Génération de rats transgéniques utilisant une approche vectorielle lentivirale

Résumé

Cet article vise à fournir la méthodologie pour la transgenèse lentivirale chez les embryons de rats à l’aide d’injections multiples d’une suspension de virus dans l’espace périvitelline zygote. Les rats femelles qui sont accouplés avec une souche masculine fertile avec une couleur de fourrure dominante différente est employée pour générer des mères adoptives pseudo-enceintes.

Résumé

Les modèles animaux transgéniques sont fondamentalement importants pour la recherche biomédicale moderne. L’incorporation de gènes étrangers dans les premiers embryons de souris ou de rats est un outil inestimable pour l’analyse de la fonction génique dans les organismes vivants. La méthode standard de transgenèse est basée sur le microinjectage de fragments d’ADN étrangers dans un pronucléus d’un ocrayte fécondé. Cette technique est largement utilisée chez la souris, mais reste relativement inefficace et techniquement exigeante chez d’autres espèces animales. Le transgène peut également être introduit dans des embryons à un étage par infection lentivirale, offrant une alternative efficace aux injections pronucléaires standard, en particulier chez les espèces ou les souches ayant une structure embryonnaire plus difficile. Dans cette approche, une suspension qui contient des vecteurs lentiviraux est injectée dans l’espace périvitelline d’un embryon de rat fécondé, qui est techniquement moins exigeant et a un taux de réussite plus élevé. Il a été démontré que les vecteurs lentiviraux intègrent efficacement le transgène dans le génome pour déterminer la génération de lignées transgéniques stables. Malgré certaines limitations (p. ex., les exigences de biosécurité de niveau 2, les limites de taille des fragments d’ADN), la transgenèse lentiviral est une méthode de transgenèse rapide et efficace. En outre, l’utilisation de rats femelles qui sont accouplés avec une souche masculine fertile avec une couleur de fourrure dominante différente est présentée comme une alternative pour générer des mères adoptives pseudo-enceintes.

Introduction

Depuis de nombreuses années, les rongeurs de laboratoire, comme les rats et les souris, ont été utilisés pour modéliser les conditions physiologiques et pathologiques humaines. La recherche sur les animaux a mené à des découvertes qui étaient inaccessibles par tous les autres moyens. Initialement, les études génétiques se sont concentrées sur l’analyse des désordres spontanément et phénotypes qui sont considérés pour imiter étroitement la condition humaine¹. Le développement de méthodes de génie génétique a permis l’introduction ou la suppression de gènes spécifiques pour obtenir un phénotype désiré. Par conséquent, la génération d’animaux transgéniques est reconnue comme une technique fondamentale dans la recherche moderne qui permet des études de la fonction génique dans les organismes vivants.

La technologie animale transgénique est devenue possible grâce à une combinaison de réalisations en embryologie expérimentale et en biologie moléculaire. Dans les années 1960, l’embryologiste polonais A. K. Tarkowski a publié les premiers travaux sur la manipulation des embryons de souris au cours des premiers stades du développement². En outre, les biologistes moléculaires ont développé des techniques pour générer des vecteurs d’ADN (c.-à-d., porteurs) pour l’introduction, entre autres, de l’ADN étranger dans le génome de l’animal. Ces vecteurs permettent la propagation de gènes sélectionnés et leur modification appropriée, selon le type de recherche qui est menée. Le terme « animal transgénique » a été introduit par Gordon et Ruddle³.

