Geração de ratos transgênicos usando uma abordagem vetorial lentiviral

Resumo

Este artigo tem como objetivo fornecer a metodologia para transgênese lentiviral em embriões de ratos usando múltiplas injeções de uma suspensão do vírus no espaço de perivitelline zigogote. Ratos fêmeas que são acasalados com uma cepa masculina fértil com uma cor de pele dominante diferente é usado para gerar mães adotivas pseudográvidas.

Resumo

Modelos animais transgênicos são fundamentalmente importantes para a pesquisa biomédica moderna. A incorporação de genes estrangeiros em embriões de camundongos ou ratos primitivos é uma ferramenta inestimável para a análise da função genética em organismos vivos. O método de transgênese padrão é baseado na microinjeção de fragmentos de DNA estranho susceptante em um pronúcleo de um oócito fertilizado. Esta técnica é amplamente utilizada em camundongos, mas permanece relativamente ineficiente e tecnicamente exigente em outras espécies animais. O transgene também pode ser introduzido em embriões em estágio unicelular através de infecção lentiviral, fornecendo uma alternativa eficaz às injeções pronuclears padrão, especialmente em espécies ou cepas com uma estrutura de embriões mais desafiadora. Nesta abordagem, uma suspensão que contém vetores lentivirais é injetada no espaço perivitelline de um embrião de rato fertilizado, que é tecnicamente menos exigente e tem uma taxa de sucesso maior. Os vetores lentivirais mostraram incorporar eficientemente o transgene no genoma para determinar a geração de linhas transgênicas estáveis. Apesar de algumas limitações (por exemplo, requisitos de Biossegurança Nível 2, limites de tamanho do fragmento de DNA), a transgênese lentiviral é um método de transgênese rápida e eficiente. Além disso, o uso de ratos fêmeas que são acasalados com uma cepa masculina fértil com uma cor de pele dominante diferente é apresentado como uma alternativa para gerar mães adotivas pseudográvidas.

Introdução

Por muitos anos, roedores de laboratório, como ratos e camundongos, têm sido usados para modelar condições fisiológicas e patológicas humanas. A pesquisa em animais levou a descobertas que eram inatingíveis por qualquer outro meio. Inicialmente, estudos genéticos se concentraram na análise de distúrbios e fenótipos de ocorrência espontânea que são considerados para imitar de perto a condição humana¹. O desenvolvimento de métodos de engenharia genética permitiu a introdução ou exclusão de genes específicos para obter um fenótipo desejado. Portanto, a geração de animais transgênicos é reconhecida como uma técnica fundamental na pesquisa moderna que permite estudos da função genética em organismos vivos.

A tecnologia animal transgênica tornou-se possível através de uma combinação de realizações em embriologia experimental e biologia molecular. Na década de 1960, o embriologista polonês A. K. Tarkowski publicou o primeiro trabalho sobre manipulação de embriões de camundongos durante os estágios iniciais do desenvolvimento². Além disso, biólogos moleculares desenvolveram técnicas para gerar vetores de DNA (ou seja, portadores) para a introdução entre outros de DNA estranho no genoma do animal. Esses vetores permitem a propagação de genes selecionados e sua modificação apropriada, dependendo do tipo de pesquisa que é realizada. O termo "animal transgênico" foi introduzido por Gordon e Ruddle³.

