使用伦迪病毒载体方法生成转基因大鼠

摘要

本文旨在提供大鼠胚胎中扁病毒转生的方法，使用多次注射病毒悬浮液进入酶体肠。雌性大鼠与肥沃的雄性菌株交配，具有不同的显性毛皮颜色，用于产生伪怀孕的养母。

摘要

转基因动物模型在现代生物医学研究中至关重要。将外来基因植入早期小鼠或大鼠胚胎是活生物体基因功能分析的宝贵工具。标准转基因方法基于将外来DNA片段微注入受精卵母细胞的异核。这项技术在小鼠中被广泛应用，但在其他动物物种中仍然相对低效和技术要求高。转基因还可以通过慢病毒感染引入单细胞阶段胚胎，为标准前列腺注射提供有效的替代，特别是在胚胎结构更具挑战性的物种或菌株中。在这种方法中，含有慢病毒载体的悬浮液被注射到受精大鼠胚胎的围网空间，从技术上讲，这种胚胎要求较低，成功率也更高。线病毒载体被证明有效地将转基因纳入基因组，以确定稳定的转基因系的产生。尽管存在一些局限性（例如，生物安全等级 2 要求、DNA 片段大小限制），但慢病毒转基因是一种快速而高效的转基因方法。此外，使用雌性大鼠与肥沃的男性菌株交配，具有不同的显性毛皮颜色，作为产生伪孕养母的替代品。

引言

多年来，实验室啮齿动物，如大鼠和老鼠，一直被用来模拟人类的生理和病理状况。动物研究已经导致发现，这是无法通过任何其他手段。最初，基因研究侧重于分析自发发生的疾病和表型，被认为是密切模仿人类的条件^1。基因工程方法的发展允许引入或删除特定基因来获得所需的表型。因此，转基因动物的产生被认为是现代研究中的一项基本技术，它允许对生物体内基因功能的研究。

转基因动物技术通过在实验胚胎学和分子生物学方面取得的成绩而成为可能。20世纪60年代，波兰胚胎学家A.K.Tarkowski发表了^{关于小鼠胚胎}在发育早期阶段操纵的第一个工作。此外，分子生物学家还开发了产生DNA载体（即载体）的技术，以便除其他外将外来DNA引入动物的基因组。这些载体允许传播选定的基因及其适当的修饰，这取决于所进行的研究类型。"转基因动物"一词是由戈登和陆克文³引入的。

第一个被广泛接受的物种，用于神经生物学，生理学，药理学，毒理学和许多其他领域的生物和医学是挪威大鼠，拉图斯诺维吉库斯^4。然而，由于难以操纵大鼠胚胎，室内小鼠肌肉已成为基因研究中的主要动物物种^。在这种研究中，老鼠占主导地位的另一个原因是，有胚胎干细胞技术可以为这种物种生产淘汰动物。最常见的转基因技术（相对于所有出生的动物，转基因后代的2-10%）是将DNA片段微入受精卵母细胞的亲核中。1990年，这种方法首次引入小鼠体内，适用于^66、7只大鼠。与小鼠相比，前列腺注射的鼠转基因具有效率低⁸的特点，这与弹性等离子体和前列腺膜^的存在密切相关。虽然操纵后的胚胎存活率比小鼠低40-50%，但这项技术被认为是转基因大鼠¹⁰代的一个标准。研究了能够保证有效转基因结合和提高注射酶的存活率的替代方法。

稳定转基因表达和传染给后代的关键决定因素是它与宿主细胞基因组的集成。伦迪病毒（LV）具有能够感染分裂细胞和非分裂细胞的显著特征。它们用作将异质基因纳入胚胎的工具被证明是高效的^11，而转基因个体的特点是结合DNA片段的稳定表达。扁病毒载体的疗效已确认为小鼠^12、13、13大鼠^12、14,14等¹¹种进行基因改造。¹²在这种方法中，LV悬浮液在两个原核的阶段被注射在胚胎的zona pellucida下。这种技术基本上保证了胚胎100%的存活率，因为奥莱玛仍然不受影响。生产高质量和相对集中的LV悬架是关键因素。然而，低浓度的LV悬浮液可以通过重复注射¹¹来克服，这增加了蛋表面的病毒颗粒量，同时不影响膜的整合。接受反复注射到围场的胚胎进一步发育，转基因后代可以通过生殖系传播转基因。扁病毒转变转基因大鼠的生成效率高达^80%12。

