Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מאמר זה שואפת לספק את המתודולוגיה עבור הטרנסגנזה לעדשה של עוברי החולדה באמצעות זריקות מרובות של השעיית וירוס לתוך החלל perivitelline הזיטה. חולדות נשים הזדווג עם זן גברי פורה עם צבע פרווה דומיננטי שונה משמש להפקת אמהות pseudopregnant אומנה.

Abstract

מודלים בעלי חיים טרנסגניים חשובים ביסודם למחקר ביו-רפואי מודרני. השילוב של גנים זרים לתוך העכבר מוקדם או עוברי חולדה הוא כלי רב-ערך עבור ניתוח תפקודי גנים אורגניזמים חיים. שיטת הטרנסגנזה הסטנדרטית מבוססת על מיקרוהזרקת דנ א שברי זר לתוך כמובן של מופרית. טכניקה זו משמשת רבות בעכברים אך נותרת בלתי יעילה יחסית ותובענית מבחינה טכנית במינים אחרים של בעלי חיים. הטרנסגנים ניתן גם להציג לתוך העוברים בשלב תא אחד דרך זיהום ויראלי, מתן חלופה יעילה הזריקות ברור סטנדרטי, במיוחד מינים או זנים עם מבנה העובר מאתגרת יותר. בגישה זו, השעיה המכילה וקטורים מוזרקים מוזרק לתוך החלל הפריבינאי של עובר חולדה מופרית, שהוא מבחינה טכנית פחות תובענית ויש לו שיעור הצלחה גבוה יותר. וקטורים לנטינגיליים הוכחו ביעילות לשלב את הטרנסגנים לתוך הגנום כדי לקבוע את הדור של קווים טרנסגניים יציבים. למרות מספר מגבלות (לדוגמה, ביובטיחות ברמה 2 דרישות, מגבלות גודל קטע ה-DNA), הטרנסלונגילוגיה היא שיטת טרנסגנזה מהירה ויעילה. בנוסף, שימוש בעכברושים נשיים שהוזדווג עם זן גברי פורה עם צבע פרווה דומיננטי שונה מוצג כחלופה להפקת אמהות pseudopregnant אומנה.

Introduction

במשך שנים רבות, מכרסמים מעבדה, כגון חולדות ועכברים, נעשה שימוש כדי לעצב את התנאים הפיזיולוגיים והפתולוגיים האנושיים. מחקר בעלי חיים הוביל לתגליות שאינן מהשגה בכל אמצעי אחר. בתחילה, מחקרים גנטיים התמקדו ניתוח של הפרעות התרחשות ספונטנית ופנוטיפים הנחשבים הדוק לחקות את המצב האנושי1. התפתחות שיטות גנטיות הנדסה אפשרה הקדמה או מחיקה של גנים ספציפיים כדי לקבל פנוטיפ הרצוי. לכן, הדור של בעלי חיים טרנסגניים מזוהה כטכניקה יסודית במחקר המודרני המאפשר מחקרים של תפקוד גנים באורגניזמים חיים.

טכנולוגיית החיות הטרנסגנית הפכה לאפשרית באמצעות שילוב של הישגים באמבריולוגיה ניסיוני ובביולוגיה מולקולרית. בשנות ה-60, הפולני embryologist א. טרקובסקי לפרסם את העבודה הראשונה על מניפולציה העובר העכבר בשלבים המוקדמים של פיתוח2. בנוסף, ביולוגים מולקולריים פיתחו טכניקות כדי ליצור וקטורים DNA (כלומר, נושאות) עבור הקדמה בין היתר של DNA זר לתוך הגנום של בעל החיים. וקטורים אלה מאפשרים את התפשטות הגנים הנבחרים ואת השינוי המתאים להם, בהתאם לסוג המחקר שנערך. המונח "חיה טרנסגניים" הוצג על ידי גורדון ורודל3.

המינים המקובלים הראשונים ששימשו לנוירוביולוגיה, פיזיולוגיה, פרמקולוגיה, טוקסיקולוגיה, ותחומים רבים אחרים של מדעים ביולוגיים ומדעי הרפואה היו החולדה הנורבגית, ראאוס נורבקוס4. עם זאת, בגלל הקושי לתמרן עוברי חולדה, עכבר הבית Mus מוסקולוס הפך להיות מינים דומיננטי בעלי חיים במחקר גנטי5. סיבה נוספת של העליונות של העכבר במחקר כזה היה הזמינות של הטכנולוגיה תא גזע מעובריים כדי ליצור חיות מהממת עבור מין זה. הטכניקה הנפוצה ביותר של טרנסגנזה (2 – 10% מהצאצאים הטרנסגניים ביחס לכל בעלי החיים הנולדים) היא המיקרו-הזרקה של שברי הדי. אנ. איי. ב-1990, גישה זו, שהוצגה לראשונה בעכברים, הותאמה לחולדות6,7. שינוי חולדה על ידי הזרקה ברורה מאופיין ביעילות נמוכה יותר8 לעומת עכברים, אשר קשורה בקפדנות לנוכחות של פלזמה אלסטי וממברנות9. למרות ההישרדות של העוברים לאחר מניפולציה היא 40-50% נמוך יותר בעכברים, טכניקה זו נחשבת תקן בדור של חולדות מהונדסים גנטית10. גישות חלופיות שיכולות להבטיח התאגדות העברה יעילה של טרנסגנים ושיעורי הישרדות גבוהים יותר של הזיטים מוזרק נחקרו.

