактированные клеточные линии для возмущения клеточной структуры и функции

Резюме

Цель юаней протокола состоит в том, чтобы сплавить два различных типа клеток для создания гибридных ячеек. Флуоресценция микроскопии анализ сросшиеся клетки используется для отслеживания клетки происхождения клеточных органелл. Этот асссможно использовать для изучения того, как клеточная структура и функция реагируют на возмущение путем слияния клеток.

Аннотация

В липидных мембранах жизнь пространственно разделена, чтобы позволить изолированное образование различных молекулярных состояний внутри клеток и органелл. Слияние клеток представляет собой слияние двух или более клеток для формирования одной клетки. Здесь мы предоставляем протокол для слияния клеток двух различных типов клеток. Сросые гибридные клетки обогащаются сортировкой на основе цитометрии потока, за которой следует флуоресцентная микроскопия структуры и функции гибридных клеток. Флуоресцентно помеченные белки, генерируемые при редактировании генома, образуются внутри сброшенных клеток, что позволяет идентифицировать клеточные структуры на основе выбросов флуоресценции и ссылаться на тип клеточного происхождения. Этот надежный и общий метод может быть применен к различным типам клеток или органеллам, представляющим интерес, чтобы понять клеточную структуру и функции по целому ряду фундаментальных биологических вопросов.

Введение

Гомеостасическое поддержание клеточной структуры имеет решающее значение для жизни. Клетки имеют характерные морфологии, субклеточные числа органелл и внутренний биохимический состав. Понимание того, как эти фундаментальные свойства генерируются и как они идут наперекосяк во время болезни, требуют лабораторных инструментов, чтобы возмутить их.

Слияние клеток представляет собой слияние двух или более отдельных клеток. Слияние клеток, возможно, имеет решающее значение для появления эукариотической жизни¹. В организме человека, слияние клеток является относительно редким, происходящих во время ограниченных условий развития и типов тканей, таких как во время оплодотворения или формирования мышц, костей и плаценты². Этот протокол описывает индукцию слияние клеток в линиях клеток культуры ткани с дифференциально флуоресцентно обозначенными органеллами, как инструмент для того чтобы понять механизмы контролируя структуру и функцию клетки.

В пробирке индуцированных клеточных клеток слияния имеет центральное значение для производства моноклональных антител³, важный инструмент для биологических исследований и лечения заболеваний. Слияние клеток также было использовано, чтобы задать много различных фундаментальных клеточных биологических вопросов о доминировании клеточного цикла⁴, aneuploidy^5,6, клеточное перепрограммирование^7,8, ремонт поврежденных нейронов⁹, вирусное пролиферации¹⁰, апоптоз¹¹, tumorigenesis¹², цитоскелетная динамика¹³, и мембранного синтеза^14,15. Лабораторные методы, чтобы вызвать слияние клеток^16,17,18,19 индуцировать липидной мембраны объединения через физическое слияние двух двух слоев в один. Слияние клеток может быть вызвано электричеством¹⁸, вирусные методы¹⁷, термоплазмонное отопление²⁰, трансгенное выражение¹⁹, и химических веществ, включая полиэтиленгликоль (PEG)^16,21,22.

Центросомами являются микротубулы, организуя центры, контролирующие клеточную форму, подвижность, поляризацию и деление^23. Центросомные корни представляют собой волокнистые структуры, простирающиеся от центросомы, содержащие белок rootletin²⁴ (кодируется геном CROCC). Недавно мы использовали клеточные клетки слияния, чтобы понять, как центросомы положение и число меняется внутри гетерокарионов по отношению к родительским клеткам²⁴. Обоснование использования этого метода заключается в отслеживании клетки происхождения корней в гетерокарионе после слияния дифференциально флуоресцентно отмеченных родительских клеток, и, таким образом, к изображению слиянию и делению органеллы. Флуоресцентно помеченные белки rootletin-meGFP или rootletin-mScarlet-I создаются путем редактирования генома в отдельных клеточных линиях, которые затем сливается с PEG-опосредованного синтеза клеток. Мы описываем использование клеточных красителей(Таблица материалов) для идентификации сросшиеся клетки по цитометрии потока и последующей флуоресценционной микроскопии идентификации центросомной клетки происхождения и морфологии (Рисунок 1). Этот подход является надежным и уникальным методом для изучения того, как основные изменения в клеточном состоянии, включая число органелл посягают на гомеостаз клеток.