La première espèce largement acceptée qui a été utilisée dans la neurobiologie, la physiologie, la pharmacologie, la toxicologie, et beaucoup d’autres domaines des sciences biologiques et médicales était le rat de Norvège, Rattus norvegicus⁴. Cependant, en raison de la difficulté à manipuler les embryons de rats, la souris maison Mus musculus est devenue l’espèce animale dominante dans la recherche génétique⁵. Une autre raison de la primauté de la souris dans une telle recherche était la disponibilité de la technologie des cellules souches embryonnaires pour générer des animaux knock-out pour cette espèce. La technique la plus couramment utilisée de transgenèse (2 à 10 % de la progéniture transgénique par rapport à tous les animaux nés) est la microinjection de fragments d’ADN dans un pronucléus d’un oocyte fécondé. En 1990, cette approche, qui a été introduite pour la première fois chez la souris, a été adaptée pour les rats^6,7. La transgenèse de rat par injection pronucléaire est caractérisée par une efficacité inférieure⁸ comparée aux souris, qui est strictement liée à la présence de plasma élastique et de membranes pronucléaires⁹. Bien que la survie des embryons après manipulation soit de 40 à 50 % inférieure à celle des souris, cette technique est considérée comme une norme dans la génération de rats génétiquement modifiés¹⁰. D’autres approches qui peuvent garantir une incorporation transgène efficace et des taux de survie plus élevés de zygotes injectés ont été étudiées.

Le déterminant clé de l’expression transgène stable et de la transmission à la progéniture est son intégration dans le génome des cellules hôtes. Les lentivirus (VBL) ont la particularité d’être en mesure d’infecter à la fois les cellules de division et de non-division. Leur utilisation comme outil pour l’incorporation de gènes hétérologues dans les embryons s’est avérée très efficace¹¹, et les individus transgéniques sont caractérisés par l’expression stable du fragment d’ADN incorporé. L’efficacité des vecteurs lentiviraux a été confirmée pour la modification génétique des souris^12,13, rats^12,14, et d’autres espèces¹¹. Dans cette méthode, la suspension LV est injectée sous la zona pellucida de l’embryon au stade de deux pronuclées. Cette technique garantit essentiellement la survie à 100% des embryons parce que l’olémma reste inchangée. La production de suspensions LV de haute qualité et relativement fortement concentrées sont des facteurs cruciaux. Cependant, des concentrations plus faibles de suspensions de VL peuvent être surmontées par des injections répétées¹¹, ce qui augmente la quantité de particules virales à la surface de l’œuf tout en n’affectant pas l’intégration de membrane. Les embryons qui sont soumis à des injections répétées dans l’espace périvitelline se développent davantage, et la progéniture transgénique peut transmettre le transgène par la lignée germinale. L’efficacité de la production de rats transgéniques par transgenèse lentivirale peut atteindre 80 %¹².

Ici, nous décrivons la production du lentivirus recombiné dérivé du VIH-1 qui a été pseudotypé avec la protéine d’enveloppe de virus de stomatite vésiculaire (VSV) G. L’utilisation du pseudotype VSV de deuxième génération détermine la grande infectiosité des particules virales et permet la production de vecteurs très stables qui peuvent être concentrés par ultracentrifugation et cryoconservé. Après vérification de titer, les vecteurs sont prêts à être utilisés comme véhicule pour la livraison transgène dans les zygotes de rat Wistar albinos. Après une série d’injections, les embryons peuvent être cultivés du jour au lendemain et transférés à l’étape des deux cellules pour favoriser les mères. À ce stade, l’une des deux approches alternatives peut être envisagée. La procédure standard utilise les femelles pseudo-enceintes comme receveurs d’embryons. Cependant, lorsque le taux de grossesse est faible après l’accouplement avec des mâles vasectomisés, les embryons peuvent être implantés dans les femelles Enceintes Wistar/Sprague-Dawley (SD) qui sont accouplées avec des rats mâles fertiles avec une couleur de fourrure foncée (par exemple, Brown Norway [BN] rats). La couleur de la fourrure permet la distinction de la progéniture de la grossesse naturelle de la progéniture qui proviennent des embryons manipulés transférés.

Protocole

La production et l’application de vecteurs viraux étaient conformes aux lignes directrices du niveau 2 de la biosécurité et ont été approuvées par le ministère polonais de l’Environnement. Toutes les procédures expérimentales relatives aux animaux décrites ci-dessous ont été approuvées par le Comité local d’éthique. Les animaux étaient logés dans des cages ventilées individuellement à une température stable (21 à 23 oC) et dans une humidité (50 à 60 %) avec un accès ad libitum à l’eau et à la nourriture dans un cycle clair/obscurité de 12 h/12 h.