דטרמיננטת המפתח של ביטוי הטרנסגנים יציב ושידור צאצאים הוא השילוב שלה לתוך הגנום התא המארח. לאנטי וירוסים (LVs) יש את התכונה הייחודית של להיות מסוגל להדביק את שני התאים חלוקה ושאינם מפרידים. השימוש שלהם ככלי לשילוב של גנים הטרוולוגיים לעוברים הוכחו להיות יעילים מאוד11, ואנשים הטרנסגניים מאופיינים ביטוי יציב של מקטע ה-DNA משולב. היעילות של וקטורים לונגיליים אושרה עבור השינוי הגנטי של עכברים12,13, חולדות12,14, ומינים אחרים11. בשיטה זו, ההשעיה LV מוזרק תחת הסונה ולוצידה של העובר בשלב של שתי שיטות. טכניקה זו מבטיחה ביסודו של 100% את ההישרדות של העוברים משום שהלמת אינו מושפע. הייצור של שתלים LV באיכות גבוהה ומרוכזים יחסית הם גורמים חיוניים. עם זאת, ריכוזים נמוכים יותר של השעיות LV ניתן להתגבר על ידי הזריקות חוזרות11, אשר מגדיל את כמות החלקיקים ויראלי על פני הביצה בעוד לא להשפיע על שילוב ממברנה. עוברים החשופים זריקות חוזרות לחלל perivitelline לפתח עוד, והצאצאים הטרנסגניים יכולים לשדר את הטרנסגנים דרך germline. היעילות של דור החולדה הטרנסגניים על ידי הטרנסגנזה של הנגיף יכולה להיות גבוהה כמו 80%12.

כאן, אנו מתארים את הייצור של HIV-1 נגזר רקומביננטי, וירוס שהיה פסבדו עם וירוס stomatitis vesicular (VSV) מעטפה G חלבון. השימוש של הדור השני מערכת אריזה VSV הסוג המדומה קובע את הנגועים הרחב של חלקיקים ויראלי ומאפשר ייצור של וקטורים יציבים מאוד כי ניתן להתרכז על ידי הקפאת המערכת הקריואופטית. לאחר אימות סיכוייו, הווקטורים מוכנים לשמש כרכב עבור המסירה טרנסגנטית ללבקן הזיטים חולדה וויסטאר. לאחר סדרת זריקות, העוברים יכולים להיות מתורבתים בן לילה ולהעביר בשלב שני-תאים לאמהות מאמצות. בשלב זה, ניתן לשקול אחת משתי גישות חלופיות. ההליך הסטנדרטי מנצל הנקבות pseudopregnant כנמעני העובר. עם זאת, כאשר שיעור ההריון נמוך לאחר ההזדווגות עם הזכרים עיקור העוברים יכולים להיות מושתל לתוך ההריון wistar/ספראג-דאולי (SD) נקבות כי הם הזדווג עם חולדות גברים פורה עם צבע פרווה כהה (למשל, בראון נורווגיה [BN] חולדות). הצבע של הפרווה מאפשר הבחנה של צאצאים מן ההריון הטבעי מן הצאצאים שמקורם העוברים מניפולציות הועברו.

Protocol

ההפקה והיישום של וקטורים ויראליים היו בהתאם להנחיות ברמת בטיחות ברמה 2 ואושרה על-ידי משרד הסביבה הפולני. כל הליכי החיות הניסיוניים המתוארים להלן אושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית. בעלי החיים שוכנו בכלובים מאווררים באופן אינדיבידואלי בטמפרטורה יציבה (21 – 23 ° c) ולחות (50 – 60%) עם גישה למים ומזון תחת מחזור אור/12 h 12 שעות.

