Generazione di ratti transgenici con un approccio al vettore lentivirale

Riepilogo

Questo articolo ha lo scopo di fornire la metodologia per la transgenesi lentivirale negli embrioni di ratto utilizzando iniezioni multiple di una sospensione di un virus nello spazio perivitelina dello zigote. I ratti femmina che vengono accoppiati con un ceppo maschile fertile con un diverso colore di pelliccia dominante viene utilizzato per generare madri adottive pseudoincinte.

Abstract

I modelli animali transgenici sono fondamentalmente importanti per la ricerca biomedica moderna. L'incorporazione di geni estranei negli embrioni di topo o ratto precoce è uno strumento inestimabile per l'analisi delle funzioni geniche negli organismi viventi. Il metodo di transgenesi standard si basa sulla microiniettatura di frammenti di DNA estraneo in un pronucle di un ovocita fecondato. Questa tecnica è ampiamente utilizzata nei topi, ma rimane relativamente inefficiente e tecnicamente impegnativa in altre specie animali. Il transgene può anche essere introdotto negli embrioni a una cellula attraverso l'infezione lentivirale, fornendo un'alternativa efficace alle iniezioni pronucleari standard, specialmente nelle specie o nei ceppi con una struttura embrionale più impegnativa. In questo approccio, una sospensione che contiene vettori lentivirali viene iniettata nello spazio perivitelina di un embrione di ratto fecondato, che è tecnicamente meno esigente e ha un tasso di successo più elevato. È stato dimostrato che i vettori lentivirali incorporano in modo efficiente il transgene nel genoma per determinare la generazione di linee transgeniche stabili. Nonostante alcune limitazioni (ad esempio, requisiti di livello di biosicurezza 2, limiti di dimensione del frammento di DNA), la transgenesi lentivirale è un metodo di transgenesi rapida ed efficiente. Inoltre, l'uso di ratti femminili che vengono accoppiati con un ceppo maschile fertile con un diverso colore di pelliccia dominante è presentato come un'alternativa per generare madri adottive pseudoincinte.

Introduzione

Per molti anni, i roditori di laboratorio, come ratti e topi, sono stati utilizzati per modellare le condizioni fisiologiche e patologiche umane. La ricerca sugli animali ha portato a scoperte irraggiungibili con qualsiasi altro mezzo. Inizialmente, gli studi genetici si sono concentrati sull'analisi di disturbi e fenotipi che si verificano spontaneamente che sono considerati imitare da vicino la condizione umana¹. Lo sviluppo di metodi di ingegneria genetica ha permesso l'introduzione o la cancellazione di geni specifici per ottenere un fenotipo desiderato. Pertanto, la generazione di animali transgenici è riconosciuta come una tecnica fondamentale nella ricerca moderna che consente studi sulla funzione genica negli organismi viventi.

La tecnologia animale transgenica è diventata possibile attraverso una combinazione di risultati nell'embriologia sperimentale e nella biologia molecolare. Negli anni sessanta, l'embriologo polacco A. K. Tarkowski pubblicò il primo lavoro sulla manipolazione degli embrioni di topo durante le prime fasi dello sviluppo². Inoltre, i biologi molecolari hanno sviluppato tecniche per generare vettori di DNA (cioè portatori) per l'introduzione tra l'altro del DNA estraneo nel genoma dell'animale. Questi vettori consentono la propagazione di geni selezionati e la loro modifica appropriata, a seconda del tipo di ricerca che viene condotta. Il termine "animale transgenico" è stato introdotto da Gordon e Ruddle³.