在这里，我们描述了HIV-1衍生的重组性扁病毒的产生，这种病毒是伪型的，带有光眼口腔炎病毒（VSV）G包络蛋白。使用第二代包装系统 VSV 伪型决定了病毒颗粒的广泛感染性，并允许生产高度稳定的载体，这些载体可以通过超离心和低温保存进行浓缩。滴定验证后，载体可作为将基因转化为白化病的威斯塔大鼠酶体的工具。经过一系列的注射后，胚胎可以培养过夜，并在双细胞阶段转移到寄养母亲。在这一点上，可以考虑两种替代方法之一。标准程序利用伪怀孕女性作为胚胎接受者。然而，当与输精管结扎的雄配后怀孕率较低时，胚胎可以植入怀孕的 Wistar / Sprague - Dawley （ SD ）雌性，这些雌性与具有深色毛皮颜色的肥沃雄性大鼠交配（例如，棕色挪威 [ BN ] 大鼠）。毛皮的颜色允许区分后代与自然怀孕的后代，这些后代来自转移的操纵胚胎。

研究方案

病毒载体的生产和应用符合生物安全二级准则，并经波兰环境部批准。下面描述的所有实验动物程序都得到当地伦理委员会的批准。这些动物被安置在稳定的温度（21~23°C）和湿度（50~60%）的单独通风的笼子里。在12 h/12 h的光/暗循环下，可以获得水和食物。

1. 伦迪病毒载体生产

1. HEK 293T 细胞的转染
   注:本文介绍的协议是为20×10厘米培养皿的转染而设计的，这些培养皿产生约200 mL的粗矢量上清液。
   1. 培养DMEM介质中的HEK 293T细胞，在37°C的加湿_CO2培养箱中补充胎儿牛血清（10%，v/v）。对于转染，准备直径为20 10厘米的板，并播种1.5⁄2 x 10⁶ HEK 293T细胞每道菜。
   2. 当汇合达到+70%时，使用聚二烯胺（PEI）试剂（pH 7.0）转染细胞，每1μgDNA的PEI比例为3μg。
      1. 为五个盘子准备转染混合物（根据菜肴总数准备重复次数）。到1 mL的Dulbecco的改良鹰中（DMEM;无血清），加入三个质粒的混合物，使其达到最终量25μg的VSVg质粒，50μg的增量R8.2和50μg的编码质粒。
      2. 上下移液，在浓度为3μg/μL时加入125μL的PEI，在室温下孵育15分钟，在孵育过程中反转管子三次。每片加入200 μL的转染混合物。接下来，在37°C的加湿_CO2培养箱中孵育板。
2. 慢病毒载体的浓度
   1. 转染48小时后，收获含有LV颗粒的介质。使用 50 mL 锥形管。
      注:当使用带有荧光标记的质粒时，此时可以可视化细胞以验证转染效率。可以添加 DMEM 介质的新部分，细胞可以孵育 24 小时。转染后在 48 和 72 小时时间点采集时，LV 屈服率可比较。
   2. 将介质在 3，000 x g下离心 5 分钟，室温可去除分离的细胞。
   3. 过滤上清液 （0.45 μm）， 并将其倒入新管中。
      注: 可以省略此步骤。
   4. 加入DNase I（无RNase，1 μg/mL）和MgCl_2（1 mM），并在37°C的水浴中孵育15分钟。
   5. 将介质转移到一次性聚乙烯管，在摆动转子中以 115，000 x g和 4 °C 将超离心机转移到 1.5 h。
   6. 离心后，轻轻地从介质残留物中排干管壁。
   7. 用无菌磷酸盐缓冲盐水浸泡颗粒（PBS;每管70~80μL）。
   8. 在4~8°C下孵育2小时。
   9. 通过温和的移液重新悬浮PBS中的病毒载体。
      注意:避免发泡。
   10. 在 7，000 x g 和 4 °C 下以 7，000 x g和 4 °C 将上清液转移到新管中，将上清器转移到新管中。重复此步骤，直到看不到细胞碎屑颗粒。
   11. 在-80°C下进行等值和冻结。避免重新冻结 LV 等号。
3. 利用定量聚合酶链反应确定病毒定位器
   注:病毒载体的滴定使用定量PCR（qPCR）进行。该方法基于在病毒基因组¹⁵的长终端重复区域内放大双链84bp长DNA片段。
   1. 通过对 LV 编码质粒进行序列稀释来准备标准曲线:1:500、1:1，000、1:5，000、1:10，000、1:100，000 和 1:1，000，000。确定用于标准曲线的质粒的副本数。使用以下公式:拷贝数/μL = （浓度 [g/μL] x 6.02 x 10²³ [数字/摩尔]） / （660 [g/mol] x 质粒大小 [bp]），其中 6.02 x 10²³个数字/mol 是 Avogadro 的数字，660 克/摩尔是 bp 重量。
      注:可以使用在线拷贝编号计算器。
   2. 准备扁病毒悬浮液的稀释:1:100、1:500和1:1，000。
   3. 制备反应混合物（每孔体积）:10 μL qPCR主混合物，1 μL 10 μM正向底漆，1 μL 10 μM反向底漆，7 μL H₂O. 将混合物移制成96孔板的孔中。
      注:前进引注:5'-AGCTTGCCTTGTGCTTTCA。反向引物:5'TGACTAAAAGGGTGGGA。
   4. 加入1 μL的每个标准稀释和扁病毒悬浮液三联。
   5. 根据以下参数运行qPCR:50°C为2分钟，96°C为5分钟，35个周期为96°C，为20秒，60°C为40s，70°C为1分钟，后为熔体曲线阶段:95°C为1分钟，60°C为30秒。
   6. 通过将每次稀释时收到的分子数与标准曲线进行比较，分析结果。确定矢量分子的浓度，作为每次稀释的三个复制的平均值。
      注:呈现的定量给出了病毒颗粒的物理浓度。它不应被视为功能性手数。