1. הפקת וקטורים בעלי הויראליות

  1. העברה של תאים 293T של HEK
    הערה: הפרוטוקול המוצג להלן מיועד ליצירת התרגום של עשרים מנות התרבות, שמייצר כ-200 מ ל של סופרנטאנט גולמי וקטורי.
    1. התרבות HEK 293T תאים במדיום DMEM דיום כי הוא בתוספת סרום העוברי העובר (10%, v/v) ב מחולל לחות ושות2 ב 37 ° c. לזיהום, להכין 20 10 ס מ לוחיות קוטר, ו זרעים 1.5 – 2 x 106 Hek 293t תאים לכל מנה.
    2. כאשר המפגש מגיע ~ 70%, מעביר את התאים באמצעות פוליאתילן (פיי) מגיב, ה-pH 7.0, ביחס של 3 μg של פיי פי 1 μg של דנ א.
      1. הכינו את תערובת הגלגול לחמישה צלחות (הכינו את מספר החזרות בהתאם למספר הכולל של המנות). עד 1 מ ל של מדיום הנשר השונה של Dulbecco (DMEM ללא נסיוב), להוסיף את התערובת של שלושה פלמידים כך שהם מגיעים כמות סופית של 25 μg של הפלמבאמצע, 50 μg של דלתא R 8.2, ו 50 μg של קידוד פלבטיר.
      2. פיפטה למעלה ולמטה, ולהוסיף 125 μL של פיי בריכוז של 3 μg/μL. דגירה בטמפרטורת החדר עבור 15 דקות, היפוך הצינורית שלוש פעמים במהלך הדגירה. הוסף 200 μL של תערובת הגלגול לכל צלחת. בשלב הבא, מודאת לוחיות הרישוי של מחולל לחות בחממה2 ב 37 ° c.
  2. ריכוז של וקטורים מאונגיליים
    1. 48 שעות לאחר החצייה, הקציר המדיום המכיל חלקיקי LV. השתמש בצינורות חרוטי 50 mL.
      הערה: בשלב זה ניתן לדמיין את התאים בנקודה זו כדי לאמת את היעילות הניתנת לסינון. ניתן להוסיף חלק חדש של מדיום DMEM ותאים עשויים להיות מודלחים עבור 24 שעות נוספות. התשואה LV הוא דומה כאשר נאסף ב 48 ו 72 h נקודות זמן לאחר מעבר החצייה.
    2. צנטריפוגה את המדיום ב 3,000 x g עבור 5 דקות וטמפרטורת החדר כדי להסיר תאים מנותקים.
    3. לסנן את סופרנטנט (0.45 μm) ולשפוך אותו לצינורות חדשים.
      הערה: ניתן להשמיט שלב זה.
    4. הוסף DNase I (RNase-חינם, 1 μg/mL) ו MgCl2 (1 מ"מ), ו דגירה באמבט מים ב 37 ° c עבור 15 דקות.
    5. להעביר את המדיום צינורות פוליאתילן חד פעמיות, ו ultracentrifuge ברוטור מנופף ב 115,000 x g ו 4 ° צ' עבור 1.5 h.
    6. לאחר תפרידו, מרוקנים בעדינות את קירות הצינורות משקעים בינוניים.
    7. להשרות את הגלולה עם מלוחים סטרילית מואגור פוספט (PBS; 70 – 80 μL לכל צינור).
    8. המשך 2 שעות ב-4 עד 8 ° c.
    9. השהה מחדש את הוקטורים הנגיפיים ב-PBS באמצעות מלטף עדין.
      התראה: הימנע מקצף.
    10. העברה לצינור צנטריפוגה 1.5 mL וצנטריפוגה ב-7,000 x g ו-4 ° c עבור 30 s. העבר את הסופרנאנט לשפופרת חדשה. חזור על שלב זה עד שלא ניתן לראות גלולה של פסולת תאית.
    11. . להקפיא ולקפוא ב-80 ° c הימנע מהקפאה מחדש של הנורית LV.
  3. קביעת טיטר וירוס באמצעות תגובת שרשרת פולימראז כמותית
    הערה: הטיטור של וקטורים ויראליות מבוצע באמצעות PCR כמותי (qPCR). שיטה זו מבוססת על הגברה כפול תקוע 84 bp ארוך מקטע DNA בתוך אזור הטרמינל ארוך חוזר של הגנום הנגיפי15.
    1. הכן את עקומת התקן על ידי ביצוע מדלל סדרתי של העירוי LV-coding: 1:500, 1:1000, 1:5000, 1:10000, 1:100,000, ו 1:1000000. קבע את מספר העותקים של הפלסמיד המשמש עבור העקומה הסטנדרטית. השתמש בנוסחה הבאה: מספר עותקים/μL = (ריכוז [g/μL] x 6.02 x 1023 [מספר/לפני])/(660 [g/מול] x בגודל פלמיד [bp]), שבו 6.02 x 1023 מספר/מול הוא מספר של אבוגדרו, ו 660 g/מול הוא משקל bp.
      הערה: ניתן להשתמש במחשבון מספר עותק מקוון.
    2. הכינו את הדילול של ההשעיה לעדשה: 1:100, 1:500, ו-1:1000.
    3. להכין את תערובת התגובה (אמצעי אחסון לכל טוב): 10 μL של qPCR מיקס, 1 μL של 10 μM קדימה פריימר, 1 μL של 10 μM לאחור פריימר, ו-7 μL של H2O. פיפטה את התערובת לתוך בארות של 96-היטב צלחות.
      הערה: קדימה פריימר: 5 '-AGCTGCCTגנול CTTCA. הפוך בהילוך אחורי: 5 '-TGGTACGTGA.
    4. הוסף 1 μL של כל דילול רגיל השעיה ויראלי בטרילקאט.
    5. הפעל את ה-qPCR בהתאם לפרמטרים הבאים: 50 ° c עבור 2 דקות, 96 ° צ' עבור 5 דקות, ו 35 מחזורים של 96 ° c עבור 20, 60 ° c עבור 40 s, ו-70 ° c עבור 1 דקות, ואחריו להמיס השלב העקום: 95 ° c עבור 1 דקות ו-60 ° c בשלושים.
    6. ניתוח התוצאות על-ידי השוואת מספר המולקולות המתקבלות עבור כל דילול לעקומה הסטנדרטית. לקבוע את הריכוז של מולקולות וקטוריות כממוצע של שלוש משכפל עבור כל דילול.
      הערה: הקוונפיקציה המוצגת מעניקה את הריכוז הפיסי של החלקיקים הנגיפיים. זה לא צריך להיות מטופל כמו titer פונקציונלי.