La prima specie ampiamente accettata che è stata utilizzata in neurobiologia, fisiologia, farmacologia, tossicologia, e molti altri campi delle scienze biologiche e mediche è stato il ratto norvegese, Rattus norvegicus⁴. Tuttavia, a causa della difficoltà di manipolare gli embrioni di ratto, il topolino mus musculus è diventato la specie animale dominante nella ricerca genetica⁵. Un altro motivo per il primato del topo in tale ricerca è stata la disponibilità di una tecnologia di cellule staminali embrionali per generare animali knockout per questa specie. La tecnica di transgenesi più comunemente utilizzata (2-10% della prole transgenica rispetto a tutti gli animali nati) è la microiniezione di frammenti di DNA in un pronucle di un ovocita fecondato. Nel 1990, questo approccio, introdotto per la prima volta nei topi, è stato adattato per i ratti^6,7. La transgenesi del ratto per iniezione pronucleare è caratterizzata da una minore efficienza⁸ rispetto ai topi, che è strettamente correlata alla presenza di plasma elastico e membrane pronucleari⁹. Anche se la sopravvivenza degli embrioni dopo la manipolazione è inferiore del 40-50% rispetto ai topi, questa tecnica è considerata uno standard nella generazione di ratti geneticamente modificati¹⁰. Sono stati studiati approcci alternativi in grado di garantire un'efficace corporazione di transgeni e tassi di sopravvivenza più elevati di zigoti iniettati.

Il fattore determinante dell'espressione transgene stabile e della trasmissione alla progenie è la sua integrazione nel genoma della cellula ospite. I lentivirus (LV) hanno la caratteristica distintiva di essere in grado di infettare sia le cellule divisorie che non dividendo. Il loro uso come strumento per l'incorporazione di geni eterologhi in embrioni si è dimostrato altamente efficiente¹¹, e gli individui transgenici sono caratterizzati da espressione stabile del frammento di DNA incorporato. L'efficacia dei vettori lentivirali è stata confermata per la modificazione genetica dei topi^12,,13,ratti^12,14e altre specie¹¹. In questo metodo, la sospensione LV viene iniettata sotto la zona pellucida dell'embrione nello stadio di due pronuclei. Questa tecnica garantisce essenzialmente la sopravvivenza al 100% degli embrioni perché l'oolemma rimane inalterato. La produzione di sospensioni LV di alta qualità e relativamente altamente concentrate sono fattori cruciali. Tuttavia, concentrazioni più basse di sospensioni LV possono essere superate da ripetute iniezioni¹¹, che aumenta la quantità di particelle virali sulla superficie dell'uovo senza influenzare l'integrazione della membrana. Gli embrioni sottoposti a iniezioni ripetute nello spazio perivitelina si sviluppano ulteriormente, e la prole transgenica può trasmettere il transgene attraverso la germinale. L'efficienza della generazione di ratti transgenici mediante transgenesi lentivirale può essere fino all'80%¹².

Qui, descriviamo la produzione di lentivirus ricombinante derivante da HIV-1 che è stato pseudotipato con proteina di involucro G del virus della stomatite vescicolare (VSV). L'uso dello pseudotipo VSV del sistema di imballaggio di seconda generazione determina l'ampia infettività delle particelle virali e permette la produzione di vettori altamente stabili che possono essere concentrati dall'ultracentrifugazione e dalla crioconservazione. Dopo la verifica del tibieto, i vettori sono pronti per essere utilizzati come veicolo per la consegna transgene in zigoti ratti albino Wistar. Dopo una serie di iniezioni, gli embrioni possono essere coltivati durante la notte e trasferiti allo stadio a due cellule per le madri affidatarie. A questo punto, è possibile considerare uno dei due approcci alternativi. La procedura standard utilizza femmine pseudoincinte come embrioni. Tuttavia, quando il tasso di gravidanza è basso dopo l'accoppiamento con maschi vasectomizzati, gli embrioni possono essere impiantati in femmine incinte Wistar/Sprague-Dawley (SD) che sono accoppiate con ratti maschi fertili con un colore di pelliccia scura (ad esempio, ratti Brown Norway [BN]). Il colore della pelliccia permette la distinzione della prole dalla gravidanza naturale dalla prole che ha origine dagli embrioni manipolati trasferiti.

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Protocollo

La produzione e l'applicazione di vettori virali erano conformi alle linee guida del livello di biosicurezza 2 ed è stata approvata dal Ministero dell'Ambiente polacco. Tutte le procedure sperimentali sugli animali descritte di seguito sono state approvate dal Comitato Etico Locale. Gli animali sono stati alloggiati in gabbie ventilate individualmente a una temperatura stabile (21-23 gradi centigradi) e umidità (50-60%) con accesso ad libitum all'acqua e al cibo in base a un ciclo di luce/buio di 12 h/12 h.