протокол

1. Дифференциальная флуоресцентная клеточной маркировки

1. Ген пометки с CRISPR Cas9
   1. Используйте редактирование генома CRISPR Cas9, чтобы пометить rootletin (или другие гены, представляющие интерес) с флуоресцентными белками meGFP или mScarlet-I в линиях раковых клеток человека.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подробные протоколы для редактирования генома покрыты в другом месте^24,25,26.
2. Флуоресцентная маркировка красителей
   1. Выращивайте раковые клетки Cal51 человека в модифицированной среде Орла (DMEM) Dulbecco, дополненной 10% сывороткой крупного рогатого скота плода (FBS), L-глютамином и 100 мкг/мл пенициллина/стрептомицина при 37 и 5% CO₂ в увлажненном инкубаторе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно обеспечить, чтобы клетки регулярно проверялись на отсутствие загрязнения микоплазмы, а также на идентичность клеточной линии. Не используйте клетки, которые были широко проложены в культуре (No gt;15 проходов). Клетки должны быть здоровыми и расти в геометрической прогрессии. Избегайте недотефности или чрезмерной выпуклости.
   2. Семена каждого типа клеток (rootletin-meGFP, rootletin-mScarlet-I и родительские немаркированные клетки Cal51) так, что на следующий день для каждого образца присутствуют 6 х 10⁶ ячеек, при выпуклости 70–90%.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это приблизительно одна колба культуры T75 или одно тарелку 10 сантиметров в тип клетки. Родительские немаркированные ячейки необходимы в качестве отрицательного контроля позже в протоколе. Этот протокол позволяет вырабатывать 20 000 сросательных ячеек, но это число может быть увеличено за счет увеличения протокола с увеличением количества партий.
   3. На следующий день, претеплый DMEM, трипсин и 1x фосфат-буферный солен (PBS), поместив их в водяную ванну при 37 градусах Цельсия.
   4. Вымойте rootletin-meGFP и rootletin-mScarlet-I клетки 2x в PBS путем заливки или аспирации от среднего и замены с 10 мл PBS.
   5. Этикетка Cal51 rootletin-meGFP клеток, добавив 500 Нм фиолетовый краситель клеток (Таблица материалов) в PBS в течение 1 мин при комнатной температуре (RT).
   6. Этикетка Cal51 rootletin-mScarlet-I клеток, добавив 200 нм гораздо красных клеток красителя (Таблица материалов) в PBS в течение 1 мин на RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Держите образцы защищены от света, где это возможно после флуоресцентного окрашивания, чтобы избежать фотоотбелевания флуоресценции.
   7. Остановите реакцию маркировки красителя, добавив 10 мл DMEM в течение 5 мин.
   8. Удалить немаркированные родительские клетки Cal51 из инкубатора (от шага 1.2.2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти ячейки будут использоваться позже в качестве немаркированных отрицательных элементов управления (шаг 3.3.2).
   9. Вымойте все клетки один раз, выливая от роста среды и замены с 10 мл PBS.
   10. Налейте PBS и инкубировать в течение 5 минут в культурных условиях с 1 мл предварительно подогретого 1x трипсина.
   11. Перенесите клетки в пластиковую коническую трубку 15 мл и центрифугу при 1000 х г в течение 5 мин.
   12. Тщательно удалить и выбросить трипсин из клеточной гранулы с пипеткой.
   13. Аккуратно resuspend фиолетовый и далеко красный помечены клеточные гранулы в 1 мл PBS.
   14. Аккуратно приостановите родительские (нелюморометательные) клеточные гранулы в 1 мл DMEM и вернитесь в инкубатор.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Этот образец не будет проходить слияние клеток, но будет использоваться позже во время цитометрии потока.

2. Слияние клеток

1. Смешайте 3 х 10⁶ фиолетовых помеченных клеток с 3 х 10⁶ далеко красные помечены клетки в 15 мл трубки, мягко pipetting вместе 0,5 мл каждого типа клеток с помощью 1 мл пипетки.
2. Центрифуги оставшиеся несмешанные клетки со ступени 2,1 на 1000 х г в течение 5 мин, затем слить PBS, resuspend гранулы в 1 мл DMEM и вернуться в инкубатор.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оставшиеся несмешанные образцы с одной маркировкой будут использованы позднее в качестве отрицательного и компенсационного контроля в разделе 3 протокола.
3. Центрифуги смешанных клеток от шага 2,1 на 1000 х г в течение 5 минут и тщательно аспирации PBS с помощью 1 мл пипетка.
4. Добавьте 0,7 мл 50% 1450 PEG раствор в dropwise моды на клетки гранулы (шаг 2.3) с помощью 1 мл пипетки в течение 30 с.
5. Оставьте на 3,5 мин на RT.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации с ПОМОЩЬю ПЭГ может быть оптимизировано в зависимости от типа клеток, хотя обратите внимание, что более длительное время инкубации увеличивает токсичность клеток.
6. Добавьте 10 мл безысыворотки DMEM dropwise на 30 с и оставьте в инкубаторе на 10 минут.
7. Спин вниз на 1000 х г в течение 5 минут, отбросить супернатант, и повторно в 1 мл полной среде (DMEM, содержащий FBS).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перейдите непосредственно к разделу 3. Существует токсичность, связанная с воздействием ПЭГ, за которым следует цитометрия потока и визуализация, поэтому держите клетки в культурных условиях как можно больше, быстро протекая между шагами.