2. הדור של חולדות הטרנסגניים

  1. ביוץ ואוסף של עוברים מופרות
    1. . מנהל כדורי ברולה
      הערה: כדי להגדיל את מספר העוברים שנאספו (כ 30 לכל נקבה), להשתמש בנות הישן 5 שבועות וויסטאר הנקבות לגירוי הורמונלי.
      1. ביום 1 (12 PM – 1 PM), intraperitoneally להזריק את גונדוטרופין המרה של סוסה בהריון (PMSG; 25 IU לנקבה). הכינו 1 מ"ל הבליטים של פתרון העבודה בריכוז של 125 IU/mL על ידי המסת אבקת הורמון ב 0.9% הנאל. החנות ב-20 ° צ' עד לחודש אחד או-80 ° c עד 6 חודשים.
      2. ביום 3 (12 PM – 1 PM), intraperitoneally להזריק גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG; 30 IU לכל נקבה). הכינו 1 מיל הורמון פתרון העבודה (150 IU/mL) על ידי המסת אבקת הורמונים ב 0.9% הנאל. החנות ב-20 ° צ' עד לחודש אחד או-80 ° c עד 6 חודשים.
    2. לאחר הממשל hCG, חבר נשים 1:1 עם גברים פוריים מינית (3-10 חודשים בן).
    3. למחרת בבוקר (יום 4 בשעה 8:00-10:00), בדוק את הנקבות לנוכחות תקע וגינאלי. בדוק את פתיחת הנרתיק לנוכחות תקע ההזדווגות לבנבן, אשר עבור ההדמיה הטובה ביותר יש לבדוק מוקדם בבוקר לאחר ליל ההזדווגות. עבור אוסף העובר, השתמש רק נקבות עם תקע גלוי.
    4. לאסוף עוברים ב 10 בבוקר. להקריב את החיות כדי לבלו את ההטלה, ולאסוף את תעלות ההטלה בצלחת עם מדיום מחומם מראש M2.
      1. העברת ההטלה לצלחת 35 מ"מ המכילה טרום בינוני M2 מראש עם hyaluronidase מן האשכים שור בריכוז של 0.5 mg/mL.
      2. פתחו את קירות צינור ההטלה בעזרת מלקחיים עדינים מתחת לstereomicroscope ולחצו על האמפוללה (כלומר, החלק הנפוח של צינור ההטלה המכיל עוברים מופרות המוקפים בתאי קומולוס) עד שעוברים שחררו את העוברי.
        הערה: Hyaluronidase מיעכל בתאי קומולוס, שחרור עוברים.
        התראה: חשיפה ממושכת ל-hyaluronidase היא מדלטרזה לעוברים; לכן, שלב זה אמור להימשך לא יותר מ-5 דקות.
      3. כדי להקל על שחרורו של העוברים מתאי תלולית, בעדינות מנקז אותם למעלה ולמטה באמצעות צינור העברת זכוכית כי הוא מחובר שפופרת מופעל בפה.
        1. כדי לייצר את הפיפטה העברה, למשוך את הזכוכית פסטר משקה על להבה כדי לייצר ישר ~ 5-10 ס מ טיפ. שבור את הפיפטה ומותיר תשר של ~ 4 ס מ.
      4. לשטוף את העוברים כמה פעמים ב M2 בינונית כדי להסיר hyaluronidase ופסולת הסלולר. העבר את העוברים למנה 60 מ"מ המכילה (~ 50 μL) טיפות של 16 בינוני מראש, מכוסה על ידי פרפין נוזלי או שמן מינרלי, בתוך לחות שבחממה 37 ° c עם 5% CO2 אווירה.
  2. הזרקה של וקטורים לונגיליים כדי העובר בשלב אחד, תחת הסונה פלולוצידה
    הערה: השתמש בעוברים בעלי שלב אחד בשני תאים הכוללים שתי צורות גלויות לצורך מיקרוהזרקה (איור 1).
    1. הפשרה של LV סדרת מחלקים בטמפרטורת החדר צנטריפוגה ב 10,000 x g ו RT עבור 2 דקות כדי גלולה כל הפסולת התאית הנותרים.
    2. כיוונון מיקרוהזרקה
      1. הכנת פיפטות להחזקת זכוכית (נימי זכוכית בורוסיליקט) בעזרת מיקרופורג '. משוך את נימי הזכוכית מעל להבה כדי להפיק תשר של 5 – 10 ס מ. שבור את הפיפטה ומותיר תשר של ~ 4 ס מ. הקוטר החיצוני צריך להיות ~ 80 – 120 μm.
        הערה: ודא שהפיפטה הוא ישר וחלק לחלוטין.
      2. להרכיב את הצנרת הנמשכת במיקרופורג ' עם הקצה לפני החוט החימום. החום את החוט קרוב מאוד לקצה הפיפטה ואפשר לו להתכווץ לקוטר של ~ 15 יקרומטר (כ -20% מגודל העובר). מקמו את הפיפטה ניצב לפילמנט החימום, 2 – 3 מ"מ מקצה הפיפטה ומתחילים להתחמם. . הזכוכית מתרככה החום עד שהוא מגיע. לזווית של 15 מעלות
      3. הכינו בורוזזרקת מיקרוסיליקט נימים זכוכית עם נימה באמצעות הפיפולר פיפטה. . הכניסו את הנימים לחדר העוצר הפעל בדיקת כבש (בפעם הראשונה עבור זכוכית חדשה בכל פעם לאחר שינוי החוט). הגדר את החום לשיפוע ערך 10, משוך ל 100, מהירות ל 150 ו זמן 100.
        הערה: שינוי הפרמטרים לקבלת נימי הזרקה אופטימליים.
      4. תחת בטיחות ביולוגית כיפה זרם למינארי, טען כ 2 μL של הפתרון הנגיפי לתוך הפיפטה מיקרופית עם טיפ מיקרוטוען.