1. Produzione vettoriale Lentivirale

1. Trasfezione di cellule HEK 293T
   NOTA: Il protocollo qui presentato è progettato per la trasfezione di venti piatti di coltura di 10 cm che produce circa 200 mL di supernatante vettoriale grezzo.
   1. Coltura HEK 293T cellule in mezzo DMEM che è integrato con siero bovino fetale (10%, v/v) in un incubatore di CO₂ umidificato a 37 gradi centigradi. Per la trasfezione, preparare venti piastre di 10 cm di diametro, e semi 1.5–2 x 10⁶ celle HEK 293T per piatto.
   2. Quando la confluenza raggiunge il 70%, trasfectare le cellule utilizzando il reagente di polietilenimina (PEI), pH 7,0, con un rapporto di 3 g di PEI per 1 g di DNA.
      1. Preparare la miscela di trasfezione per cinque piatti (preparare il numero di ripetizioni in base al numero totale di piatti). A 1 mL di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; senza siero), aggiungete la miscela di tre plasmidi in modo che raggiungano una quantità finale di 25 g di plasmide VSVg, 50 g di delta R8.2 e 50 g di plasmide di codifica.
      2. Pipetta su e giù, e aggiungere 125 l of PEI ad una concentrazione di 3 g/l. Incubare a temperatura ambiente per 15 minuti, invertendo il tubo tre volte durante l'incubazione. Aggiungere 200 l della miscela di trasfezione per piastra. Successivamente, incubare le piastre in un'incubatrice di CO₂ umidificata a 37 gradi centigradi.
2. Concentrazione di vettori lentivirali
   1. Quarantotto ore dopo la trasfezione, raccogliere il mezzo che contiene particelle DiV. Utilizzare tubi conici da 50 ml.
      NOTA: Quando si utilizza un plasmide con un tag fluorescente, le celle possono essere visualizzate a questo punto per verificare l'efficienza della trasfezione. È possibile aggiungere una nuova porzione di supporto DMEM e le cellule possono essere incubate per ulteriori 24 ore. Il rendimento Di LV è paragonabile se raccolto a4 e 72 h punti di tempo dopo la trasfezione.
   2. Centrifugare il mezzo a 3.000 x g per 5 min e temperatura ambiente per rimuovere le cellule staccate.
   3. Filtrare il super-natante (0,45 m) e versarlo in nuovi tubi.
      NOTA: questo passaggio può essere omesso.
   4. Aggiungere DNase I (senza RNase, 1 g/mL) e MgCl₂ (1 mM) e incubare in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi per 15 min.
   5. Trasferire il mezzo ai tubi monouso in polietilene, e ultracentrifuga in un rotore oscillante a 115.000 x g e 4 s per 1,5 h.
   6. Dopo la centrifuga, scolare delicatamente le pareti dei tubi dai residui medi.
   7. Immergere il pellet con una salina sterile con buffer fosfato (PBS; 70-80 l per tubo).
   8. Incubare per 2 ore a 4-8 gradi centigradi.
   9. Risospendere i vettori virali in PBS con un pipettaggio delicato.
      AVVISO: Evitare la schiuma.
   10. Trasferire su un tubo centrifuga di 1,5 ml e centrifugare a 7.000 x g e 4 gradi centigradi per 30 s. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo. Ripetere questo passaggio fino a quando non è visibile alcun pellet di detriti cellulari.
   11. Aliquota e congelare a -80 gradi centigradi. Evitare di ricongelare l'aliquota LV.
3. Determinazione del titro del virus utilizzando la reazione a catena quantitativa della polimerasi
   NOTA: la titolazione dei vettori virali viene eseguita utilizzando la PCR quantitativa (qPCR). Questo metodo si basa sull'amplificazione di un frammento di DNA lungo 84 bp a doppio filamento all'interno della regione di ripetizione del terminale lungo del genoma virale¹⁵.
   1. Preparare la curva standard effettuando diluizioni seriali del plasmide codifica LV: 1:500, 1:1,000, 1:5.000, 1:10.000, 1:100.000 e 1:1.000.000. Determinare il numero di copie del plasmide utilizzato per la curva standard. Utilizzare la seguente formula: numero di copie/zL (concentrazione [g/l] x 6,02 x 10²³ [numero/mol]) / (660 [g/mol] x plasmid size [bp]), dove 6,02 x 10²³ numero/mol è il numero di Avogadro e 660 g/mol è il peso bp.
      NOTA: è possibile utilizzare calcolatori di numeri di copia online.
   2. Preparare le diluizioni della sospensione lentivirale: 1:100, 1:500 e 1:1,000.
   3. Preparare la miscela di reazione (volumi per pozzo): 10 l di qPCR Mastermix, 1 : L di 10 M primer avanti, 1 L di 10M inverso e 7 -L di H₂O. Pipette la miscela nei pozzetti di piastre di 96 pozzetti.
      NOTA: Primer in avanti: 5'-AGCTTGCCTTGAGTGCTTCA. Primer inverso: 5'-TGACTAAAAGGGGCTGGGGGGGGA.
   4. Aggiungere in triplice sospensione standard di diluizione e lentivirale di 1 L di ciascuna diluizione standard e sospensione lentivirale.
   5. Eseguire il qPCR secondo i seguenti parametri: 50 s per 2 min, 96 s per 5 min, e 35 cicli di 96 s per 20 s, 60 C per 40 s e 70 s per 1 min, seguito da fase di curva di fusione: 95 s per 1 min e 60 C a 30 s.
   6. Analizzare i risultati confrontando il numero di molecole ricevute per ogni diluizione con la curva standard. Determinare la concentrazione di molecole vettoriali come la media di tre repliche per ogni diluizione.
      NOTA: La quantificazione presentata dà la concentrazione fisica delle particelle virali. Non deve essere trattato come un titro funzionale.