A primeira espécie amplamente aceita que foi usada em neurobiologia, fisiologia, farmacologia, toxicologia e muitos outros campos das ciências biológicas e médicas foi o rato norueguês Rattus norvegicus⁴. No entanto, devido à dificuldade em manipular embriões de ratos, o rato musculus da casa tornou-se a espécie animal dominante na pesquisa genética⁵. Outra razão para a primazia do camundongo em tal pesquisa foi a disponibilidade de tecnologia de células-tronco embrionárias para gerar animais eliminados para esta espécie. A técnica mais utilizada de transgênese (2-10% dos descendentes transgênicos em relação a todos os animais nascidos) é a microinjeção de fragmentos de DNA em um pronúcleo de um oócito fertilizado. Em 1990, essa abordagem, que foi introduzida pela primeira vez em camundongos, foi adaptada para ratos^6,7. A transgênese de ratos por injeção pronuclear é caracterizada pela menor eficiência⁸ em relação aos camundongos, o que está estritamente relacionado com a presença de plasma elástico e^membranaspronuclear9 . Embora a sobrevivência dos embriões após a manipulação seja 40-50% menor do que em camundongos, essa técnica é considerada um padrão na geração de ratos geneticamente modificados¹⁰. Abordagens alternativas que podem garantir a incorporação transgênica eficiente e maiores taxas de sobrevivência de zigotes injetados têm sido investigadas.

O principal determinante da expressão transgênica estável e transmissão à prole é sua integração ao genoma celular hospedeiro. Os lentivírus (LVs) têm a característica distinta de serem capazes de infectar células divisórias e não divisórias. Seu uso como ferramenta para a incorporação de genes heterólogos em embriões provou ser altamente eficiente¹¹, e os indivíduos transgênicos são caracterizados pela expressão estável do fragmento de DNA incorporado. A eficácia dos vetores lentivirais foi confirmada para a modificação genética de camundongos^12,13, ratos^12,14, e outras espécies¹¹. Neste método, a suspensão lv é injetada sob a zona pellucida do embrião na fase de dois pronucleis. Esta técnica essencialmente garante 100% de sobrevivência dos embriões porque o oolema permanece inalterado. A produção de suspensões lv de alta qualidade e relativamente altamente concentradas são fatores cruciais. No entanto, concentrações mais baixas de suspensões de LV podem ser superadas por injeções repetidas¹¹, o que aumenta a quantidade de partículas virais na superfície do ovo, sem afetar a integração da membrana. Embriões que são submetidos a injeções repetidas no espaço perivitelline desenvolvem-se ainda mais, e descendentes transgênicos podem transmitir o transgene através da germinação. A eficiência da geração transgênica de ratos por transgênese lentiviral pode ser de até 80%¹².

Aqui, descrevemos a produção de lentivírus recombinante derivado do HIV-1 que foi pseudodigitado com proteína envelope de estomatite vesicular (VSV) G. O uso do pseudotipo VSV de segunda geração determina a ampla infectividade das partículas virais e permite a produção de vetores altamente estáveis que podem ser concentrados por ultracentrifugação e criopreservação. Após a verificação do título, os vetores estão prontos para serem usados como um veículo para a entrega de transgênicos em zigotes de rato Albino Wistar. Após uma série de injeções, os embriões podem ser cultivados durante a noite e transferidos no estágio de duas células para mães adotivas. Neste ponto, uma das duas abordagens alternativas pode ser considerada. O procedimento padrão utiliza fêmeas pseudográvidas como receptores de embriões. No entanto, quando a taxa de gravidez é baixa após o acasalamento com machos vasectomizados, os embriões podem ser implantados em fêmeas grávidas wistar/sprague-dawley (SD) que são acasaladas com ratos machos férteis com uma cor de pele escura (por exemplo, ratos da Noruega Marrom [BN)." A cor da pele permite a distinção da prole da gravidez natural de descendentes que se originam dos embriões manipulados transferidos.

Protocolo

A produção e aplicação de vetores virais estava de acordo com as diretrizes do Nível 2 de Biossegurança e foi aprovada pelo Ministério do Meio Ambiente polonês. Todos os procedimentos experimentais em animais descritos abaixo foram aprovados pelo Comitê Deética Local. Os animais foram alojados em gaiolas ventiladas individualmente a uma temperatura estável (21-23 °C) e umidade (50-60%) com acesso a ad libitum à água e alimentos sob um ciclo de luz/escuridão de 12 h/12 h.