      5. הכינו צלחת מיקרוהזרקה (מכסה של צלחת פטרי 60 מ"מ) עם ירידה של 100 μL של M2 בינונית (באמצע), מכוסה על ידי פרפין נוזלי או שמן מינרלי.
      6. טעינת הפיפטה האוחז ונימי המיקרוהזרקה הנטענים בתמיסה נגיפית למיקרומניפולציה ולצלחת מיקרוהזרקה תחת מיקרוסקופ הפוך.
    3. בצע את המיקרו-הזרקה.
      1. העברה 15 – 20 העוברים בשלב תא אחד לירידה M2 על הצלחת מיקרוהזרקה. החזיקו את העובר באמצעות פיפטה מחזיק.
      2. באמצעות הגדלה 400x, להזריק את הפתרון LV תחת הסונה pellucida לחלל perivitelline באמצעות נימי זכוכית כי הוא מחובר מזרק אוטומטי. החזיקו את הנימים. מתחת לסונה לרגע
        הערה: שימוש בלחץ חיובי עדין, הפתרון הנגיפי יזרום ברציפות מתוך נימי ההזרקה, אך לא ניתן לשלוט בנפח ההשעיה המועבר.
      3. באמצעות פיפטה משובח, החזר את העוברים לצלחת התרבות בחממה ב-37 ° c באווירה של 5% CO2 . מספר זריקות של זיגוטה אחד עשוי להשתנות יכול להיות מותאם בהתבסס על ריכוז וקטורי ויראלי.
        הערה: העוברים המוזרקים יכולים להיות מועברים לאמהות מאמצות בשלב של תא אחד או באמצעות מבנה O/N ב-16 בינוני לפני העברתם בשלב שני התאים. יש להימנע מגידול ממושך בתרבות של עוברי חולדה.
  3. העברת עוברים מוזרק לאמהות אומנה
    1. להכין אמהות אומנה על ידי ההזדווגות בוגרת מינית נקבות sd עם גברים פוריים בגיל 12 או עם הזכרים SD עיקור (הליך העיקור מתואר בסעיף 3 להלן) ביום 3 (עבור העברת העוברים בשלב תא אחד) או יום 4 (עבור העברת עוברים בשלב שני תאים).
      הערה: להעברת צינור ההטלה, השתמש ב-0.5 ימים לאחר הנקבה (dpc).
    2. למחרת בבוקר, בדוק נקבות SD עבור תקע וגינאלי, ולהשתמש רק באלה עם תקע גלוי.
    3. בצע העברת העובר.
      הערה: בצע את ההליך הכירורגי עם מכשירים סטריליים תחת stereomicroscope. לפני יום הניתוח, מספריים אוטוקלב, מלקחיים משובחים, מחזיק מחט, ומחזיק אזמל.
      1. להדעד נקבה עם כיתה הממשל של קטמין (50 מ"ג/ק"ג) ו medetomidine (0.5 מ"ג/ק"ג) פתרון. מבחן רפלקסים כדי לאשר הרדמה לפני תחילת ההליך הכירורגי.
      2. הכנס את החיה תת-עורי עם חומצה tolefenamic (2 מ"ג/ק"ג), butorphanol tartrate (1 מ"ג/ק"ג), ו enrofloksacin (5 – 10 מ"ג/ק"ג) כדי למנוע דלקת, כאב, וזיהום, בהתאמה.
      3. החל משחה אופטלמולוגית שימון לשתי העיניים כדי למנוע ייבוש הקרנית. לגלח את הפרווה מאחור, ולעקר את העור עם סקראב כירורגי ואחריו 70% אלכוהול באמצעות רפידות סטרילי ללא שמירה. . הניחו לעור להתייבש
      4. הכנס את החיה תת-עורי עם 100 μL של 0.25% bupi, הרדמה מקומית באתר החיתוך. להעביר את החיה בעמדה נוטה למשטח נקי על משטח חימום תחת המטרה של מיקרוסקופ כירורגי. כסו את החולדה בעזרת כיסוי סטרילי עם חור קטן הנחתך מעל הגב התחתון.
      5. לבצע חתך העור כ 2 ס מ, במקביל לטור השדרה המותני.
      6. באמצעות מספריים חדים, לחתוך בקיר הבטן. לתפוס משטח שומן השחלות באמצעות מלקחיים, ולמשוך את השחלה וההטלה ומניחים אותם על גזה כי הוא מורכיב עם 0.9% הנאל.
      7. מותחת M2 בינונית, שלושה בועות אוויר, ואת העוברים לתוך נימי המעבר. מספר כולל של עוברים שיועברו (חד צדדית או דו צדדי): אישה הרה (≤ 15-16 עוברים), pseudopregnant נקבה (≤ 30 עוברים).
      8. לעשות חתך קטן בצינור ההטלה (בין שפך ו ampulla) באמצעות מיקרו מספריים, ולהכניס את הצנרת העברה בתעלת ההטלה.
      9. מגרשים בעדינות עוברים ובועות אוויר מהפיפטה אל תעלת ההטלה. מניחים את מערכת הרבייה. חזרה בחלל הבטן
      10. תפר את קיר הבטן עם בחומצה פוליגליקולית לספיגה תפרים ולסגור את חתך העור עם הפצע קליפים. בהתאם למספר העוברים הזמינים, חזור על הליך זה עבור צינור ההטלה האחר.
      11. הכנס את החיה intraperitoneally עם אטיפיאזול (0.5 מ"ג/ק"ג) כדי להפוך את ההשפעה של הרדמה.
      12. להעביר את החיה לכלוב נקי ולשמור אותו על צלחת ההתחממות כדי להתאושש לחלוטין מהרדמה. משלוח בחולדות מתרחשת לאחר ~ 21 ימים.
        הערה: כאשר משתמשים בחולדות ממין זכר משמשים להזדווגות, רק גורים לבנים הם בעלי פוטנציאל מהונדס; גורים חומים הם מהריון טבעי.
      13. לאסוף שברי רקמה (רצוי מן האוזן) כדי הגנוטיפ של כלבלבים בן 3 שבועות.