3. Флуоресценция активированная сортировка клеток (FACS) для обогащения слитых ячеек

1. Подготовьте все клетки для цитометрии потока, аккуратно пайпетируя каждый образец отдельно через фильтр 70 мкм в трубку FACS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Требуются четыре образца: слитые клетки, одномаркированные далеко красные клетки, одномаркированные фиолетовые клетки, немаркированные родительские клетки. После удаления из стерильной ткани культуры капот, клетки имеют возможность заразиться, так что свести к минимуму время воздействия образцов в нестерильной среде отсюда и далее. Клетки сортируются в полной среде DMEM.
2. Используйте цитометр, способный сортировать одноклеточные ячейки.
   1. Настройка сортировки ячейки для асептического сортировки. Выполняйте контроль качества прибора в порядке рекомендации производителя.
   2. Нарисуйте участок вперед рассеяния против бокового рассеяния и двойной различения участка.
3. Создание ворот для идентификации сброшенных ячеек.
   1. Возбуждайте флуоресцентные красители на длинах волн 405 нм и 635 нм. Обнаружение на 450 нм и 660 нм (фиолетовые и дальнекрасные длины волн, соответственно). Участок далеко красный против фиолетовых длин волн.
   2. Запуск немаркированных родительских клеток через цитометр и записывать интенсивность флуоресценции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Значения выше этого базового определить положительность для окрашивания красителя.
   3. Выполнить одиночные помеченные фиолетовые клетки через цитометр. Подтвердите, что нет разлива фиолетового в далеком красном канале.
   4. Выполнить одинпомеченных далеких красных клеток через цитометр и подтвердить, что нет разлива далеко красный в фиолетовый канал.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для представленных репрезентативных данных клетки были отсортированы в 20 пси на сортировке, оборудованном соплом площадью 100 мкм.
   5. Кратко запустите образец синтеза, чтобы подтвердить, что слитые ячейки видны с воротами, созданными в шаге 3.3.
4. Выровнять сортировку поток централизованно в 8-хорошо изображения блюдо.
5. FACS сортируют сросшиеся клетки, присутствующие в виде двойных положительных фиолетовых и далеко-красных помеченных клеток непосредственно в 8-колодское изображение блюдо, содержащее 100 л среды роста.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальное рекомендуемое количество клеток составляет 50 000 евро за 8-хорошо блюдо. Обеспечить работоспособность клеток во время сортировки. Клеточная стельность может влиять на здоровье клеток, поэтому держите клетки между 20-90% сортировки, сортируя соответствующее количество клеток для изображения блюда. Каждая отсортированная капля содержит приблизительно 3 нл оболочки жидкости. Убедитесь, что оболочка жидкости не значительно разбавить среды роста во время сортировки.
6. Непосредственно после сортировки, взять клетки обратно в инкубатор и оставить на 2 ч или на ночь.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Приверженные клетки будут постепенно повторно придерживаться coverslip в течение этого периода, от сортировки вперед, и, следовательно, их морфология будет меняться с течением времени, если принимать непосредственно к микроскопу.

4. Иммунофлуоресцентное окрашивание и визуализация клеточных сплавов

ПРИМЕЧАНИЕ: Сброшенные клетки могут быть изображены жить или после фиксации и дальнейшего флуоресцентного окрашивания (или оба), в зависимости от экспериментов и измерений требуется.