1. Produção de vetores lentivirais

1. Transfecção de células HEK 293T
   NOTA: O protocolo aqui apresentado é projetado para a transfecção de vinte pratos de cultura Ø10 cm que produz aproximadamente 200 mL de sobrenadante vetorial bruto.
   1. Células DE Cultura HEK 293T no meio DMEM que é suplementada com soro bovino fetal (10%, v/v) em uma incubadora de CO₂ umidificada a 37 °C. Para a transfecção, prepare vinte placas de 10 cm de diâmetro e sementes 1,5-2 x 10⁶ HEK 293T células por prato.
   2. Quando a confluência atinge ~70%, transfectas as células que utilizam reagente de polietilenoina (PEI), pH 7.0, a uma razão de 3 μg de PEI por 1 μg de DNA.
      1. Prepare a mistura de transfecção para cinco pratos (prepare o número de repetições de acordo com o número total de pratos). A 1 mL do Meio Águia Modificada de Dulbecco (DMEM; sem soro), adicione a mistura de três plasmídeos para que atinjam uma quantidade final de 25 μg de plasmídeo VSVg, 50 μg de delta R8.2 e 50 μg de plasmídeo de codificação.
      2. Pipeta para cima e para baixo, e adicione 125 μL de PEI a uma concentração de 3 μg/μL. Incubar em temperatura ambiente por 15 min, invertendo o tubo três vezes durante a incubação. Adicione 200 μL da mistura de transfecção por placa. Em seguida, incubar as placas em uma incubadora de CO₂ umidificada a 37 °C.
2. Concentração de vetores lentivirais
   1. Quarenta e oito horas após a transfecção, colher o meio que contém partículas lv. Use tubos cônicos de 50 mL.
      NOTA: Ao usar um plasmídeo com uma etiqueta fluorescente, as células podem ser visualizadas neste momento para verificar a eficiência da transfecção. Uma nova porção do meio DMEM pode ser adicionada, e as células podem ser incubadas por mais 24 horas. O rendimento de LV é comparável quando coletado nos pontos de tempo de 48 e 72 h após a transfecção.
   2. Centrifugar o meio a 3.000 xg por 5 min e temperatura ambiente para remover células separadas.
   3. Filtre o sobrenadante (0,45 μm) e despeje-o em novos tubos.
      NOTA: Esta etapa pode ser omitida.
   4. Adicione DNase I (livre de RNase, 1 μg/mL) e MgCl₂ (1 mM), e incubar em banho-maria a 37 °C por 15 min.
   5. Transfira os tubos de polietileno médio para descartáveis e a ultracentrífuga em um rotor oscilante a 115.000 x g e 4 °C por 1,5 h.
   6. Após o centrifugação, drene suavemente as paredes dos tubos dos resíduos médios.
   7. Mergulhe a pelota com solução salina tampoada por fosfato estéril (PBS; 70-80 μL por tubo).
   8. Incubar por 2 h a 4-8 °C.
   9. Resuspenda os vetores virais na PBS por pipetting suave.
      ATENÇÃO: Evite espumar.
   10. Transfira para um tubo de centrífuga de 1,5 mL e centrífuga a 7.000 x g e 4 °C por 30 s. Transfira o sobrenadante para um novo tubo. Repita este passo até que nenhuma pelota de detritos celulares esteja visível.
   11. Alíquota e congele a -80 °C. Evite recongelar a alíquota lv.
3. Determinação do título de vírus usando reação quantitativa da cadeia de polimerase
   NOTA: A titulação dos vetores virais é realizada utilizando PCR quantitativo (qPCR). Este método baseia-se na amplificação de um fragmento de DNA de 84 bp de comprimento de dupla retinência dentro da longa região de repetição terminal do genoma viral¹⁵.
   1. Prepare a curva padrão fazendo diluições seriais do plasmídeo codificador de LV: 1:500, 1:1.000, 1:5.000, 1:10.000, 1:100.000 e 1:1.000.000. Determine o número de cópias do plasmídeo usado para a curva padrão. Use a seguinte fórmula: número de cópias/μL = (concentração [g/μL] x 6,02 x 10²³ [número/mol]) / (660 [g/mol] x tamanho plasmídeo [bp]), onde 6,02 x 10²³ número/mol é o número de Avogadro, e 660 g/mol é o peso da bp.
      NOTA: Podem ser utilizadas calculadoras de números de cópia on-line.
   2. Preparar diluições da suspensão lentiviral: 1:100, 1:500 e 1:1.000.
   3. Prepare a mistura de reação (volumes por poço): 10 μL de qPCR Mastermix, 1 μL de 10 μM Forward primer, 1 μL de 10 μM de primer reverso e 7 μL de H₂O. Pipeette a mistura nos poços de 96-well placas.
      NOTA: Primer dianteiro: 5'-AGCTTGCCTTGAGTGCTTCa. Primer reverso: 5'-TGACTAAAAGGGTCTGAGGGA.
   4. Adicione 1 μL de cada diluição padrão e suspensão lentiviral em triplicado.
   5. Execute o qPCR de acordo com os seguintes parâmetros: 50 °C para 2 min, 96 °C para 5 min e 35 ciclos de 96 °C para 20 s, 60 °C para 40 s e 70 °C para 1 min, seguido de estágio de curva de derretimento: 95 °C para 1 min e 60 °C a 30 s.
   6. Analise os resultados comparando o número de moléculas recebidas para cada diluição à curva padrão. Determine a concentração de moléculas vetores como a média de três réplicas para cada diluição.
      NOTA: A quantificação apresentada proporciona a concentração física das partículas virais. Não deve ser tratado como um título funcional.

