通过在空气-液体界面中暴露培养的人类肺细胞，评估空气中颗粒的急性吸入毒性

摘要

我们提供一个强大、可转移和预测性的体外暴露系统，通过在空气-液体界面（ALI）暴露培养的人类肺细胞来筛选和监测空气中的颗粒，其急性肺细胞毒性。

摘要

在这里，我们提出了一个专门设计的模块化体外暴露系统，使在ALI培养的人类肺细胞均匀地暴露于气体，颗粒或复杂的大气（如香烟烟雾），从而提供现实的生理人类阿尔皮拉尔区域的表层暴露在空气中。与采用线性气溶胶制导的连续曝光模型相比，径向流系统的模块化设计满足测试大气连续生成和输送到电池的所有要求，均匀分布和沉积粒子和大气的连续去除。这种接触方法主要设计用于细胞暴露于空气中的颗粒，但可以适应液体气溶胶和剧毒和腐蚀性气体的暴露，具体取决于气溶胶生成方法和接触模块的材料.

在最近完成的验证研究框架内，该暴露系统被证明是一种可转移、可重复和预测性筛选方法，用于对空气中颗粒的急性肺细胞毒性进行定性评估，从而可能减少或取代通常提供这种毒理学评估的动物实验。

引言

吸入有毒的空气中颗粒是一个公共卫生问题，导致世界各地的多种健康风险，每年有数百万人死亡^。气候变化、持续的工业发展以及对能源、农业和消费品的需求增加，使得近年来肺病的增多是^{3、4、5、6。}对可吸入物质的急性吸入毒性的认识和评估为危害评估和风险管理提供了依据，但^{这类物质种类}繁多^，7、8仍然缺乏这方面的信息。自 2006 年以来，欧盟化学品立法 REACH（化学品注册、评估、授权和限制）要求现有和新引进的产品在投放市场之前，必须经过毒理学特征，包括吸入途径。因此，REACH侧重于替代和无动物的方法，实现"3R"原则（替换，细化和减少动物实验）和使用适当的体外模型^9。近年来，为了评估空气中颗粒^{5、7、10、11}的急性吸入毒性，已经开发出许多不同的和适当的非动物吸入毒性测试模型（例如体外细胞培养、片上肺模型、精密切肺切片（PCLS）。）。在体外细胞培养模型方面，培养的细胞可以在水下条件下或ALI（图1）中暴露。然而，在评价空气中化合物特别是颗粒的毒性方面，水下暴露研究的有效性是有限的。水下接触技术与人体体内情况不符;覆盖细胞的细胞培养基可能影响物理化学性质，从而影响测试物质^12、13的毒性。ALI体外吸入模型允许细胞直接暴露于测试物质，不受细胞培养基与测试颗粒的干扰，从而模仿人类接触，比水下暴露^12、14具有更高的生理和生物相似性。

然而，对于REACH等监管过程，急性吸入毒理学领域只有动物模型可用，^{因为迄今为止，}还没有一种替代的体外方法得到充分的验证和正式接受。为此，测试模型必须根据欧盟动物试验替代实验室（EURL-ECVAM）原则的要求对测试有效性¹⁵进行验证。

以前的审前研究和最近完成的验证研究成功地证明了CULTEX RFS暴露系统的应用领域及其可转移性、稳定性和可重复性^13。该暴露系统是一种基于体外细胞的暴露系统，由于其径向气溶胶分布概念和测试气溶胶在细胞¹⁶的连续流动中连续流动，使细胞能够均匀地暴露在ALI的气体、颗粒或复杂大气（如香烟烟雾）中。该径向流系统的基本模块包括入口适配器、带径向气溶胶分布的气溶胶导向模块、采样和插座模块以及带手轮的锁定模块（图 2）。生成的颗粒通过入口适配器和气溶胶引导模块到达细胞，并沉积在细胞培养插件上，这些入口位于采样模块的三个径向排列的暴露室中。气溶胶导向模块和取样模块可以通过连接到外部水浴¹⁷进行加热。

在这两项研究的框架内，A549细胞被用于所有暴露实验。细胞系A549是一种人类不朽的上皮细胞系，其特征非常好，在众多毒理学研究中已被用作II型阿尔韦拉上皮细胞的体外模型。细胞的特点是乳腺体，生产表面活性剂和一些炎症相关因素^18。它们还显示支气管上皮细胞的特性，由于其粘液生产^19。此外，可以在 ALI 进行培养。虽然这种细胞系缺乏建立细胞-细胞接触，这些细胞的培养是更方便，成本更低，其结果与原细胞²⁰相比与供体无关。

A549细胞被播种在6孔细胞培养插件（PET膜，4.67厘米^2，孔径0.4毫米），密度为3.0 x10⁵细胞每插件，并在水下条件下培养24小时。然后，在三个独立的实验室中，细胞暴露于清洁空气和三种不同的暴露剂量（25，50和100微克/厘米^2）的20个测试物质在ALI。暴露剂量与沉积时间相关，导致在15、30或60分钟后，细胞的恒定颗粒速率为25微克/cm 2，50μg/cm²和100μg/cm^2。 然而，沉积的颗粒在沉积后没有被冲走，而是留在细胞上24小时。因此，粒子的沉积时间为15、30和60分钟，但细胞的暴露总共持续了24小时。试验物质的沉积率是在初步实验中根据^{以往方法确定的}。

使用细胞活力测定测定，在颗粒沉积后24小时评估细胞作为毒性指标的可毒性性。特别注重清洁空气控制的质量、暴露协议的优化和改进、实验室内和实验室间的可重复性以及建立预测模型（PM）。导致细胞活力下降低于 50% 的物质 （PM 50%）或 75%（PM 75%）在三种接触剂量中的任何一次都被认为具有急性吸入危险。结果然后比较现有的体内数据（根据经合组织测试指南（TG）403或TG 436^21，22至少一项可靠的研究），导致整体协调度为85%，特异性为83%，灵敏度为88%23。

除了测量细胞活力外，还可以评估其他终点，如细胞因子释放、通过LDH测定检查细胞解酶或膜完整性，但验证研究不需要。因此，接触系统（例如，CULTEX RFS）被证明是一种预测性筛选系统，用于对被测试的空气颗粒的急性吸入毒性进行定性评估，是动物试验的一种有前途的替代方法。建议使用此曝光系统对空气中的颗粒进行暴露实验，建议采用以下方案。

研究方案

注:一个暴露实验的协议为期三天。

第1天

1. 细胞的一般准备和培养

注:人类肺腺癌上皮细胞系A549用于暴露实验。细胞必须在无菌条件下处理。可使用其他适合在ALI种植的细胞系。

1. 制备生长介质（Dulbeco的最小必需介质（DMEM），辅以10%胎儿牛血清（FBS）和5微克/mL金霉素）和接触介质（DMEM，辅以5微克/mL根霉素和最终HEPES浓度为100mM）。
2. 培养A549细胞在37°C生长培养基中，在含有5%CO2的加湿环境中。
3. 在生长培养基的14 mL中培养细胞培养瓶75cm 2（T-75），直到分裂前汇合80-90%（每2-3天）和35个通道。
4. 计算悬浮量和所需数量的细胞培养插入（三个细胞培养插件作为培养箱控制和细胞培养插件，用于清洁空气和颗粒暴露）和细胞培养板。
5. 在胰蛋白酶化和细胞播种之前，在6孔板的每个孔中加入2.5 mL的回火生长培养基。将细胞培养物插入而不带细胞的插入物小心地放入孔内，并在每个细胞培养物插入时添加1 mL生长培养基。在培养箱中孵育6孔板至少30分钟（37°C，5%CO₂）。

2. 细胞胰蛋白化

1. 在37°C和胰蛋白酶/EDTA（0.05%/）下，磷酸酶缓冲盐水（PBS）和生长介质0.02%)溶液在室温下。
2. 从细胞培养瓶中吸出细胞培养基，用8mL的预热PBS仔细清洗细胞。
3. 取出PBS，加入2 mL的胰蛋白酶/EDTA（0.05%/0.02%)溶液，并在37°C的培养箱中孵育6分钟。在显微镜下控制分离过程。
4. 通过加入8 mL预热生长培养基，在烧瓶上轻轻敲击侧向，分离细胞，并通过上下反复移液来重新悬浮细胞，从而中和胰蛋白酶活性。
5. 将细胞悬浮液转移到50 mL管中。确定进一步手术的细胞数（例如，细胞的播种、细胞的通过）。

3. 确定细胞号

注:细胞浓度是使用细胞计数器或计数室确定的。

1. 在装有10 mL等托尼溶液的杯中稀释100μL的细胞培养悬浮液。缓慢倾斜杯子，不要摇晃。
2. 根据A549细胞的细胞特异性测量参数，确定可存活细胞数/mL和细胞活力。

4. 细胞在细胞培养插件中的微孔膜上播种

注:曝光系统配有特殊适配器，可使用来自不同供应商和不同尺寸的商业刀片。对于这些暴露实验，使用了6孔板和相应的细胞培养插件。所有工作步骤都必须在无菌条件下完成。

1. 在无菌细胞培养条件下（层流）提供预热生长介质。
2. 制备足够高体积的细胞悬浮液，细胞浓度为3.0 x 10⁵细胞/mL。
3. 回火板30分钟后，在细胞培养物插入和种子1 mL的A549细胞的培养基中吸出每个细胞培养物中的密度为3.0 x10⁵个细胞/mL的介质。通过柔和的摇动来分配细胞悬浮液。
4. 用细胞悬浮液孵育细胞培养插件24小时（37°C和5%CO_2）。

5. 压榨测试物质

注:使用完全可控的液压机将测试物质压入粉末蛋糕中。压机包装的最大力为 18 kN，显示为压机包装的当前机油压力（bar）。未知测试物质的压压条件（压力、按压时间）必须在初步测试中确定和特征。根据某种物质的压榨特性，可以使用不同的冲压参数和类型的压柱塞。

注意:在压压有毒或危险物质时，请佩戴防护设备。

1. 通过压机正面的时间控制设置按压时间。
2. 打开压缩空气阀上的压缩空气供应。使用压力机前侧或压缩空气供应的压缩空气阀上的压力调节器，将压缩空气压力设置为大约 2 bar（由前侧压力表指示）。拉出抽屉，按下按压按钮并读取数字压力开关上的压压。
   1. 如果压力过高或过低，请只读取压力调节器处的压力。
3. 组装物质容器并确保玻璃缸正确居中（补充图1）。在物质容器中填充少量的测试物质。将柱塞插入物质容器，并稍微来回转动，以均匀地将粉末均匀地分配在容器中。
4. 将装有柱塞的物质容器放在抽屉中，然后按下按钮。压机的液压活塞移动到柱塞上，并在设定压力时间内对测试物质施加压力。打开抽屉并拆下柱塞。
5. 重复步骤 5.3 和 5.4，直到物质容器至少已满一半。
6. 完成压榨工作后，从抽屉中取出物质容器，将其倒置以去除松散和沉积的颗粒。
7. 如果当天不需要该物质容器，则用副膜关闭物质容器，以防止测试物质干燥或吸收水分。

第2天

6. 曝光系统的组装和连接外围设备

注:图3、补充图2及补充图3提供了更详细的视图。根据制造商的说明组装模块和气溶胶发生器。

1. 将曝光系统放在一个实心均匀的表面上，供水面向前方。将质量流量控制器与气溶胶发生器和连接到模块的三颈瓶连接，以便清洁空气曝光。
2. 连接流量控制器和真空泵。将流量控制器中的管与气溶胶导向模块附件上的管接头连接。将流量控制器另一侧的管与真空泵连接。确保流量从模块通过流量控制器流向真空泵。
3. 将水浴与加热供水连接。供水从水浴到气溶胶引导模块上的进水器。将气溶胶导向模块的出水口与取样模块的水入口连接。用从取样模块的出水口连接到水浴连接圆。
4. 将气溶胶发生器（包括雾化器）靠近暴露模块，用大型微过滤器连接除尘器和暴露和清洁空气模块的多余管路，以及用小型微过滤器吸入接触室（例如，一次性过滤器）。Elutriator 用作生成的颗粒大气的储层，并保留大于约 7 μm 的颗粒，而较小的颗粒则被输送到暴露模块。
5. 通过 USB 电缆将用于控制气溶胶生成的计算机连接到气溶胶发电机顶部的 USB 端口，并将电源连接到电源端口。将电源单元的交流电源插头连接到插座 （220-240 V）。
6. 用两个泵连接介质电源和拆卸管道。介质也可以手动加注，而不是使用泵进行介质供应。

7. 为清洁空气和颗粒暴露做好准备

1. 打开真空泵、流量控制器和水浴（37°C），预热时间至少为 30 分钟。
2. 打开压缩空气供应。将气溶胶发生器的供应管线的质量流量控制器设置为 8 L/min，将供气管线设置为 3 L/min。关闭质量流量控制器的选项卡。
   注:这些值可能因测试物质的特性而异。
3. 通过计算机调节流量控制器以调节模块流量（1.5 升/分钟）和造型室吸气（30 mL/min）。

8. 径向流系统的泄漏试验

注:必须在真空下和两个模块（曝光和清洁空气模块）执行泄漏检查，以确保模块已正确重新组装。

1. 从气溶胶导向模块上拆下进气适配器和冷凝水反射器。用插头关闭气溶胶导向模块中的三个气溶胶进气孔，并在取样模块上用虚拟活门连接中等供应连接。
2. 将没有过滤器的真空管与气溶胶导向模块的管接头连接。使用手轮关闭模块并测量流量控制器的值。收盘后，值应降低一些分钟，低于 5 mL/min。
3. 防渗透性检查后，拆下所有插头和虚拟活门，将进气适配器和冷凝水反射器插入气溶胶导向模块，并连接管道以进行中等供应和拆卸。

9. 气溶胶生成

1. 启动计算机和软件 （补充图 4）.通过双击计算机桌面上的气溶胶发生器启动按钮启动气溶胶发生器软件。出现一个消息窗口，询问是否应重置设置。如果当天首次启动软件，请单击"是"。将"滑动位置"和"刮刀位置"的值设置为默认值。单击"否"可保持"滑动位置"和"刮刀位置"的值，否则幻灯片未位于起始位置。
2. 将物质刮刀拧入管道，该管道位于气溶胶发生器顶部的中央开口处。
   注:根据印刷机的特性，可以使用不同类型的物质刮刀。
3. 如果物质刮刀不在最低位置，请使用按钮"定位模式"。
4. 将压榨测试材料倒置在物质刮刀上的物质容器。确保物质容器的玻璃朝前。确保物质容器中的两个孔适合气溶胶发生器顶部的两个销。将锁板放在物质容器上的插槽中，拧紧黑色螺钉。
5. 将进给（0.24 到 20 mm/h） 和旋转（1 到 800 转/小时） 的值更改为所需的设置。通过增加或降低进给值或载运气体流速，可以改变颗粒浓度。
6. 使用向下箭头将带物质容器的滑块向下推，直到物质刮刀靠近压榨物质。
7. 轻触质量流量控制器，打开气溶胶发电机的压缩空气供应，然后点击"开始"按钮启动气溶胶生成。将进给速率设置为 15-20 mm/h，以避免等待时间过长。
8. 通过用小手电筒观察细尘云（从 Elutriator 玻璃管后面放置）来控制正确的颗粒生成。当第一个气溶胶蒸汽持续到达 Elutriator 并单击"停止"按钮时，将"馈送"的值更改为所需的设置。

10. 暴露实验

1. 使用预热的曝光介质启动介质电源，并填充采样模块，直到模块打开时覆盖下管。使用中型泵或手动填充介质（每个曝光室 25 mL）。
2. 将盲细胞培养插入（不带单元格的插入）插入曝光模块。向下泵送曝光介质，直到下管覆盖介质，刀片的下侧与介质接触。
3. 启动气溶胶发生器，关闭暴露模块，并将暴露模块连接到气溶胶发生器的暴露模块出口。在开始接触之前，为气溶胶发生器提供至少 20-30 分钟的提前期，以便稳定生成颗粒。
4. 在提前期为培养箱控制和暴露的细胞培养物插入准备孵化后培养板。每孔加入1.5 mL的生长介质，并在培养箱中孵育板（37°C，CO_2）。
5. 提前期后，用橡胶塞密封 Elutriator 的曝光模块出口，然后拆下百叶窗刀片。重新加注曝光介质（使用泵或手动加注），直到下水管覆盖介质。现在，使用质量流量控制器的水龙头（3 L/min）打开清洁空气模块的压缩空气供应
6. 在钳子的帮助下，从 6 孔板中取出细胞培养插件。通过倒入刀片并吸气，小心地从细胞培养物中倒入生长介质，并使用移液器丢弃残留液体。将刀片放在两个模块的暴露室、曝光和清洁空气模块中。
7. 通过将暴露模块与气溶胶发生器的暴露模块出口和清洁空气模块同时连接到载运气体供应处，关闭模块并开始暴露实验。
   注:通过增加/减少进给值、载运气体流速或曝光时间，可以改变颗粒浓度。
8. 完成实验后，断开曝光和清洁空气模块，并密封曝光模块出口。
9. 单击"停止"按钮，停止压缩空气供应和气溶胶发生器。
10. 打开曝光和清洁空气模块，并使用钳子将细胞培养物插入准备好的孵化板。在 ALI 孵育 6 孔板 24 小时（37 °C，5% CO_2）。
    注:如果计划进行进一步的曝光实验，请重复步骤 10.5-10.10。
11. 将用作培养箱控制的细胞培养物插入到 ALI，在暴露的细胞培养插入的相同条件下，在 ALI 孵育 24 小时 （37 °C， 5% CO_2）。
12. 使用按钮"定位模式"卸下物质容器。单击右上角的X关闭气溶胶发生器软件并关闭计算机。
13. 完成所有暴露实验后，清洁气溶胶发生器和两个暴露模块。如果测试物质将在未来几天内进一步使用，则用副薄膜关闭物质容器。

第3天

11. 细胞活力

注:使用WST-1测定测量线粒体活性，在颗粒沉积后24小时确定细胞活力。测定是按照制造商的协议进行的。细胞活力也可以通过使用其他细胞活力测试（例如XTT）来确定。

1. 在37°C下调节生长介质，并解冻WST-1溶液，防止光线照射。每口井准备适当数量的6孔生长培养基板，并在孵化器中孵育板材。
2. 通过在生长培养基中稀释足够数量的 WST-1 1:7 来制备 WST-1 稀释
3. 在新的制备的 6 孔板中，在曝光后 24 小时插入细胞培养物插入。将新鲜制备的 WST-1 溶液添加 1 mL 到每个细胞培养插件。小心地摇动板，以便将溶液均匀地分布在细胞上。用细胞培养物插入物孵育6孔板1小时（37°C，CO_2）。
4. 将100 μL的上清液从每6孔转移到96孔板中，以三孔为单位。使用微板读片器测量参考波长为 650 nm 的 450 nm 的吸光度。

12. 统计数字

1. 将单个培养箱对照的细胞活力标准化为100%。
2. 表达暴露细胞相对于单个培养箱对照的可行性。将测试物质的细胞毒性与各自的培养箱对照进行比较，并用作毒性指标。

结果

CULTEX RFS 是专门设计的模块化体外暴露系统，可在 ALI 处实现细胞的直接和均质暴露。在前一项审前研究中，成功地证明了该暴露系统的总体适用性及其可转移性、稳定性和可重复性。在最近由德国联邦教育和研究部资助的一个研究项目中，该暴露系统被成功验证，并被建立为被测化合物急性吸入危害的预测模型（PM）。由于清洁空气控制的质量在验证前研究期间被证明是?...

讨论

近年来，为了获取有关可吸入颗粒物急性吸入危害的信息，并根据3R原理²⁵减少和替换动物实验，开发了许多非动物吸入毒性试验模型。

在细胞培养模型方面，细胞的暴露可以在水下条件下或在ALI进行。在水下条件下暴露细胞可能会影响物理化学性质，从而影响测试物质¹²的毒性。然而，体外ALI吸入模型模拟了比水下暴露更高的生物和生理?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells
A549	ATCC	CCL-185
Cell culture medium and supplies
DMEM	Biochrom, Berlin, Germany	FG 0415	used as growth medium
DMEM	Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany	22320	used as exposure medium
FBS superior	Biochrom, Berlin, Germany	S 0615
Gentamycin (10mg/mL)	Biochrom, Berlin, Germany	A 2710
HEPES 1M	Th. Geyer, Renningen, Germany	L 0180
PBS	Biochrom, Berlin, Germany	L 1825
Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%)	Biochrom, Berlin, Germany	L 2143
Cell culture material
CASY Cups	Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany	REF 05651794
Cell culture plates	Corning, Wiesbaden, Germany	3516	6­-well plates
Corning Transwell cell culture inserts	Corning, Wiesbaden, Germany	3450	24mm inserts; 6-­well plates; 0.4 µm
Chemicals
CASYton	Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany	REF 05651808001
Compressed Air (DIN EN 12021)	Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschleißheim, Germany	2290152
WST-1	Abcam, Cambridge, United Kingdom	ab155902
Instruments + equipment
CASY Cell Counter	Schärfe System GmbH, Reutlingen, Germany
Circulation thermostat	LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany	Ecoline RE 100
CULTEX HyP - Hydraulic Press	Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX insert sleeve	Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for particle exposure)	Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for clean air exposure)	Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX supply
Flow controller 0-30 ml/min (IQ-Flow)	Bronkhorst Deutschland Nord GmbH
Flow controller 0-1,5 l/min (EL-Flow)	Bronkhorst Deutschland Nord GmbH
Filters (large)	Munktell & Filtrak GmbH, Sachsen, Germany	LP-050	Munktell Sterile Filter; Particle retention efficiency > 99,999%
Filters (small)	Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany	9933-05-DQ	Balston disposable filter
Medium pump	Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany	Ismatec IPC High Precision Multichannel Dispenser	digital peristaltic pump
Microplate Reader Infinite M200 Pro	Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany
Vakuum pump	KNF, Freiburg, Germany	N86 KT.18
Vögtlin mass flow controller 0,2-10 l/min	TrigasFI GmbH	Vögtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20
Water Bath	LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany	Ecoline Staredition RE 104