2. 转基因大鼠的生成

1. 受精胚胎的超级排卵和采集
   1. 管理促性腺激素。
      注:为了增加采集的胚胎数量（每个女性大约30个），使用未成熟的5周大的Wistar雌性进行荷尔蒙刺激。
      1. 在第1天（下午12时至下午1时），腹内注射怀孕母马血清促腺激素（PMSG;每名女性25 IU）。通过在0.9%NaCl中溶解激素粉末，在浓度为125 IU/mL时制备1 mL工作溶液。在 -20 °C 下储存长达 1 个月或 -80 °C，长达 6 个月。
      2. 在第3天（下午12时至下午1时），腹内注射人类胆囊性促性腺激素（hCG;每名女性30 IU）。通过在0.9%NaCl 中溶解激素粉末，制备 1 mL 工作溶液 （150 IU/mL） 的等位物。在 -20 °C 下储存长达 1 个月或 -80 °C，长达 6 个月。
   2. hCG管理后，与性繁殖的男性（3-10个月大）交配女性1:1。
   3. 第二天早上（第4天，上午8点到10点），检查女性是否存在阴道塞。检查阴道开口是否存在白色交配插头，为了获得最佳效果，应在交配之夜后清晨检查该插头。对于胚胎收集，只使用带有可见插头的女性。
   4. 上午10点收集胚胎。牺牲动物去切除排卵管，并在带有预热的M2介质的菜肴中收集卵管。
      1. 将排卵转移到35毫米的菜，含有预加热的M2介质，从牛睾牛睾口中含有透明质酶，浓度为0.5毫克/mL。
      2. 在立体显微镜下用细钳打开输卵管壁，按压安普拉（即，含有被积细胞包围的受精胚胎的排卵的肿胀部分），直到胚胎被释放。
         注:透明质酶酶消化积细胞，释放胚胎。
         注意:长时间接触透明质酶对胚胎有害;因此，此步骤不应超过 5 分钟。
      3. 为了便于从积细胞中释放胚胎，使用连接到口操作吸气管的玻璃转移移液器轻轻上下移液。
         1. 要产生转移移液器，将玻璃巴斯德移液器拉过火焰，以产生直线 ±5-10 厘米的尖端。打破移液器留下 ±4 厘米的尖端。
      4. 在M2介质中洗涤胚胎几次，去除透明质酶和细胞碎屑。将胚胎转移到含有（±50 μL）预平衡M16介质（液体石蜡或矿物油覆盖）的60毫米培养皿中，在加湿的37°C培养箱中，具有5%的_CO2气氛。
2. 将慢病毒载体微注射到佐纳盆下的单细胞阶段胚胎
   注:使用带有两个可见原核的单细胞阶段胚胎进行微注射（图1）。
   1. 在室温下解冻LV等位，在10，000 x g和RT下解冻2分钟，以颗粒任何剩余的细胞碎片。
   2. 微注射设置
      1. 使用微锻造准备玻璃持有移液器（硼硅酸盐玻璃毛细管）。将玻璃毛细管拉过火焰，产生 5-10 厘米的尖端。打破移液器留下 ±4 厘米的尖端。外径应为 ±80±120 μm。
         注:确保移液器尖端完全笔直且光滑。
      2. 将拉拔的移液器用加热灯丝前面的尖端组装在微锻件中。将灯丝加热到离移液器尖端非常近，使其缩小到直径为±15 μm（大约胚胎大小的20%）。将移液器垂直放置在加热灯丝上，距离移液器尖端 2*3 mm，并开始加热。玻璃会变软的。加热，直到达到15°角。
      3. 使用移液器拉拔器使用灯丝制备微注射硼硅酸盐玻璃毛细管。将毛细管插入拉室。运行斜坡测试（首次用于新玻璃，每次更换灯丝后）。将热设置为斜坡值 -10，拉至 100，速度设置为 150，将时间设置为 100。
         注:修改参数以获得最佳的注塑毛细管。
      4. 在生物安全层流罩下，使用微装载机尖端将大约 2 μL 的病毒溶液加载到微注射移液器中。