2. Geração de ratos transgênicos

1. Superovulação e coleta de embriões fertilizados
   1. Administre gonadotropinas.
      NOTA: Para aumentar o número de embriões coletados (aproximadamente 30 por fêmea), use fêmeas Wistar imaturas de 5 semanas de idade para estimulação hormonal.
      1. No dia 1 (12:00-1PM), injete intraperitoneicamente o soro de égua grávida gonadotropina (PMSG; 25 UI por fêmea). Preparar alíquotas de 1 mL de solução de trabalho em uma concentração de 125 UI/mL dissolvendo o pó hormonal em 0,9% naCl. Armazene a -20 °C por até 1 mês ou -80 °C por até 6 meses.
      2. No dia 3 (12 PM-1 PM), injete intraperitoneicamente gonadotrophina coriônica humana (hCG; 30 UI por fêmea). Preparar alíquotas de 1 mL de solução de trabalho (150 UI/mL) dissolvendo o pó hormonal em 0,9% de NaCl. Armazene a -20 °C por até 1 mês ou -80 °C por até 6 meses.
   2. Após a administração do HCG, mate fêmeas 1:1 com machos sexualmente férteis (3-10 meses de idade).
   3. Na manhã seguinte (dia 4 às 8-10 am), verifique as fêmeas para a presença de um plug vaginal. Verifique a abertura vaginal para a presença de um plugue de acasalamento esbranquiçado, que para melhor visualização deve ser verificado no início da manhã após a noite de acasalamento. Para a coleta de embriões, utilize apenas fêmeas com um plugue visível.
   4. Coletar embriões às 10 da manhã. Sacrifique os animais para extirpar os ovidutos, e colete os ovidutos em um prato com meio M2 pré-aquecido.
      1. Transfira os ovidutos para um prato de 35 mm que contenha meio M2 pré-aquecido com hialuronidase de testículos bovinos a uma concentração de 0,5 mg/mL.
      2. Abra as paredes do oviduto usando pinças finas sob um microscópio enomicroscópio e pressione a ampulla (ou seja, a parte inchada do oviduto que contém embriões fertilizados que estão cercados por células cumulus) até que os embriões sejam liberados.
         NOTA: A hialuronidase digere enzimáticamente as células cumulus, liberando embriões.
         ATENÇÃO: A exposição prolongada à hialuronidase é deletério aos embriões; portanto, este passo não deve durar mais do que 5 min.
      3. Para facilitar a liberação de embriões de células cumulus, tubos suavemente para cima e para baixo usando uma pipeta de transferência de vidro que é conectada a um tubo aspirador operado pela boca.
         1. Para produzir a pipeta de transferência, puxe uma pipeta pasteur de vidro sobre uma chama para produzir uma ponta reta ~5-10 cm. Quebre a pipeta deixando uma ponta de ~4 cm.
      4. Lave os embriões algumas vezes em meio M2 para remover os detritos hialuronidase e celular. Transfira os embriões para um prato de 60 mm que contenha (~50 μL) gotas de meio M16 pré-equilibrado, coberto por parafina líquida ou óleo mineral, em uma incubadora de 37 °C umidificada com uma atmosfera de 5% de CO_2.
2. Microinjeção de vetores lentivirais em embrião em estágio unicelular sob a zona pellucida
   NOTA: Use embriões em estágio unicelular com duas pronucéis visíveis para microinjeção (Figura 1).
   1. Descongele a alíquota LV à temperatura ambiente e centrífuga a 10.000 x g e RT por 2 min para pellet quaisquer detritos celulares restantes.