1. Production vectorielle lentivirale

1. Transfection des cellules HEK 293T
   REMARQUE : Le protocole présenté ici est conçu pour la transfection de vingt plats de culture de 10 cm qui produit environ 200 ml de vecteur brut supernatant.
   1. Cellules heK 293T de culture dans le milieu de DMEM qui est complétée avec le sérum bovin foetal (10%, v/v) dans un incubateur humidifié de CO₂ à 37 oC. Pour la transfection, préparer vingt plaques de 10 cm de diamètre et les graines de 1,5 à 2 x 10⁶ cellules HEK 293T par plat.
   2. Lorsque la confluence atteint 70 %, transfectez les cellules à l’aide d’un réactif en polyéthylénimine (PEI), pH 7,0, à un rapport de 3 g de l’Ile-du-Prince-Édouard par 1 g d’ADN.
      1. Préparer le mélange transfection pour cinq assiettes (préparer le nombre de répétitions en fonction du nombre total de plats). À 1 mL du Medium Aigle modifié (DMEM) de Dulbecco, ajoutez le mélange de trois plasmides afin qu’ils atteignent une quantité finale de 25 g de plasmid VSVg, 50 g de delta R8.2 et 50 g de plasmide codant.
      2. Pipette de haut en bas, et ajouter 125 l’île de l’Ile-du-Prince-Édouard à une concentration de 3 g/L. Incubate à température ambiante pendant 15 min, en inversant le tube trois fois pendant l’incubation. Ajouter 200 L du mélange transfection par assiette. Ensuite, incuber les plaques dans un incubateur de CO₂ humidifié à 37 oC.
2. Concentration de vecteurs lentiviraux
   1. Quarante-huit heures après la transfection, récoltez le milieu qui contient des particules de VBL. Utilisez des tubes coniques de 50 ml.
      REMARQUE : Lors de l’utilisation d’un plasmide avec une étiquette fluorescente, les cellules peuvent être visualisées à ce stade pour vérifier l’efficacité de la transfection. Une nouvelle partie du milieu DMEM peut être ajoutée, et les cellules peuvent être incubées pour un supplément de 24 h. Le rendement LV est comparable lorsqu’il est collecté aux points de temps de 48 et 72 h après la transfection.
   2. Centrifuge le milieu à 3.000 x g pendant 5 min et la température ambiante pour enlever les cellules détachées.
   3. Filtrer le supernatant (0,45 m) et le verser dans de nouveaux tubes.
      REMARQUE : Cette étape peut être omise.
   4. Ajouter DNase I (sans RNase, 1 g/mL) et MgCl₂ (1 mM), et incuber dans un bain d’eau à 37 oC pendant 15 min.
   5. Transférer les tubes de polyéthylène moyen à jetable, et l’ultracentrifugeuse dans un rotor oscillant à 115 000 x g et à 4 oC pour 1,5 h.
   6. Après centrifugage, égouttez doucement les parois des tubes des résidus moyens.
   7. Faire tremper la granule avec du salin stérile tamponné par phosphate (PBS; 70 à 80 ll par tube).
   8. Incuber pendant 2 h à 4 à 8 oC.
   9. Réutilisez les vecteurs viraux dans PBS en passant doucement à la pipe.
      CAUTION: Évitez la mousse.
   10. Transférer à un tube de centrifugeuse de 1,5 mL et une centrifugeuse à 7 000 x g et 4 oC pour 30 s. Transférer le supernatant dans un nouveau tube. Répétez cette étape jusqu’à ce qu’aucune granule de débris cellulaires ne soit visible.
   11. Aliquot et congeler à -80 oC. Évitez de recongeler l’aliquot LV.
3. Détermination du virus titer à l’aide d’une réaction quantitative en chaîne de polymérase
   REMARQUE : La titration des vecteurs viraux est effectuée à l’aide de PCR quantitatif (QPCR). Cette méthode est basée sur l’amplification d’un fragment d’ADN de 84 bp de long à double brin dans la longue région terminale de répétition du génome viral¹⁵.
   1. Préparer la courbe standard en faisant des dilutions en série du plasmide de codage LV : 1:500, 1:1,000, 1:5,000, 1:10,000, 1:100,000, et 1:1,000.000. Déterminez le nombre d’exemplaires du plasmide qui est utilisé pour la courbe standard. Utilisez la formule suivante : nombre d’copies/L (concentration [g/L] x 6,02 x 10²³ [nombre/mol]) / (660 [g/mol] x plasmid taille [bp]), où 6,02 x 10²³ nombre/mol est le numéro d’Avogadro, et 660 g/mol est le poids de bp.
      REMARQUE : Des calculatrices de numéros de copie en ligne peuvent être utilisées.
   2. Préparer les dilutions de la suspension lentiviral : 1:100, 1:500 et 1:1,000.
   3. Préparer le mélange de réaction (volumes par puits) : 10 l de QPCR Mastermix, 1 ll de l’apprêt avant de 10 M, 1 l de l’amorce inversée de 10 M et 7 L de H₂O. Pipette le mélange dans les puits de 96 plaques bien.
      REMARQUE : Apprêt avant : 5'-AGCTTGCCTTGAGTGCTTCA. Apprêt inversé: 5'-TGACTAAAAGGGTCTGAGGGA.
   4. Ajouter 1 l de chaque dilution standard et suspension lentiviral en triplicate.
   5. Exécuter le QPCR selon les paramètres suivants : 50 oC pour 2 min, 96 oC pour 5 min, et 35 cycles de 96 oC pour 20 s, 60 oC pour 40 s et 70 oC pendant 1 min, suivis de l’étape de la courbe de fonte : 95 oC pour 1 min et 60 c à 30 s.
   6. Analyser les résultats en comparant le nombre de molécules reçues pour chaque dilution à la courbe standard. Déterminer la concentration de molécules vectorielles que la moyenne de trois réplique pour chaque dilution.
      REMARQUE : La quantification présentée donne la concentration physique des particules virales. Il ne doit pas être traité comme un titer fonctionnel.