      5. 准备一个微注射盘（盖子60毫米培养皿），100 μL M2介质（中间）滴，由液体石蜡或矿物油覆盖。
      6. 将装有病毒溶液的保持移液器和微注射毛细血管安装在倒置显微镜下，将病毒溶液装入微操纵器和微注射盘。
   3. 执行微注射。
      1. 将15⁄20个单细胞阶段胚胎转移到微注射盘上的M2滴。使用保持移液器握住胚胎。
      2. 使用 400 倍放大倍率，使用连接到自动喷油器的玻璃毛细管将 Zona pellucida 下的 LV 溶液注入到围注素空间。将毛细血管放在佐纳贝卢维萨下一会儿。
         注:使用温和的正压，病毒溶液将持续流出注射毛细血管，但输送的悬浮液的体积无法控制。
      3. 使用精细移液器，在5%CO2的温度下将胚胎返回到培养皿中的培养皿37°C。₂一个zygote的注射次数可能有所不同，可以根据病毒载体浓度进行调整。
         注:注射的胚胎可以在单细胞阶段移植给寄养母亲，或在两细胞阶段移植之前，在M16介质中孵育O/N。应避免大鼠胚胎的长时间体外培养。
3. 将注射胚胎移植给养母
   1. 第 3 天（用于在单细胞阶段转移胚胎）或第 4 天（用于在双细胞阶段转移胚胎）与受精期雄配性成熟的 SD 雌性或输精管切除术 SD 雄性（输精管切除术程序如下第 3 节所述）。
      注:对于排卵管转移，使用0.5天后共和 （dpc） 女性。
   2. 第二天早上，检查SD女性阴道塞，只使用那些有可见插头的。
   3. 进行胚胎移植。
      注:在立体显微镜下使用无菌仪器进行外科手术。手术前，高压灭菌剪刀、细钳子、针夹和手术刀支架。
      1. 用氯胺酮（50毫克/千克）和麦德多米丁（0.5毫克/千克）溶液给雌性麻醉。在开始外科手术之前，检查反射以确认麻醉。
      2. 用胆碱酸（2毫克/千克），但甲酸（1毫克/千克）和苯丙酮（5~10毫克/千克）注射，以防止炎症、疼痛和感染。
      3. 在双眼上涂抹眼药膏润滑，防止角膜干燥。从背部刮毛，用手术擦洗消毒皮肤，然后用无菌非粘附垫对皮肤进行70%的酒精消毒。让皮肤干燥。
      4. 在切口部位用100 μL 0.25%的bupivacain（局部麻醉剂）给动物下皮注射。在手术显微镜下，将易发位置的动物转移到加热垫上的清洁表面。用无菌窗帘盖住大鼠，在下背部切开一个小孔。
      5. 执行大约 2 厘米的皮肤切口，平行于腰椎柱。
      6. 用锋利的剪刀，在腹壁上切开一下。用钳子抓住卵巢脂肪垫，拉出卵巢和排卵管，并把它们放在用0.9%NaCl润湿的纱布上。
      7. 吸气M2介质，三泡空气，并将胚胎移植到毛细血管中。建议移植的胚胎总数（单边或双边）:怀孕女性（+15-16个胚胎）、假怀孕女性（+30个胚胎）。
      8. 使用微剪刀在卵管（在支水管和安普拉拉之间）中做一个小切口，并将转移移液器插入卵管中。
      9. 将胚胎和气泡从移液器中轻轻排出到卵管中。用钝力将生殖道放回腹腔。
      10. 用多甘油酸可吸收缝合腹壁，用伤口夹闭合皮肤切口。根据可用的胚胎数量，对其他排卵器重复此过程。
      11. 在腹内注射阿提帕梅索（0.5毫克/千克），以扭转麻醉的效果。
      12. 将动物转移到一个干净的笼子里，并放在加热板上，从麻醉中完全恢复。大鼠分娩发生在21天后。
          注:当雄性BN大鼠用于交配时，只有白鼠是潜在的转基因;棕色的小狗来自自然怀孕。
      13. 收集组织片段（最好是从耳朵）到基因型3周大的小狗。