3. כריתת צינור הזרע

הערה: לפני יום הניתוח, מספריים אוטוקלב, מלקחיים עדינים ומחזיק מחט.

  1. לשכל 5-שבוע בן זכר עכברוש עם הממשל כייל של קטמין (50 מ"ג/ק"ג) ו medetomidine (0.5 מ"ג/ק"ג) פתרון. מבחן רפלקסים כדי לאשר הרדמה לפני תחילת ההליך הכירורגי.
  2. מנהל חומצה טפניתלמי (2 מ"ג/ק"ג), butorphanol tartrate (1 מ"ג/ק"ג), ו enrofloksacin (5 – 10 מ"ג/ק"ג) תת-עורי כדי למנוע דלקת, כאב, וזיהום, בהתאמה.
  3. החל משחה אופטלמולוגית שימון לשתי העיניים כדי למנוע ייבוש הקרנית. מניחים את העכברוש פרקדן על משטח נקי על כרית חימום, ולעקר את העור על האשכים עם סקראב כירורגי ואחריו 70% אלכוהול באמצעות רפידות מעוקר ללא שמירה. . הניחו לעור להתייבש לכסות את העכברוש עם כיסוי סטרילי עם חור קטן לחתוך את האשכים. לחץ בעדינות על הבטן כדי לחשוף את האשכים בתוך שק האשכים.
  4. באמצעות מספריים כירורגיים, לעשות חתך של ~ 0.5 ס מ באמצע שק האשכים. אתר את הקיר קו האמצע (קו לבנבן) בין האשכים.
  5. הפוך חתך של 5 מ"מ בקרום הראש קרוב לצד השמאלי של הקיר באמצע הקו.
  6. בזהירות לדחוף את הבנות שמאלה ולאתר את הזרע (בין האחים ואת קו האמצע) כמו צינור לבן עם כלי דם אחד.
  7. משוך בעדינות את הזרע מתוך שק האשכים בעזרת מלקחיים של שען. להחזיק את הזרע עם זוג מלקחיים אחד, ולחתוך אותו עם מספריים עדינים (או לצרוב עם טיפים אדומים-חם של זוג שני של מלקחיים). להסיר קטע של ~ 1 ס מ של צינור האוורור.
    הערה: אם הקאווניזציה מבוצע, החזק את קצה זוג הלקחיים השני בלהבה.
  8. חזור על ההליך שלעיל. בשביל האחרים תפר את העור בעזרת התפרים בחומצה פוליגליקולית נספגים והכנס את intraperitoneally החי עם אטיפיאזול (0.5 מ"ג/ק"ג).
  9. מניחים את החולדה בכלוב נקי על צלחת התחממות עד החיה מתאושש מהרדמה.
    הערה: ניתן להשתמש בזכרים במטלי הבדיקה לאחר תקופת התאוששות של ~ 2 שבועות. לאחר עקרות הוא אישר, הם יכולים לשמש השראה פסבדו.