2. Generazione di ratti transgenici

1. Superovulation e raccolta di embrioni fecondati
   1. Amministrare gonadotropine.
      NOTA: Per aumentare il numero di embrioni raccolti (circa 30 per femmina), utilizzare femmine Wistar immature di 5 settimane per la stimolazione ormonale.
      1. Il primo giorno (12:00-13:00), iniettare intraperitonealmente la gonadotropina del siero della cavalla incinta (PMSG; 25 IU per femmina). Preparare 1 mL aliquote di soluzione di lavoro ad una concentrazione di 125 IU/mL sciogliendo polvere ormonale in 0.9% NaCl. Conservare a -20 gradi centigradi per un massimo di 1 mese o -80 gradi centigradi per un massimo di 6 mesi.
      2. Il giorno 3 (12 PM-1PM), iniettare intraperitonealmente gonadotrofina colionica umana (hCG; 30 IU per femmina). Preparare 1 mL aliquote di soluzione di lavoro (150 IU/mL) sciogliendo polvere ormonale in 0.9% NaCl. Conservare a -20 gradi centigradi per un massimo di 1 mese o -80 gradi centigradi per un massimo di 6 mesi.
   2. Dopo l'amministrazione hCG, mate femmine 1:1 con maschi sessualmente fertili (3-10 mesi).
   3. La mattina successiva (giorno 4 alle 8-10), controllare le femmine per la presenza di un tappo vaginale. Controllare l'apertura vaginale per la presenza di un tappo di accoppiamento whitish, che per la migliore visualizzazione deve essere controllato la mattina presto dopo la notte di accoppiamento. Per la raccolta degli embrioni, utilizzare solo femmine con un tappo visibile.
   4. Raccogliere gli embrioni alle 10:00. Sacrificare gli animali per accisare gli ovidotti e raccogliere gli ovidotti in un piatto con mezzo M2 preriscaldato.
      1. Trasferire gli ovidotti in un piatto da 35 mm che contiene un mezzo M2 preriscaldato con ialuronidasi da testicoli bovini ad una concentrazione di 0,5 mg/mL.
      2. Aprire le pareti dell'ovulo utilizzando pinze sottili sotto uno stereomicroscopio e premere l'ampulla (cioè, la parte gonfia dell'ovuldotto che contiene embrioni fecondati che sono circondati da cellule cumuliche) fino a quando gli embrioni vengono liberati.
         NOTA: L'ialuronidasi digerisce enzymaticamente le cellule cumuli, rilasciando embrioni.
         AVVISO: l'esposizione prolungata all'ialuronidasi è deleteria per gli embrioni; pertanto, questo passaggio non dovrebbe durare più di 5 min.
      3. Per facilitare il rilascio di embrioni da cellule cumuli, pipette delicatamente su e giù utilizzando una pipetta di trasferimento di vetro che è collegato a un tubo aspiratore a bocca.
         1. Per produrre la pipetta di trasferimento, tirare una pasteurtta di vetro sopra una fiamma per produrre una punta dritta di 5-10 cm. Rompere la pipetta lasciando una punta di 4 cm.
      4. Lavare gli embrioni un paio di volte in M2 mezzo per rimuovere ialuronidasi e detriti cellulari. Trasferire gli embrioni in un piatto di 60 mm che contiene (50 dollari l) gocce di mezzo M16 pre-equilibrato, coperto da paraffina liquida o olio minerale, in un incubatore umido di 37 gradi centigradi con un'atmosfera di CO₂ del 5%.
2. Microiniezione di vettori lentivirali a embrioni monocellulare sotto la zona pellucida
   NOTA: Utilizzare embrioni a uno stadio con due pronuclei visibili per microiniezione (Figura 1).
   1. Scongelare l'aliquota LV a temperatura ambiente e centrifugare a 10.000 x g e RT per 2 min a pellet eventuali detriti cellulari rimanenti.