3. 血管切除术

注:手术前，高压灭菌剪刀、细钳子和针夹。

1. 麻醉5周大雄性SD大鼠与氯胺酮（50毫克/千克）和麦德多米丁（0.5毫克/千克）溶液的i.p.给大鼠。在开始外科手术之前，检查反射以确认麻醉。
2. 分别施用托芬纳酸（2毫克/千克），但亚诺醇酸（1毫克/千克）和苯丙酮（5~10毫克/千克）下皮，以防止炎症、疼痛和感染。
3. 在双眼上涂抹眼药膏润滑，防止角膜干燥。将大鼠的软体放在加热垫上的干净表面上，用手术擦洗对睾酮上的皮肤进行消毒，然后用无菌非粘附垫对70%的酒精进行消毒。让皮肤干燥。用无菌窗帘盖住大鼠，在睾口上切上一个小孔。轻轻按压腹部，露出阴囊中的睾丸。
4. 使用手术剪刀，在阴囊中间做±0.5厘米切口。在测试点之间找到中线墙（尖线）。
5. 在靠近中线墙左侧的睾膜中进行 5 mm 切口。
6. 小心地将睾牛向左推，并将血管延迟（在睾比和中线之间）定位为具有单个血管的白色管道。
7. 使用制表师的钳子轻轻将血管从阴囊中拉出。用一对钳子握住血管延迟，用细剪刀（或用第二对钳子的红热提示烧焦）将其切割。拆下管道的 ±1 厘米碎片。
   注:如果执行烧灼，则将火焰中第二对钳的尖端保持。
8. 对其他睾测试重复上述步骤。用多甘油酸可吸收缝合缝合皮肤，用阿提帕美酮（0.5毫克/千克）注射动物腹内注射。
9. 将大鼠放在一个干净的笼子里，放在加热板上，直到动物从麻醉中恢复过来。
   注:在±2周的恢复期后，雄性可用于测试交配。确认不育后，可用于伪妊娠诱导。

结果

使用本文所述的协议，产生了携带Syn-TDP-43-eGFP构造的慢病毒载体（物理LV定位 = 3.4 x 10⁸/μL），然后可用于单细胞阶段胚胎子区注射。只有具有两个可见原核的胚胎接受手术。注射病毒悬浮液的数量是实验性的。高植入效率以及同时缺乏转基因后代被认为是病毒颗粒数量不足以成功转导的指标。在这种情况下，注射次数增加。LV的单一管理导致20只F0代大鼠出生，其中没有一只是转基因的。?...