   2. Configuração de microinjeção
      1. Prepare as pipetas de retenção de vidro (capilar de vidro borossilicato) usando uma microforge. Puxe o vidro capilar sobre uma chama para produzir uma ponta de 5 a 10 cm. Quebre a pipeta deixando uma ponta de ~4 cm. O diâmetro externo deve ser de ~80-120 μm.
         NOTA: Certifique-se de que a ponta da pipeta é perfeitamente reta e lisa.
      2. Monte a pipeta puxada em uma microforge com a ponta na frente do filamento de aquecimento. Aqueça o filamento muito perto da ponta da pipeta e deixe-o encolher para um diâmetro de ~15 μm (aproximadamente 20% do tamanho do embrião). Posicione a pipeta perpendicularmente ao filamento de aquecimento, a 2-3 mm da ponta da pipeta, e comece a aquecer. O vidro vai amolecer. Aqueça até atingir um ângulo de 15°.
      3. Prepare capilares de vidro borosilicato de microinjeção com um filamento usando um puxador de pipeta. Insira o capilar na câmara de puxar. Execute um teste de rampa (pela primeira vez para vidro novo e todas as vezes depois de trocar o filamento). Defina o Calor para o valor de rampa -10, Puxe para 100, Velocity para 150 e Time para 100.
         NOTA: Modifique os parâmetros para obter um capilar de injeção ideal.
      4. Sob uma coifa de fluxo laminar biossafety, carregue aproximadamente 2 μL da solução viral na pipeta de microinjeção com uma ponta de microcarregador.
      5. Prepare uma placa de microinjeção (tampa de placa de Petri de 60 mm) com uma gota de 100 μL de médio M2 (no meio), coberta por parafina líquida ou óleo mineral.
      6. Monte a pipeta de retenção e o capilar de microinjeção que é carregado com solução viral para um micromanipulador e microinjeção prato sob um microscópio invertido.
   3. Faça a microinjeção.
      1. Transfira 15-20 embriões de estágio unicelular para a queda de M2 na antena de microinjeção. Segure o embrião usando uma pipeta de retenção.
      2. Utilizando a ampliação de 400x, injete a solução LV sob a zona pellucida para o espaço perivitelline usando o capilar de vidro que é conectado a um injetor automático. Segure o capilar sob a zona pellucida por um momento.
         NOTA: Usando pressão positiva suave, a solução viral fluirá continuamente para fora da capilar de injeção, mas o volume da suspensão que é entregue não pode ser controlado.
      3. Usando uma pipeta fina, devolva os embriões ao prato de cultura na incubadora a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO_2. O número de injeções de um zigoto pode variar e pode ser adaptado com base na concentração de vetores virais.
         NOTA: Os embriões injetados podem ser transferidos para mães adotivas em estágio unicelular ou O/N incubados em meio M16 antes de serem transferidos no estágio de duas células. A cultura in vitro prolongada dos embriões de ratos deve ser evitada.
3. Transferência de embriões injetados para mães adotivas
   1. Preparar mães adotivas acasalando fêmeas sd sexualmente maduras com machos fértil sd ou com machos sd vasectomizados (o procedimento de vasectomia é descrito na seção 3 abaixo) no dia 3 (para transferência de embriões em estágio de uma célula) ou dia 4 (para transferência de embriões no estágio de duas células).
      NOTA: Para a transferência de ovidutos, use 0,5 dias pós-coito (dpc) femininos.
   2. Na manhã seguinte, verifique as fêmeas da SD para um plugvaginal, e use apenas aquelas com um plugue visível.
   3. Realizar transferência de embriões.
      NOTA: Conduzir o procedimento cirúrgico com instrumentos estéreis sob um microscópio estereomicroscópio. Antes do dia da cirurgia, tesoura autoclave, fórceps finos, porta-agulhas e suporte de bisturi.
      1. Anestesiar uma fêmea com i.p. administração de cetamina (50 mg/kg) e medetomidina (0,5 mg/kg) solução. Teste para reflexos para confirmar a anestesia antes de iniciar o procedimento cirúrgico.
      2. Injete o animal subcutâneamente com ácido tolefenâmico (2 mg/kg), tarrato de butorphanol (1 mg/kg) e enrofloksacina (5-10 mg/kg) para prevenir inflamação, dor e infecção, respectivamente.
      3. Aplique lubrificação de pomada oftálmica em ambos os olhos para evitar a secagem da córnea. Raspe a pele das costas e esterilize a pele com esfoliante cirúrgico seguido de 70% de álcool usando almofadas não aderentes estéreis. Deixe a pele secar.
      4. Injete o animal subcutâneamente com 100 μL de bupivacaína (anestésico local) no local da incisão. Transfira o animal em posição propensa a uma superfície limpa em uma almofada de aquecimento sob o objetivo de um microscópio cirúrgico. Cubra o rato com uma cortina estéril com um pequeno orifício cortado na parte inferior das costas.
      5. Realize uma incisão cutânea de aproximadamente 2 cm, paralela à coluna vertebral lombar.
      6. Usando uma tesoura afiada, faça um corte na parede abdominal. Pegue uma almofada de gordura ovariana usando fórceps, retire o ovário e o oviduto e coloque-os em gaze que é molhada com 0,9% de NaCl.
      7. Aspirar m2 médio, três bolhas de ar, e os embriões para a transferência capilar. Número total recomendado de embriões a serem transferidos (unilaterais ou bilaterais): fêmea grávida (≤ 15-16 embriões), fêmea pseudográvida (≤ 30 embriões).
      8. Faça uma pequena incisão no oviduto (entre o infíbulo e a ampulla) usando microtesoura, e insira a pipeta de transferência no oviduto.
      9. Expulse suavemente embriões e bolhas de ar da pipeta para o oviduto. Com fórceps contundentes, coloque o trato reprodutivo de volta na cavidade abdominal.
      10. Suturar a parede abdominal com suturas absorvíveis de ácido poliglicólico e fechar a incisão da pele com clipes de ferida. Dependendo do número de embriões disponíveis, repita este procedimento para o outro oviduto.
      11. Injete o animal intraperitonealmente com atipamezol (0,5 mg/kg) para reverter o efeito da anestesia.
      12. Transfira o animal para uma gaiola limpa e mantenha-o em uma placa de aquecimento para se recuperar totalmente da anestesia. A entrega em ratos ocorre após ~21 dias.
          NOTA: Quando os ratos BN machos são usados para acasalamento, apenas os filhotes brancos são potencialmente transgênicos; filhotes marrons são de gravidez natural.
      13. Coletar fragmentos de tecido (de preferência da orelha) para filhotes de 3 semanas de idade.