1. Визуализация живых клеток
   1. Замените среду роста с изображением среды без фенола красный (Таблица материалов) и перейти непосредственно к визуализации.
2. Фиксация и окрашивание
   1. Приготовьте свежий 4% параформальдегида (PFA) в PBS.
   2. Исправьте клетки, инкубируя их в 100 qL 4% PFA в течение 15 мин на RT. Удалить PFA после 15 мин.
      ПРЕДЕКТО: PFA является токсичным при вдыхании, поэтому этот шаг должен быть выполнен в дым капот с соответствующими средства индивидуальной защиты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После фиксации эксперимент можно приложить и перезапустить позже, если потребуется. При необходимости храните образец при 4 градусах по Цельсию, защищенных от света.
   3. Вымойте клетки 3x в 200 Л ПБС на RT.
   4. Пермябилизируемые клетки в течение 10 мин при РТ в 200 л 0,1% неионического сурфактанта(Таблица материалов)и 0,1% неионического моющего средства(Таблица материалов),разбавленных в PBS.
   5. Блок в 200 л 3% бычьего сыворотки альбумина в PBS в течение 30 минут на RT.
   6. Инкубировать антителами в 150 Л PBS, содержащими 3% бычьего сывороточного альбумина и 0,1% неионического сурфактанта и 0,05% неионического моющего средства в течение 1 ч на RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Основными антителами, используемыми для генерации репрезентативных результатов, являются флуоресцентно конъюгированные анти-GFP nanobody (используется при разбавлении 1:400) и флуоресцентно спряжение противмоголочного и наноа (используется в 1:500 разбавления). Они усиливают сигнал уже флуоресцентных белков.
   7. Вымойте 2x в течение 5 минут в 300 Л ПБС, а затем оставить в 200 Л ПБС.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы отображаются в PBS. Образцы могут храниться при 4 градусах По Цельсию, защищенных от света.
3. Приобретение изображения
   1. Приобретайте изображения с соответствующим флуоресцентным микроскопом, способным к четырехцветной визуализации (например, конфокальный, широкоугольный, структурированный подсветка).
   2. Возбуждают каналы meGFP и mScarlet-I с лазерами длиной 488 нм и длиной 561 нм соответственно. Установите детекторы для обнаружения на уровне 505-550 нм и 590-650 нм. Возбуждайте фиолетовые и гораздо красные красительные каналы с 405 нм и 633 нм лазеров, соответственно. Установите детекторы для обнаружения на уровне 430-500 нм и 660-750 нм.
   3. Эмпирически определить интенсивность лазера таким образом, что значительное фотоотбеление не происходит, и что клетки остаются здоровыми (если живой визуализации клеток).
   4. Эмпирически определить выигрыш так, что сигнал получается без насыщения или искусственного отсечения значений пикселей.
   5. Соберите данные о стеке, такие, чтобы изображения были трехмерными, охватывающими диапазон от 20–60 мкм с размером шага в 500 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения, показанные в репрезентативных данных, были получены либо confocal(рисунок 2B),Airyscan(Рисунок 2C) или структурированной микроскопией освещения(рисунок 2D). Каждая клетка является добросовестным гетерокарионом, если она содержит как фиолетовые, так и далекие красные красители, перекрывающиеся в цитоплазме.

Результаты

Соответствующим образом помечены клетки видны во время потока цитометрии по флуоресценции сигнал выше, чем немаркированные контрольные элементы(Рисунок 2A). Ворота настроены на сортировку двойных положительных клеток, обогащая эту популяцию...

Обсуждение

Мы демонстрируем поверхностный и экономичный протокол для сплавливки клеток и визуализации последующей архитектуры клеточных гибридов с помощью микроскопии, что занимает около двух дней от начала до конца. Критическими частями этого протокола являются обогащение срослых ячеек сорт?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 ml tube	Sarstedt	62554502
37% formaldehyde solution	Sigma-Aldrich	F8875
880 Laser Scanning Confocal Airyscan Microscope	Carl Zeiss
8-well imaging dishes	Ibidi	80826
Anti-GFP alpaca GFP booster nanobody	Chromotek	gba-488
BD Influx Cell Sorter	BD Biosciences
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Cell Filters (70um)	Biofil	CSS010070
CellTrace Far Red	ThermoFisher Scientific	C34572
CellTrace Violet	ThermoFisher Scientific	C34571
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate	ThermoFisher Scientific	31966021
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	10270-106
FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobody	NanoTag Biotechnologies	N1302-At565
L15 CO2 independent imaging medium	Sigma-Aldrich	21083027
Penicillin/streptomycin	Sigma-Aldrich	15140122
Phenol red free DMEM, high glucose	ThermoFisher Scientific	21063029
Phosphate buffered saline (1 x PBS)			8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2HPO4, dH2O up to 1L
Polyethylene Glycol Hybri-Max 1450	Sigma-Aldrich	P7181
Polypropylene tubes	BD Falcon	352063
Triton X-100	Fisher BioReagents	BP151	nonionic surfactant
Trypsin	Sigma-Aldrich	T4049
Tween 20	Fisher BioReagents	BP337	nonionic detergent