讨论

转基因技术的进步使啮齿动物模型成为生物医学研究的宝贵工具。它们提供了研究体内基因型-表型关系的机会。在这里，我们提出了一种广泛可用的替代常规转基因通过前核注入。使用慢病毒基因转导绕过了要求苛刻的微注射的需要，因为病毒载体可以在zona pellucida下注射。这种方法不影响胚胎的完整性，这基本上保证了注射酶的100%存活率。通过慢病毒载体结合的转基因可稳稳地融入宿主基因组...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
7500 Real Time PCR System	Applied Biosystems
Aerrane (isoflurane)	Baxter	FDG9623
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes	Sigma	A5177-5EA
Atipam 5 mg/ml	Eurovet Animal Health BV	N/A	0.5 mg/kg
Baytril 25 mg/ml (enrofloksacin)	Bayer	N/A	5-10 mg/kg
Borosilicate glass capillaries with filament GC100TF-15	Harvard Apparatus Limited	30-0039	injection capillary
Bupivacaine 25 mg/ml	Advanz Pharma	N/A	0.25% in  0.9% NaCl
Butomidor 10 mg/ml (butorphanol  tartrate)	Orion Pharma	N/A	1 mg/kg
CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 35-mm	Greiner Bio-One	627160
CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 60-mm	Greiner Bio-One	628160
CellTram Oil	Eppendorf	5176 000.025
Cepetor (Medetomidine) 1 mg/ml	cp-pharma	N/A	0.5 mg/kg
Chorulon, Human Chorionic Gonadotrophin	Intervet	N/A	150 IU/ ml ml 0.9% NaCl
DMEM low glucose	Sigma Aldrich	D6048
DNase, RNase-free	A&A Biotechnology	1009-100
EmbryoMax Filtered Light Mineral Oil	Sigma	ES-005-C
Envelope protein coding plasmid for lentiviral vectors (VSVg plasmid)	ADDGENE	14888
FemtoJet	Eppendorf	4i /5252 000.013
Fetal Bovine Serum	Sigma Aldrich	F9665-500ML
Folligon, Pregnant Mare’s Serum Gonadotropin	Intervet	N/A	125 IU/ml in .9% NaCl
HEK 293T cells	ATCC	ATCC CRL-3216
Hyaluronidase from Bovine Testis	Sigma	H4272-30MG	0.5 mg/ml in M2 medium
Inverted Microscope	Zeiss	Axiovert 200
Ketamine 100mg/ml	Biowet Pulawy	N/A	50 mg/kg
Liquid Paraffin	Merck Millipore	8042-47-5
M16 medium EmbryoMax	Sigma	MR-016-D
M2 medium	Sigma	M7167
Magnesium Chloride 1M	Sigma Aldrich	63069-100ML
Microforge	Narishige	MF-900
Mineral Oil	Sigma	M8410-500ML
NaCl 0.9%	POLPHARMA OTC	N/A	sterile, 5ml ampules
Operation microscope	Inami Ophthalmic Instruments	Deca-21
Packaging system coding plasmid for lentiviral vectors  (delta R8.2 plasmid)	ADDGENE	12263
PEI reagent (Polyethylenimine, Mw ~ 25,000,),	Polysciences, Inc	23966-1
Penicilin-streptomycin	Sigma Aldrich	P0781-100ML
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture	Sigma Aldrich	806552-500ML
Puller	Sutter Instrument Co.	P-97
Reflex Clip Applier/Reflex Clips	World Precision Instruments	500345/500346
Safil, polyglycolic acid, braided, coated, absorbable threads	B.Braun Surgical	1048029
Stereomicroscope	Olympus	SZX16
Surgical Sewing Thread	B.Braun	C1048040
SYBR Green PCR Master Mix	Applied Biosystem	4334973
Tolfedine 4% (tolfenamic acid)	Vetoquinol	N/A	2 mg/kg
TransferMan NK2	Eppendorf	N/A
Trypsin EDTA solution	Sigma Aldrich	T3924-500ML
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima L-100 XP
VacuTip	Eppendorf	5175108.000	holders capillary
Vita-POS	Ursapharm	N/A	eye ointment
Warming Plate	Semic	N/A
Watchmaker Forceps	VWR	470018-868