3. Vasectomia

NOTA: Antes do dia da cirurgia, tesoura autoclave, fórceps finos e porta agulha.

1. Anestesiar um rato SD macho de 5 semanas de idade com administração i.p. de cetamina (50 mg/kg) e medetomidina (0,5 mg/kg) solução. Teste para reflexos para confirmar a anestesia antes de iniciar o procedimento cirúrgico.
2. Administrar ácido tolfenamico (2 mg/kg), tartar butorphanol (1 mg/kg) e enrofloksacina (5-10 mg/kg) subcutâneamente para prevenir inflamação, dor e infecção, respectivamente.
3. Aplique lubrificação de pomada oftálmica em ambos os olhos para evitar a secagem da córnea. Coloque o supino de rato sobre uma superfície limpa em uma almofada de aquecimento, e esterilize a pele nos testículos com esfoliante cirúrgico seguido de 70% de álcool usando almofadas não aderentes estéreis. Deixe a pele secar. Cubra o rato com uma cortina estéril com um pequeno buraco cortado sobre os testículos. Pressione suavemente o abdômen para expor os testículos no saco escrotal.
4. Usando uma tesoura cirúrgica, faça uma incisão de ~0,5 cm no meio do saco escrotal. Localize a parede da linha média (linha esbranquiçada) entre os testículos.
5. Faça uma incisão de 5 mm na membrana de testículo perto do lado esquerdo da parede da linha média.
6. Empurre cuidadosamente o testículo para a esquerda e localize vas deferens (entre o testículo e a linha média) como um ducto branco com um único vaso sanguíneo.
7. Puxe suavemente os vasos deferentes do saco escrotal usando os fórceps de um relojoeiro. Segure os vasos deferentes com um par de fórceps, e corte-o com uma tesoura fina (ou cauterize com pontas vermelhas de um segundo par de fórceps). Remova um fragmento de ~1 cm do duto.
   NOTA: Se a cauterização for realizada, segure a ponta do segundo par de fórceps na chama.
8. Repita o procedimento acima para os outros testículos. Suturar a pele com suturas absorvíveis de ácido poliglicólico e injetar o animal intraperitonealmente com atipamezol (0,5 mg/kg).
9. Coloque o rato em uma gaiola limpa em uma placa de aquecimento até que o animal se recupere da anestesia.
   NOTA: Os machos podem ser usados nos acasalamentos de teste após um período de recuperação de ~2 semanas. Depois que a esterilidade for confirmada, eles podem ser usados para indução de pseudogravidez.

Resultados

Utilizando-se o protocolo descrito aqui, foram produzidos vetores lentivirais que carregavam o construto Syn-TDP-43-eGFP (título de LV físico = 3,4 x 10⁸/μL) e, em seguida, poderiam ser utilizados para injeções subzonais de embriões em estágio de célula. Apenas embriões com duas pronucéis visíveis foram submetidos ao procedimento. O número de injeções de suspensões virais foi determinado experimentalmente. Alta eficiência de implantação e falta simultânea de descendentes transgênicos foram ...

Discussão

Os avanços nas tecnologias transgênicas tornaram os modelos de roedores uma ferramenta inestimável na pesquisa biomédica. Eles oferecem a oportunidade de estudar relações genótipo-fenótipo in vivo. Aqui, apresentamos uma alternativa amplamente disponível para transgênese convencional por injeções pronucleares. O uso da transdução do gene lentiviral ignora a necessidade de exigir microinjeções porque vetores virais podem ser injetados sob a zona pellucida. Essa abordagem não afeta a integridade do embriã...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
7500 Real Time PCR System	Applied Biosystems
Aerrane (isoflurane)	Baxter	FDG9623
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes	Sigma	A5177-5EA
Atipam 5 mg/ml	Eurovet Animal Health BV	N/A	0.5 mg/kg
Baytril 25 mg/ml (enrofloksacin)	Bayer	N/A	5-10 mg/kg
Borosilicate glass capillaries with filament GC100TF-15	Harvard Apparatus Limited	30-0039	injection capillary
Bupivacaine 25 mg/ml	Advanz Pharma	N/A	0.25% in  0.9% NaCl
Butomidor 10 mg/ml (butorphanol  tartrate)	Orion Pharma	N/A	1 mg/kg
CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 35-mm	Greiner Bio-One	627160
CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 60-mm	Greiner Bio-One	628160
CellTram Oil	Eppendorf	5176 000.025
Cepetor (Medetomidine) 1 mg/ml	cp-pharma	N/A	0.5 mg/kg
Chorulon, Human Chorionic Gonadotrophin	Intervet	N/A	150 IU/ ml ml 0.9% NaCl
DMEM low glucose	Sigma Aldrich	D6048
DNase, RNase-free	A&A Biotechnology	1009-100
EmbryoMax Filtered Light Mineral Oil	Sigma	ES-005-C
Envelope protein coding plasmid for lentiviral vectors (VSVg plasmid)	ADDGENE	14888
FemtoJet	Eppendorf	4i /5252 000.013
Fetal Bovine Serum	Sigma Aldrich	F9665-500ML
Folligon, Pregnant Mare’s Serum Gonadotropin	Intervet	N/A	125 IU/ml in .9% NaCl
HEK 293T cells	ATCC	ATCC CRL-3216
Hyaluronidase from Bovine Testis	Sigma	H4272-30MG	0.5 mg/ml in M2 medium
Inverted Microscope	Zeiss	Axiovert 200
Ketamine 100mg/ml	Biowet Pulawy	N/A	50 mg/kg
Liquid Paraffin	Merck Millipore	8042-47-5
M16 medium EmbryoMax	Sigma	MR-016-D
M2 medium	Sigma	M7167
Magnesium Chloride 1M	Sigma Aldrich	63069-100ML
Microforge	Narishige	MF-900
Mineral Oil	Sigma	M8410-500ML
NaCl 0.9%	POLPHARMA OTC	N/A	sterile, 5ml ampules
Operation microscope	Inami Ophthalmic Instruments	Deca-21
Packaging system coding plasmid for lentiviral vectors  (delta R8.2 plasmid)	ADDGENE	12263
PEI reagent (Polyethylenimine, Mw ~ 25,000,),	Polysciences, Inc	23966-1
Penicilin-streptomycin	Sigma Aldrich	P0781-100ML
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture	Sigma Aldrich	806552-500ML
Puller	Sutter Instrument Co.	P-97
Reflex Clip Applier/Reflex Clips	World Precision Instruments	500345/500346
Safil, polyglycolic acid, braided, coated, absorbable threads	B.Braun Surgical	1048029
Stereomicroscope	Olympus	SZX16
Surgical Sewing Thread	B.Braun	C1048040
SYBR Green PCR Master Mix	Applied Biosystem	4334973
Tolfedine 4% (tolfenamic acid)	Vetoquinol	N/A	2 mg/kg
TransferMan NK2	Eppendorf	N/A
Trypsin EDTA solution	Sigma Aldrich	T3924-500ML
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima L-100 XP
VacuTip	Eppendorf	5175108.000	holders capillary
Vita-POS	Ursapharm	N/A	eye ointment
Warming Plate	Semic	N/A
Watchmaker Forceps	VWR	470018-868