תוצאות

באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל, וקטורים לונגיביים שנשאו את Syn-tdp-43-egfp המבנה יוצרו (הפיזי LV סיכוייו = 3.4 x 108/μl) ולאחר מכן יכול לשמש עבור העובר אחד-תאים בשלב השני זריקות subzonal. רק עוברים עם שני מראות. גלויים היו חשופים להליך מספר זריקות השעיות הנגיליות נקבעו כניסויים. יעילות השרשה גבוהה ומחס...

Discussion

ההתקדמות בטכנולוגיות הטרנסגניים הפכו דגמי מכרסמים כלי רב-ערך במחקר ביו-רפואי. הם מספקים את ההזדמנות ללמוד גנוטיפ-פנוטיפ יחסים ב vivo. כאן, אנו מציגים חלופה זמינה נרחב עבור הטרנסגנזה קונבנציונאלי על ידי באמצעות זריקות ברורות. השימוש של התמרה גנים לנטינגיזציה עוקפת את הצורך לדרוש הזרקות מיקר...

Disclosures

למחבר (W.K.) יש זכויות לפטנט, "שיטת ייצור בעלי חיים טרנסגניים", מתוך משרד הפטנטים של הרפובליקה הפולנית (no. P 355353; 21.03.2008).

Acknowledgements

מחקר זה היה נתמך על ידי הפרויקט ANIMOD בתוך תוכנית צוות טק ליבה מתקן פלוס של הקרן למדע הפולני, ממומן על ידי האיחוד האירופי תחת הקרן האירופית לפיתוח האזורית למשרד שבוע.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
7500 Real Time PCR SystemApplied Biosystems
Aerrane (isoflurane)BaxterFDG9623
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettesSigmaA5177-5EA
Atipam 5 mg/mlEurovet Animal Health BVN/A0.5 mg/kg
Baytril 25 mg/ml (enrofloksacin)BayerN/A5-10 mg/kg
Borosilicate glass capillaries with filament GC100TF-15Harvard Apparatus Limited30-0039injection capillary
Bupivacaine 25 mg/mlAdvanz PharmaN/A0.25% in  0.9% NaCl
Butomidor 10 mg/ml (butorphanol  tartrate)Orion PharmaN/A1 mg/kg
CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 35-mmGreiner Bio-One627160
CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 60-mmGreiner Bio-One628160
CellTram OilEppendorf5176 000.025
Cepetor (Medetomidine) 1 mg/mlcp-pharmaN/A0.5 mg/kg
Chorulon, Human Chorionic Gonadotrophin IntervetN/A150 IU/ ml ml 0.9% NaCl
DMEM low glucoseSigma AldrichD6048
DNase, RNase-freeA&A Biotechnology1009-100
EmbryoMax Filtered Light Mineral OilSigmaES-005-C
Envelope protein coding plasmid for lentiviral vectors (VSVg plasmid) ADDGENE14888
FemtoJetEppendorf4i /5252 000.013
Fetal Bovine SerumSigma AldrichF9665-500ML
Folligon, Pregnant Mare’s Serum Gonadotropin IntervetN/A125 IU/ml in .9% NaCl
HEK 293T cells ATCCATCC CRL-3216
Hyaluronidase from Bovine Testis SigmaH4272-30MG0.5 mg/ml in M2 medium
Inverted Microscope ZeissAxiovert 200
Ketamine 100mg/mlBiowet PulawyN/A50 mg/kg
Liquid ParaffinMerck Millipore8042-47-5
M16 medium EmbryoMaxSigmaMR-016-D
M2 mediumSigmaM7167
Magnesium Chloride 1MSigma Aldrich63069-100ML
MicroforgeNarishigeMF-900
Mineral OilSigmaM8410-500ML
NaCl 0.9%POLPHARMA OTCN/Asterile, 5ml ampules
Operation microscope Inami Ophthalmic InstrumentsDeca-21
Packaging system coding plasmid for lentiviral vectors  (delta R8.2 plasmid)ADDGENE12263
PEI reagent (Polyethylenimine, Mw ~ 25,000,),Polysciences, Inc23966-1
Penicilin-streptomycinSigma AldrichP0781-100ML
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell cultureSigma Aldrich806552-500ML
Puller Sutter Instrument Co.P-97
Reflex Clip Applier/Reflex ClipsWorld Precision Instruments500345/500346
Safil, polyglycolic acid, braided, coated, absorbable threadsB.Braun Surgical1048029
StereomicroscopeOlympusSZX16
Surgical Sewing ThreadB.Braun C1048040
SYBR Green PCR Master MixApplied Biosystem4334973
Tolfedine 4% (tolfenamic acid)VetoquinolN/A2 mg/kg
TransferMan NK2EppendorfN/A
Trypsin EDTA solutionSigma AldrichT3924-500ML
UltracentrifugeBeckman CoulterOptima L-100 XP 
VacuTipEppendorf5175108.000holders capillary
Vita-POSUrsapharmN/Aeye ointment
Warming PlateSemicN/A
Watchmaker ForcepsVWR470018-868