2. Génération de rats transgéniques

1. Superovulation et collecte d’embryons fécondés
   1. Administrer des gonadotropines.
      REMARQUE : Pour augmenter le nombre d’embryons recueillis (environ 30 par femelle), utilisez des femelles Wistar immatures de 5 semaines pour la stimulation hormonale.
      1. Le jour 1 (12 PM-1 PM), injectez intraperitoneally la gonadotropine sérique de la jument enceinte (PMSG ; 25 UI par femelle). Préparer 1 mL aliquots de solution de travail à une concentration de 125 UI/mL en dissolvant la poudre d’hormone dans 0,9% NaCl. Conserver à -20 oC jusqu’à 1 mois ou -80 oC pour un temps allant jusqu’à 6 mois.
      2. Le jour 3 (12 PM-1 PM), injectez intraperitoneally la gonadotrophine chorionique humaine (hCG ; 30 UI par femelle). Préparer 1 mL aliquots de solution de travail (150 UI/mL) en dissolvant la poudre d’hormone dans 0,9% NaCl. Conserver à -20 oC jusqu’à 1 mois ou -80 oC pour un temps allant jusqu’à 6 mois.
   2. Après l’administration de hCG, s’accouplent les femelles 1:1 avec des mâles sexuellement fertiles (3-10 mois).
   3. Le lendemain matin (jour 4 à 8-10 AM), vérifiez les femelles pour la présence d’une prise vaginale. Vérifiez l’ouverture vaginale pour la présence d’une prise d’accouplement blanchâtre, qui pour la meilleure visualisation devrait être vérifiée tôt le matin après la nuit d’accouplement. Pour la collecte d’embryons, n’utilisez que les femelles avec une prise visible.
   4. Recueillir des embryons à 10 heures. Sacrifiez les animaux pour exciser les oviductes et recueillir les oviductes dans un plat avec un support M2 pré-réchauffé.
      1. Transférer les oviductes dans un plat de 35 mm qui contient un milieu M2 préchauffé avec de l’hyaluronidase des testicules bovins à une concentration de 0,5 mg/mL.
      2. Ouvrez les parois de l’oviduct à l’aide de forceps fins sous un stéréomicroscope et appuyez sur l’ampulla (c’est-à-dire la partie gonflée de l’oviduct qui contient des embryons fécondés qui sont entourés de cellules cumulus) jusqu’à ce que les embryons soient libérés.
         REMARQUE : Hyaluronidase digère enzymatiquement les cellules de cumulus, libérant des embryons.
         CAUTION : L’exposition prolongée à l’hyaluronidase est nocive pour les embryons ; par conséquent, cette étape ne devrait pas durer plus de 5 min.
      3. Pour faciliter la libération d’embryons provenant de cellules cumulus, les pipette doucement de haut en bas à l’aide d’une pipette de transfert de verre qui est reliée à un tube d’aspirateur actionné par la bouche.
         1. Pour produire la pipette de transfert, tirez une pipette Pasteur en verre sur une flamme pour produire une pointe droite de 5 à 10 cm. Casser la pipette en laissant une pointe de 4 cm.
      4. Laver les embryons à quelques reprises dans le milieu M2 pour enlever l’hyaluronidase et les débris cellulaires. Transférer les embryons dans un plat de 60 mm qui contient des gouttes de M16 pré-équilibrés, recouvertes de paraffine liquide ou d’huile minérale, dans un incubateur humidifié de 37 oC avec une atmosphère de_{CO 2 de} 5 %.
2. Microinjection de vecteurs lentiviraux à l’embryon à un étage sous la zona pellucida
   REMARQUE : Utilisez des embryons à une cellule avec deux pronuclées visibles pour la microinjection(figure 1).
   1. Décongeler l’aliquot LV à température ambiante et la centrifugeuse à 10 000 x g et RT pendant 2 min pour pelleter les débris cellulaires restants.
   2. Configuration de micro-injection
      1. Préparer les pipettes en verre (capillaire en verre borosilicate) à l’aide d’une microforge. Tirez le capillaire de verre sur une flamme pour produire une pointe de 5 à 10 cm. Casser la pipette en laissant une pointe de 4 cm. Le diamètre extérieur doit être de 80 à 120 m.
         REMARQUE : Assurez-vous que la pointe de la pipette est parfaitement droite et lisse.
      2. Assembler la pipette tirée dans une microforge avec la pointe devant le filament de chauffage. Chauffer le filament très près de la pointe de la pipette et lui permettre de rétrécir à un diamètre de 15 m (environ 20 % de la taille de l’embryon). Placez la pipette perpendiculairement au filament chauffant, de 2 à 3 mm de la pointe de la pipette, et commencez à chauffer. Le verre ramollira. Chauffer jusqu’à ce qu’il atteigne un angle de 15 degrés.
      3. Préparer les capillaires en verre de borosilicate de microinjection avec un filament à l’aide d’un puller pipette. Insérer le capillaire dans la chambre de traction. Exécuter un essai de rampe (pour la première fois pour le nouveau verre et à chaque fois après avoir changé le filament). Réglez la chaleur à la valeur de la rampe -10, Pull à 100, Velocity à 150 et Time to 100.
         REMARQUE : Modifier les paramètres pour obtenir un capillaire d’injection optimal.
      4. Sous un capot de flux lamineur biosécurité, chargez environ 2 lil de la solution virale dans la pipette de microinjection avec une pointe de microchargeur.
      5. Préparer un plat de microinjection (couvercle de 60 mm de plat Petri) avec une goutte de 100 l de M2 moyen (au milieu), recouverte de paraffine liquide ou d’huile minérale.
      6. Montez la pipette de fixation et le capillaire de microinjection qui est chargé avec la solution virale à un micromanipulateur et un plat de microinjection sous un microscope inversé.
   3. Effectuez la microinjection.
      1. Transférer 15 à 20 embryons à un étage sur la chute M2 sur le plat de microinjection. Tenez l’embryon à l’aide d’une pipette de retenue.
      2. À l’aide du grossissement 400x, injectez la solution LV sous la zona pellucida à l’espace périvitelline à l’aide du capillaire en verre qui est connecté à un injecteur automatique. Tenez le capillaire sous la zona pellucida pendant un moment.
         REMARQUE : En utilisant une légère pression positive, la solution virale s’écoulera continuellement hors du capillaire d’injection, mais le volume de la suspension qui est livrée ne peut pas être contrôlé.
      3. À l’aide d’une pipette fine, remettre les embryons au plat de culture de l’incubateur à 37 oC dans une atmosphère de CO₂ de 5 %. Le nombre d’injections d’un zygote peut varier et peut être adapté en fonction de la concentration virale de vecteur.
         REMARQUE : Les embryons injectés peuvent être transférés à des mères adoptives au stade d’une cellule ou à un milieu O/N incubé dans le milieu M16 avant d’être transférés au stade à deux cellules. La culture in vitro prolongée des embryons de rats doit être évitée.
3. Transfert d’embryons injectés aux mères adoptives
   1. Préparez les mères adoptives en accouplant des femelles SD sexuellement matures avec des mâles BN fertiles ou avec des mâles SD vasectomisés (la procédure de vasectomie est décrite à la section 3 ci-dessous) le jour 3 (pour le transfert d’embryons au stade d’une cellule) ou au quatrième jour (pour le transfert d’embryons au stade à deux cellules).
      REMARQUE : Pour le transfert d’oviduct, utilisez 0.5 jours après coitum (dpc) femelles.
   2. Le lendemain matin, vérifiez les femelles SD pour une prise vaginale, et n’utilisez que ceux avec une prise visible.
   3. Effectuez le transfert d’embryons.
      REMARQUE : Conduisez la procédure chirurgicale avec des instruments stériles sous un stéréomicroscope. Avant le jour de la chirurgie, ciseaux autoclave, forceps fins, porte-aiguille, et porte-scalpel.
      1. Anesthésiez une femelle avec l’administration i.p. de la kétamine (50 mg/kg) et de la médénodine (0,5 mg/kg). Testez les réflexes pour confirmer l’anesthésie avant de commencer l’intervention chirurgicale.
      2. Injecter l’animal sous-cutanée avec de l’acide toléfenamique (2 mg/kg), du tartrate de butorphanol (1 mg/kg) et de l’enrofloksacine (5 à 10 mg/kg) pour prévenir l’inflammation, la douleur et l’infection, respectivement.
      3. Appliquer la lubrification de la pommade ophtalmique aux deux yeux pour prévenir le séchage cornéen. Rasez la fourrure du dos et stérilisez la peau avec un gommage chirurgical suivi de 70 % d’alcool à l’aide de tampons stériles non adhérants. Laisser sécher la peau.
      4. Injecter l’animal sous-cutanée avec 100 L de bupivacaine de 0,25% (anesthésique local) au site d’incision. Transférer l’animal en position couchée sur une surface propre sur un coussin chauffant dans le but d’un microscope chirurgical. Couvrir le rat d’un drapé stérile d’un petit trou coupé sur le bas du dos.
      5. Effectuer une incision cutanée d’environ 2 cm, parallèle à la colonne vertébrale lombaire.
      6. À l’aide de ciseaux pointus, faire une coupure dans la paroi abdominale. Prenez un coussin de graisse ovarienne à l’aide de forceps, et retirez l’ovaire et l’oviducte et placez-les sur de la gaze qui est mouillée avec 0,9% NaCl.
      7. Aspirer le milieu M2, trois bulles d’air et les embryons dans le capillaire de transfert. Nombre total recommandé d’embryons à transférer (unilatérales ou bilatérales) : femelle enceinte (embryons de 15 à 16 ans), pseudo-femelles (30 embryons).
      8. Faire une petite incision dans l’oviducte (entre l’infundibulum et l’ampulla) à l’aide de micro-ciseaux, et insérer la pipette de transfert dans l’oviducte.
      9. Expulser délicatement les embryons et les bulles d’air de la pipette vers l’oviducte. Avec des forceps émoussés, placez l’appareil reproducteur dans la cavité abdominale.
      10. Suture de la paroi abdominale avec de l’acide polyglycolique sutures absorbables et fermer l’incision de la peau avec des pinces de plaie. Selon le nombre d’embryons disponibles, répétez cette procédure pour l’autre oviducte.
      11. Injecter l’animal intraperitoneally avec l’atipamezole (0,5 mg/kg) pour inverser l’effet de l’anesthésie.
      12. Transférer l’animal dans une cage propre et le garder sur une plaque chauffante pour récupérer complètement de l’anesthésie. La livraison chez les rats se produit après 21 jours.
          REMARQUE : Lorsque les rats mâles BN sont utilisés pour l’accouplement, seuls les chiots blancs sont potentiellement transgéniques; les chiots bruns sont de grossesse naturelle.
      13. Recueillir des fragments de tissu (de préférence de l’oreille) au génotype de 3 semaines.

3. Vasectomie

REMARQUE : Avant le jour de la chirurgie, ciseaux autoclave, forceps fins et porte-aiguilles.

1. Anesthésiez un rat SD mâle de 5 semaines avec l’administration i.p. de la kétamine (50 mg/kg) et de la médénodine (0,5 mg/kg). Testez les réflexes pour confirmer l’anesthésie avant de commencer l’intervention chirurgicale.
2. Administrer de l’acide tolfenamic (2 mg/kg), du tartrate de butorphanol (1 mg/kg) et de l’enrofloksacine (5 à 10 mg/kg) sous-cutanée pour prévenir l’inflammation, la douleur et l’infection, respectivement.
3. Appliquer la lubrification de la pommade ophtalmique aux deux yeux pour prévenir le séchage cornéen. Placez le rat supine sur une surface propre sur un coussin chauffant, et stérilisez la peau sur les testicules avec des gommage chirurgicaux suivis de 70% d’alcool à l’aide de tampons stériles non adhérants. Laisser sécher la peau. Couvrir le rat d’un drapé stérile d’un petit trou coupé sur les testicules. Appuyez doucement sur l’abdomen pour exposer les testicules dans le sac scrotal.
4. À l’aide de ciseaux chirurgicaux, faites une incision de 0,5 cm au milieu du sac scrotal. Localiser le mur de ligne médiane (ligne blanchâtre) entre les testicules.
5. Faire une incision de 5 mm dans la membrane des testicules près du côté gauche de la paroi de la ligne médiane.
6. Poussez soigneusement les testicules vers la gauche et localisez les différenciations vas (entre les testicules et la ligne médiane) comme un conduit blanc avec un seul vaisseau sanguin.
7. Tirez doucement les vas deferens hors du sac scrotal à l’aide des forceps d’un horloger. Tenir le vas différencié d’une paire de forceps, et couper avec des ciseaux fins (ou cautériser avec des pointes rouges d’une deuxième paire de forceps). Retirer un fragment de 1 cm du conduit.
   REMARQUE : Si la cautérisation est effectuée, maintenez la pointe de la deuxième paire de forceps dans la flamme.
8. Répétez la procédure ci-dessus pour les autres testicules. Suture de la peau avec de l’acide polyglycolique sutures absorbables et injecter l’animal intraperitoneally avec de l’atipamezole (0,5 mg/kg).
9. Placez le rat dans une cage propre sur une plaque chauffante jusqu’à ce que l’animal se rétablisse de l’anesthésie.
   REMARQUE : Les mâles peuvent être utilisés dans les accouplements d’essai après une période de récupération de 2 semaines. Une fois la stérilité confirmée, ils peuvent être utilisés pour l’induction pseudo-grossesse.

Résultats

À l’aide du protocole décrit dans les présentes, des vecteurs lentiviraux qui transportaient la construction Syn-TDP-43-eGFP ont été produits (3,4 x 10⁸/L) et pourraient ensuite être utilisés pour des injections subzonales embryonnaires à un stade cellulaire. Seuls les embryons avec deux pronuclées visibles ont été soumis à la procédure. Le nombre d’injections de suspensions virales a été déterminé expérimentalement. Une efficacité élevée d’implantation et un manque simultané de pro...

Discussion

Les progrès des technologies transgéniques ont fait des modèles de rongeurs un outil inestimable dans la recherche biomédicale. Ils offrent l’occasion d’étudier les relations génotype-phénotype in vivo. Ici, nous présentons une alternative largement disponible pour la transgenèse conventionnelle par des injections pronucléaires. L’utilisation de la transduction de gène lentiviral contourne la nécessité d’exiger des microinjections parce que des vecteurs viraux peuvent être injectés sous la zona pel...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
7500 Real Time PCR System	Applied Biosystems
Aerrane (isoflurane)	Baxter	FDG9623
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes	Sigma	A5177-5EA
Atipam 5 mg/ml	Eurovet Animal Health BV	N/A	0.5 mg/kg
Baytril 25 mg/ml (enrofloksacin)	Bayer	N/A	5-10 mg/kg
Borosilicate glass capillaries with filament GC100TF-15	Harvard Apparatus Limited	30-0039	injection capillary
Bupivacaine 25 mg/ml	Advanz Pharma	N/A	0.25% in  0.9% NaCl
Butomidor 10 mg/ml (butorphanol  tartrate)	Orion Pharma	N/A	1 mg/kg
CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 35-mm	Greiner Bio-One	627160
CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 60-mm	Greiner Bio-One	628160
CellTram Oil	Eppendorf	5176 000.025
Cepetor (Medetomidine) 1 mg/ml	cp-pharma	N/A	0.5 mg/kg
Chorulon, Human Chorionic Gonadotrophin	Intervet	N/A	150 IU/ ml ml 0.9% NaCl
DMEM low glucose	Sigma Aldrich	D6048
DNase, RNase-free	A&A Biotechnology	1009-100
EmbryoMax Filtered Light Mineral Oil	Sigma	ES-005-C
Envelope protein coding plasmid for lentiviral vectors (VSVg plasmid)	ADDGENE	14888
FemtoJet	Eppendorf	4i /5252 000.013
Fetal Bovine Serum	Sigma Aldrich	F9665-500ML
Folligon, Pregnant Mare’s Serum Gonadotropin	Intervet	N/A	125 IU/ml in .9% NaCl
HEK 293T cells	ATCC	ATCC CRL-3216
Hyaluronidase from Bovine Testis	Sigma	H4272-30MG	0.5 mg/ml in M2 medium
Inverted Microscope	Zeiss	Axiovert 200
Ketamine 100mg/ml	Biowet Pulawy	N/A	50 mg/kg
Liquid Paraffin	Merck Millipore	8042-47-5
M16 medium EmbryoMax	Sigma	MR-016-D
M2 medium	Sigma	M7167
Magnesium Chloride 1M	Sigma Aldrich	63069-100ML
Microforge	Narishige	MF-900
Mineral Oil	Sigma	M8410-500ML
NaCl 0.9%	POLPHARMA OTC	N/A	sterile, 5ml ampules
Operation microscope	Inami Ophthalmic Instruments	Deca-21
Packaging system coding plasmid for lentiviral vectors  (delta R8.2 plasmid)	ADDGENE	12263
PEI reagent (Polyethylenimine, Mw ~ 25,000,),	Polysciences, Inc	23966-1
Penicilin-streptomycin	Sigma Aldrich	P0781-100ML
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture	Sigma Aldrich	806552-500ML
Puller	Sutter Instrument Co.	P-97
Reflex Clip Applier/Reflex Clips	World Precision Instruments	500345/500346
Safil, polyglycolic acid, braided, coated, absorbable threads	B.Braun Surgical	1048029
Stereomicroscope	Olympus	SZX16
Surgical Sewing Thread	B.Braun	C1048040
SYBR Green PCR Master Mix	Applied Biosystem	4334973
Tolfedine 4% (tolfenamic acid)	Vetoquinol	N/A	2 mg/kg
TransferMan NK2	Eppendorf	N/A
Trypsin EDTA solution	Sigma Aldrich	T3924-500ML
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima L-100 XP
VacuTip	Eppendorf	5175108.000	holders capillary
Vita-POS	Ursapharm	N/A	eye ointment
Warming Plate	Semic	N/A
Watchmaker Forceps	VWR	470018-868