   2. Configurazione microiniezione
      1. Preparare pipette di vetro (borosilicate vetro capillare) utilizzando una microforgia. Tirare il vetro capillare su una fiamma per produrre una punta di 5-10 cm. Rompere la pipetta lasciando una punta di 4 cm. Il diametro esterno dovrebbe essere di 80-120 m.
         NOTA: Assicurarsi che la punta della pipetta sia perfettamente dritta e liscia.
      2. Assemblare la pipetta tirata in una microforgiera con la punta di fronte al filamento riscaldante. Riscaldare il filamento molto vicino alla punta della pipetta e lasciarlo ridurre ad un diametro di 15 m (circa il 20% delle dimensioni dell'embrione). Posizionare la pipetta perpendicolarmente al filamento riscaldante, 2-3 mm dalla punta della pipetta, e iniziare a riscaldarsi. Il vetro si ammorbidisce. Riscaldare fino a raggiungere un angolo di 15 gradi.
      3. Preparare i capillari di vetro di microiniezione con un filamento utilizzando un tiratore pipetta. Inserire il capillare nella camera di trazione. Eseguire un test di rampa (per la prima volta per il vetro nuovo e ogni volta dopo aver cambiato il filamento). Impostare il valore Calore -10, Tira su 100, Velocità su 150 e Tempo su 100.
         NOTA: Modificare i parametri per ottenere un'iniezione ottimale capillare.
      4. Sotto un cappuccio a flusso laminare biosicurezza, caricare circa 2 ll della soluzione virale nella pipetta di microiniezione con una punta di microloader.
      5. Preparare un piatto di microiniezione (coperchio da 60 mm piatto Petri) con una goccia di 100 -L di M2 medio (nel mezzo), coperto da paraffina liquida o olio minerale.
      6. Montare la pipetta di tenuta e microiniezione capillare che viene caricato con soluzione virale a un micromanipolatore e microiniezione piatto sotto un microscopio invertito.
   3. Eseguire la microiniezione.
      1. Trasferire 15-20 embrioni a uno stadio a una goccia di M2 sulla parabola di microiniezione. Tenere l'embrione usando una pipetta di possesso.
      2. Utilizzando l'ingrandimento 400x, iniettare la soluzione LV sotto la zona pellucida allo spazio perivitelline utilizzando il capillare di vetro collegato ad un iniettore automatico. Tieni il capillare sotto la zona pellucida per un momento.
         NOTA: Utilizzando una leggera pressione positiva, la soluzione virale fluirà continuamente fuori dall'iniezione capillare, ma il volume delle sospensioni che viene consegnato non può essere controllato.
      3. Utilizzando una pipetta fine, riportare gli embrioni al piatto di coltura nell'incubatrice a 37 gradi centigradi in un'atmosfera di CO₂ del 5%. Il numero di iniezioni di uno zigote può variare e può essere adattato in base alla concentrazione vettoriale virale.
         NOTA: gli embrioni iniettati possono essere trasferiti alle madri affidatarie allo stadio a una cellula o incubate O/N nel mezzo M16 prima di essere trasferiti allo stadio a due cellule. Si dovrebbe evitare una coltura prolungata in vitro degli embrioni di ratto.
3. Trasferimento di embrioni iniettati alle madri affidate
   1. Preparare le madri adottive accoppiando femmine SD sessualmente mature con maschi fertili di BN o con maschi SD vasectomizzati (la procedura vasectomia è descritta nella sezione 3 di seguito) il giorno 3 (per il trasferimento di embrioni in fase a una cellula) o il giorno 4 (per il trasferimento di embrioni nella fase a due cellule).
      NOTA: Per il trasferimento di ovidotti, utilizzare 0,5 giorni dopo il coitum (dpc) femmine.
   2. La mattina successiva, controllare le femmine SD per un tappo vaginale, e utilizzare solo quelli con una spina visibile.
   3. Eseguire il trasferimento dell'embrione.
      NOTA: Condurre la procedura chirurgica con strumenti sterili sotto uno stereomicroscopio. Prima del giorno dell'intervento, forbici autoclave, pinze sottili, porta aghi e portabissi.
      1. Anestesizzare una femmina con somministrazione i.p. di ketamina (50 mg/kg) e soluzione di medetomidina (0,5 mg/kg). Testare i riflessi per confermare l'anestesia prima di iniziare la procedura chirurgica.
      2. Iniettare sottocutaneamente l'animale con acido tolefenamico (2 mg/kg), maabbaororato (1 mg/kg) e enrofloksacin (5-10 mg/kg) rispettivamente per prevenire infiammazioni, dolore e infezione.
      3. Applicare la lubrificazione dell'unguento oftalmico su entrambi gli occhi per evitare l'essiccazione corneale. Rasare la pelliccia dalla parte posteriore e sterilizzare la pelle con scrub chirurgico seguito dal 70% di alcol utilizzando pastiglie sterili non adere. Lasciare asciugare la pelle.
      4. Iniettare l'animale sottocutaneo con 100 -L di 0,25% bupivacaina (anestetico locale) nel sito di incisione. Trasferire l'animale in una posizione prona su una superficie pulita su un pad di riscaldamento sotto l'obiettivo di un microscopio chirurgico. Coprire il ratto con un drappo sterile con un piccolo foro tagliato sulla parte bassa della schiena.
      5. Eseguire un'incisione cutanea di circa 2 cm, parallela alla colonna vertebrale lombare.
      6. Utilizzando forbici affilate, fare un taglio nella parete addominale. Prendi un cuscinetto di grasso ovarico con pinze, e tira fuori l'ovaio e l'ovidotto e mettili su garza che è bagnato con 0.9% NaCl.
      7. Aspirare mezzo M2, tre bolle d'aria, e gli embrioni nel trasferimento capillare. Numero totale raccomandato di embrioni da trasferire (unilaterali o bilaterali): femmina incinta (15-16 embrioni), femmina pseudoincinta (30 embrioni).
      8. Fare una piccola incisione nell'ovulo (tra l'infundibulum e l'ampulla) utilizzando microforbici e inserire la pipetta di trasferimento nell'ovidotto.
      9. Espellere delicatamente gli embrioni e le bolle d'aria dalla pipetta all'ovidotto. Con pinze smussate, posizionare il tratto riproduttivo nella cavità addominale.
      10. Suturare la parete addominale con suture assorbenti dell'acido poliglicolico e chiudere l'incisione della pelle con clip di ferita. A seconda del numero di embrioni disponibili, ripetere questa procedura per l'altro ovidotto.
      11. Iniettare l'animale intraperitonenalmente con atipamezolo (0,5 mg/kg) per invertire l'effetto dell'anestesia.
      12. Trasferire l'animale in una gabbia pulita e tenerlo su una piastra riscaldante per recuperare completamente dall'anestesia. La consegna nei ratti avviene dopo 21 giorni.
          NOTA: Quando i ratti BN maschi vengono utilizzati per l'accoppiamento, solo i cuccioli bianchi sono potenzialmente transgenici; cuccioli marroni sono da gravidanza naturale.
      13. Raccogliere frammenti di tessuto (preferibilmente dall'orecchio) al genotipo cuccioli di 3 settimane.

3. Vasectomia

NOTA: Prima del giorno dell'intervento, forbici autoclave, pinze sottili e portaa ago.

1. Anestesizzare un ratto SD maschio di 5 settimane con soluzione di somministrazione i.p. di ketamina (50 mg/kg) e medetomidina (0,5 mg/kg). Testare i riflessi per confermare l'anestesia prima di iniziare la procedura chirurgica.
2. Somministrare l'acido tolfenamico (2 mg/kg), mailintoolo tartrate (1 mg/kg) e enrofloksacin (5-10 mg/kg) sottocutaneamente per prevenire l'infiammazione, dolore, e infezione, rispettivamente.
3. Applicare la lubrificazione dell'unguento oftalmico su entrambi gli occhi per evitare l'essiccazione corneale. Posizionare la supina del ratto su una superficie pulita su un pad di riscaldamento e sterilizzare la pelle sui testicoli con scrub chirurgico seguito dal 70% di alcol utilizzando pastiglie sterili non aderiscono. Lasciare asciugare la pelle. Coprire il ratto con un drappo sterile con un piccolo foro tagliato sopra i testicoli. Premere delicatamente l'addome per esporre i testicoli nel sacco scrotale.
4. Utilizzando forbici chirurgiche, fare un'incisione di 0,5 cm al centro del sacco scrotale. Individuare la parete della linea mediana (linea biancastra) tra i testicoli.
5. Fare un'incisione di 5 mm nella membrana del testicolo vicino al lato sinistro della parete mediana.
6. Spingere con attenzione i testicoli a sinistra e individuare vas deferens (tra il teste e la linea mediana) come condotto bianco con un singolo vaso sanguigno.
7. Tirare delicatamente i vas deferens fuori dal sacco scrotale utilizzando le pinze di un orologiaio. Tenere il vas deferens con una coppia di pinze, e tagliarlo con forbici sottili (o cauterizzare con punte rosso-caldo di una seconda coppia di pinze). Rimuovere un frammento di 1 cm del condotto.
   NOTA: Se viene eseguita la cauterizzazione, tenere la punta della seconda coppia di pinze nella fiamma.
8. Ripetere la procedura di cui sopra per gli altri testiri. Suturare la pelle con suture assorbenti dell'acido poliglicolico e iniettare all'animale intraperitonelmente atipamezolo (0,5 mg/kg).
9. Mettere il ratto in una gabbia pulita su una piastra riscaldante fino a quando l'animale non si riprende dall'anestesia.
   NOTA: I maschi possono essere utilizzati negli accoppiamenti di prova dopo un periodo di recupero di 2 settimane. Dopo la sterilità è confermata, possono essere utilizzati per l'induzione pseudo-gravidanza.

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Risultati

Utilizzando il protocollo qui descritto, sono stati prodotti vettori lentivirali che trasportavano il costrutto Syn-TDP-43-eGFP (titro lv fisico 3,4 x 10⁸/L) e quindi potrebbero essere utilizzati per iniezioni di sottozonali embrionali a una cella. Solo gli embrioni con due pronuclei visibili sono stati sottoposti alla procedura. Il numero di iniezioni di sospensioni virali è stato determinato sperimentalmente. L'elevata efficienza dell'impianto e la mancanza simultanea di prole transgenica sono stati conside...

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Discussione

I progressi nelle tecnologie transgeniche hanno reso i modelli di roditori uno strumento inestimabile nella ricerca biomedica. Essi offrono l'opportunità di studiare le relazioni genotipo-fenotipo in vivo. Qui, presentiamo un'alternativa ampiamente disponibile per la transgenesi convenzionale mediante iniezioni pronucleari. L'uso della trasduzione genica lentivirale bypassa la necessità di microiniezioni impegnative perché i vettori virali possono essere iniettati sotto la zona pellucida. Questo approccio non influisc...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
7500 Real Time PCR System	Applied Biosystems
Aerrane (isoflurane)	Baxter	FDG9623
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes	Sigma	A5177-5EA
Atipam 5 mg/ml	Eurovet Animal Health BV	N/A	0.5 mg/kg
Baytril 25 mg/ml (enrofloksacin)	Bayer	N/A	5-10 mg/kg
Borosilicate glass capillaries with filament GC100TF-15	Harvard Apparatus Limited	30-0039	injection capillary
Bupivacaine 25 mg/ml	Advanz Pharma	N/A	0.25% in  0.9% NaCl
Butomidor 10 mg/ml (butorphanol  tartrate)	Orion Pharma	N/A	1 mg/kg
CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 35-mm	Greiner Bio-One	627160
CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 60-mm	Greiner Bio-One	628160
CellTram Oil	Eppendorf	5176 000.025
Cepetor (Medetomidine) 1 mg/ml	cp-pharma	N/A	0.5 mg/kg
Chorulon, Human Chorionic Gonadotrophin	Intervet	N/A	150 IU/ ml ml 0.9% NaCl
DMEM low glucose	Sigma Aldrich	D6048
DNase, RNase-free	A&A Biotechnology	1009-100
EmbryoMax Filtered Light Mineral Oil	Sigma	ES-005-C
Envelope protein coding plasmid for lentiviral vectors (VSVg plasmid)	ADDGENE	14888
FemtoJet	Eppendorf	4i /5252 000.013
Fetal Bovine Serum	Sigma Aldrich	F9665-500ML
Folligon, Pregnant Mare’s Serum Gonadotropin	Intervet	N/A	125 IU/ml in .9% NaCl
HEK 293T cells	ATCC	ATCC CRL-3216
Hyaluronidase from Bovine Testis	Sigma	H4272-30MG	0.5 mg/ml in M2 medium
Inverted Microscope	Zeiss	Axiovert 200
Ketamine 100mg/ml	Biowet Pulawy	N/A	50 mg/kg
Liquid Paraffin	Merck Millipore	8042-47-5
M16 medium EmbryoMax	Sigma	MR-016-D
M2 medium	Sigma	M7167
Magnesium Chloride 1M	Sigma Aldrich	63069-100ML
Microforge	Narishige	MF-900
Mineral Oil	Sigma	M8410-500ML
NaCl 0.9%	POLPHARMA OTC	N/A	sterile, 5ml ampules
Operation microscope	Inami Ophthalmic Instruments	Deca-21
Packaging system coding plasmid for lentiviral vectors  (delta R8.2 plasmid)	ADDGENE	12263
PEI reagent (Polyethylenimine, Mw ~ 25,000,),	Polysciences, Inc	23966-1
Penicilin-streptomycin	Sigma Aldrich	P0781-100ML
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture	Sigma Aldrich	806552-500ML
Puller	Sutter Instrument Co.	P-97
Reflex Clip Applier/Reflex Clips	World Precision Instruments	500345/500346
Safil, polyglycolic acid, braided, coated, absorbable threads	B.Braun Surgical	1048029
Stereomicroscope	Olympus	SZX16
Surgical Sewing Thread	B.Braun	C1048040
SYBR Green PCR Master Mix	Applied Biosystem	4334973
Tolfedine 4% (tolfenamic acid)	Vetoquinol	N/A	2 mg/kg
TransferMan NK2	Eppendorf	N/A
Trypsin EDTA solution	Sigma Aldrich	T3924-500ML
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima L-100 XP
VacuTip	Eppendorf	5175108.000	holders capillary
Vita-POS	Ursapharm	N/A	eye ointment
Warming Plate	Semic	N/A
Watchmaker Forceps	VWR	470018-868