References

  1. Lazar, J., Moreno, C., Jacob, H. J., Kwitek, A. E. Impact of genomics on research in the rat. Genome Research. 15 (12), 1717-1728 (2005).
  2. Tarkowski, A. K. Studies on mouse chimeras developed from eggs fused in vitro. National Cancer Institute Monographs. 11, 51-71 (1963).
  3. Gordon, J. W., Ruddle, F. H. Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei. Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).
  4. Gill, T. J., Smith, G. J., Wissler, R. W., Kunz, H. W. The Rat as an Experimental Animal. Science. 245 (4915), 269-276 (1989).
  5. Aitman, T. J., et al. Progress and prospects in rat genetics: a community view. Nature Genetics. 40 (5), 516-522 (2008).
  6. Hammer, R. E., Maika, S. D., Richardson, J. A., Tang, J. P., Taurog, J. D. Spontaneous inflammatory disease in transgenic rats expressing HLA-B27 and human beta 2m: an animal model of HLA-B27-associated human disorders. Cell. 63 (5), 1099-1112 (1990).
  7. Mullins, J. J., Peters, J., Ganten, D. Fulminant hypertension in transgenic rats harbouring the mouse Ren-2 gene. Nature. 344 (6266), 541-544 (1990).
  8. Menoret, S., Remy, S., Usal, C., Tesson, L., Anegon, I. Generation of Transgenic Rats by Microinjection of Short DNA Fragments. Rat Genomics: Methods and Protocols. 597, 81-92 (2010).
  9. Tesson, L., et al. Transgenic modifications of the rat genome. Transgenic Research. 14 (5), 531-546 (2005).
  10. Charreau, B., Tesson, L., Soulillou, J. P., Pourcel, C., Anegon, I. Transgenesis in rats: Technical aspects and models. Transgenic Research. 5 (4), 223-234 (1996).
  11. Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors. Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).
  12. Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295 (5556), 868-872 (2002).
  13. Pfeifer, A., Ikawa, M., Dayn, Y., Verma, I. M. Transgenesis by lentiviral vectors: lack of gene silencing in mammalian embryonic stem cells and preimplantation embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2140-2145 (2002).
  14. Koza, P., et al. Neuronal TDP-43 depletion affects activity-dependent plasticity. Neurobiology of Disease. 130, 104499 (2019).
  15. Scherr, M., Battmer, K., Blomer, U., Ganser, A., Grez, M. Quantitative determination of lentiviral vector particle numbers by real-time PCR. Biotechniques. 31 (3), 520 (2001).
  16. Canseco, R. S., et al. Gene transfer efficiency during gestation and the influence of co-transfer of non-manipulated embryos on production of transgenic mice. Transgenic Research. 3 (1), 20-25 (1994).
  17. Charreau, B., Tesson, L., Soulillou, J. P., Pourcel, C., Anegon, I. Transgenesis in rats: technical aspects and models. Transgenic Research. 5 (4), 223-234 (1996).
  18. Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (13), 4438-4442 (1985).
  19. Armstrong, D. T., Opavsky, M. A. Superovulation of immature rats by continuous infusion of follicle-stimulating hormone. Biology of Reproduction. 39 (3), 511-518 (1988).
  20. Popova, E., Krivokharchenko, A., Ganten, D., Bader, M. Comparison between PMSG- and FSH-induced superovulation for the generation of transgenic rats. Molecular Reproduction and Development. 63 (2), 177-182 (2002).
  21. Johnson, L. W., Moffatt, R. J., Bartol, F. F., Pinkert, C. A. Optimization of embryo transfer protocols for mice. Theriogenology. 46 (7), 1267-1276 (1996).
  22. van den Brandt, J., Wang, D., Kwon, S. H., Heinkelein, M., Reichardt, H. M. Lentivirally generated eGFP-transgenic rats allow efficient cell tracking in vivo. Genesis. 39 (2), 94-99 (2004).
  23. Remy, S., et al. The Use of Lentiviral Vectors to Obtain Transgenic Rats. Rat Genomics: Methods and Protocols. 597, 109-125 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

159

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved