Bewertung der akuten Inhalationstoxizität von Luftpartikeln durch Aussetzen kultivierter menschlicher Lungenzellen an der Luft-Flüssig-Schnittstelle

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein robustes, übertragbares und prädiktives In-vitro-Expositionssystem für das Screening und die Überwachung von Partikeln in der Luft hinsichtlich ihrer akuten lungenzytotoxizität durch die Exposition kultivierter menschlicher Lungenzellen an der luft-flüssigen Schnittstelle (ALI).

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein speziell entwickeltes modulares In-vitro-Expositionssystem, das die homogene Exposition kultivierter menschlicher Lungenzellen am ALI gegenüber Gasen, Partikeln oder komplexen Atmosphären (z.B. Zigarettenrauch) ermöglicht und somit eine realistische physiologische Exposition der apikalen Oberfläche des menschlichen Alveolarbereichs gegenüber Luft. Im Gegensatz zu sequenziellen Belichtungsmodellen mit linearer Aerosolführung erfüllt der modulare Aufbau des Radialstromsystems alle Anforderungen an die kontinuierliche Erzeugung und den Transport der Prüfatmosphäre zu den Zellen, eine homogene Verteilung und partikelund die kontinuierliche Entfernung der Atmosphäre. Diese Expositionsmethode ist in erster Linie für die Exposition von Zellen gegenüber Partikeln in der Luft konzipiert, kann aber je nach Aerosolerzeugungsmethode und Material der Expositionsmodule an die Exposition von flüssigen Aerosolen und hochgiftigen und aggressiven Gasen angepasst werden. .

Im Rahmen einer kürzlich abgeschlossenen Validierungsstudie wurde dieses Expositionssystem als übertragbares, reproduzierbares und prädiktives Screening-Verfahren zur qualitativen Bewertung der akuten lungenzytotoxizität von Partikeln in der Luft nachgewiesen. Tierversuche, die normalerweise diese toxikologische Bewertung ermöglichen würden, potenziell zu reduzieren oder zu ersetzen.

Einleitung

Das Einatmen giftiger Partikel in der Luft ist ein Problem der öffentlichen Gesundheit, was zu einer Vielzahl von Gesundheitsrisiken weltweit und vielen Millionen Todesfällen jährlich^1,2führt. Der Klimawandel, die fortschreitende industrielle Entwicklung und die steigende Nachfrage nach Energie,Agrar- und Konsumgütern haben in den letzten Jahren zum Anstieg der Lungenerkrankungen beigetragen^3,4,5,6. Die Kenntnis und Bewertung von inhalierbaren Stoffen in Bezug auf ihre akute Inhalationstoxizität bilden die Grundlage für die Risikobewertung und das Risikomanagement, aber diese Informationen fehlen noch für eine breite Palette dieser Stoffe^7,8. Seit 2006 schreibt das EU-Chemikalienrecht REACH (Registration, Evaluation, Authorization and Restriction of Chemicals) vor, dass bereits bestehende und neu eingeführte Produkte vor dem Inverkehrbringen einer toxikologischen Charakterisierung unterzogen werden, einschließlich der Inhalationsroute. REACH konzentriert sich daher auf alternative und tierfreie Methoden, die Umsetzung des "3R"-Prinzips (Ersatz, Verfeinerung und Reduzierung von Tierversuchen) und die Verwendung geeigneter In-vitro-Modelle⁹. In den letzten Jahren wurden viele verschiedene und adäquate nicht-tierische Inhalationstoxizitätstestmodelle (z. B. In-vitro-Zellkulturen, Lungen-auf-einen-Chip-Modelle, präzisionsgeschnittene Lungenscheiben (PCLS)) entwickelt, um die akute Inhalationstoxizität von Partikeln in der Luft^5,7,10,11zu bewerten. In Bezug auf In-vitro-Zellkulturmodelle können kultivierte Zellen unter Getauchtbedingungen oder am ALI (Abbildung 1) exponiert werden. Die Gültigkeit von Unterstauchexpositionsstudien ist jedoch im Hinblick auf die Bewertung der Toxizität von Luftverbindungen, insbesondere Partikeln, begrenzt. Die Techniken der untergetauchten Exposition entsprechen nicht der menschlichen in vivo-Situation; das Zellkulturmedium, das die Zellen bedeckt, kann die physikalisch-chemischen Eigenschaften und damit die toxischen Eigenschaften einer Prüfsubstanz^12,13beeinflussen. ALI In-vitro-Inhalationsmodelle ermöglichen die direkte Exposition von Zellen gegenüber den Prüfsubstanzen ohne Interferenz des Zellkulturmediums mit Testpartikeln, wodurch die Exposition des Menschen mit höherer physiologischer und biologischer Ähnlichkeit als untergetauchte Expositionen^12,14imitiert wird.

Für regulatorische Prozesse wie REACH stehen jedoch nur Tiermodelle im Bereich der akuten Inhalationstoxikologie zur Verfügung, da bisher keine alternativen In-vitro-Methoden ausreichend validiert und offiziell akzeptiert wurden¹⁴. Zu diesem Zweck müssen Testmodelle gemäß den Anforderungen des Referenzlabors der Europäischen Union für Alternativen zu Tierversuchen (EURL-ECVAM) zur Testgültigkeit¹⁵validiert werden.

Eine frühere Vorvalidierungsstudie und eine kürzlich abgeschlossene Validierungsstudie haben erfolgreich den Anwendungsbereich des CULTEX RFS-Expositionssystems und seine Übertragbarkeit, Stabilität und Reproduzierbarkeit¹³nachgewiesen. Dieses Expositionssystem ist ein in vitro zellbasiertes Expositionssystem, das eine homogene Exposition von Zellen gegenüber Gasen, Partikeln oder komplexen Atmosphären (z. B. Zigarettenrauch) am ALI aufgrund seines radialen Aerosolverteilungskonzepts und der Leitung des Testaerosols in einem kontinuierlichen Fluss über die Zellen¹⁶ermöglicht. Das Grundmodul dieses Radialdurchflusssystems besteht aus dem Einlassadapter, dem Aerosolführungsmodul mit radialer Aerosolverteilung, dem Probenahme- und Sockelmodul und einem Verriegelungsmodul mit Handrad (Abbildung 2). Die erzeugten Partikel gelangen über den Einlassadapter und das Aerosolführungsmodul in die Zellen und werden auf den Zellkultureinsätzen abgelagert, die sich in den drei radial angeordneten Belichtungskammern des Probenahmemoduls befinden. Das Aerosolführungsmodul sowie das Probenahmemodul können durch Anschluss an ein externes Wasserbad¹⁷beheizt werden.

Im Rahmen beider Studien wurden A549-Zellen für alle Expositionsexperimente eingesetzt. Die Zelllinie A549 ist eine humanverewigte Epithelzelllinie, die sehr gut charakterisiert ist und als In-vitro-Modell für Typ-II-Alveol-Epithelzellen in zahlreichen toxikologischen Studien verwendet wurde. Die Zellen zeichnen sich durch lamellenkörper, die Produktion von Tensid und eine Reihe von entzündungsrelevanten Faktoren¹⁸aus. Sie zeigen auch Eigenschaften von Bronchialepithelzellen aufgrund ihrer Schleimproduktion¹⁹. Darüber hinaus können sie im ALI kultiviert werden. Obwohl diese Zelllinie einen Mangel am Aufbau von Zell-Zell-Kontakten hat, ist die Kultivierung dieser Zellen viel bequemer, kostengünstiger und daraus abgeleitete Ergebnisse sind im Vergleich zu Primärzellen²⁰spenderunabhängig.

A549-Zellen wurden in 6-Well-Zellkultureinsätzen (PET-Membran, 4,67 cm², Porengröße 0,4 mm) mit einer Dichte von 3,0 x 10⁵ Zellen pro Einsatz gesät und für 24 h unter Getauchtbedingungen kultiviert. Die Zellen wurden dann in drei unabhängigen Laboratorien der sauberen Luft und drei verschiedenen Expositionsdosen (25, 50 und 100 g/cm²) von 20 Prüfsubstanzen am ALI ausgesetzt. Die Expositionsdosis korreliert mit der Abscheidungszeit, was zu einer konstanten Partikelrate von 25 g/cm^2,50 g/cm² und 100 g/cm² auf die Zellen nach 15, 30 bzw. 60 min führt. Die abgelagerten Partikel wurden jedoch nicht nach der Ablagerung abgewaschen, sondern blieben 24 h auf den Zellen. Die Abscheidungszeiten der Partikel betrugen somit 15, 30 und 60 min, aber die Exposition der Zellen dauerte insgesamt 24 h. Die Abscheidungsrate der Prüfsubstanzen wurde in Vorversuchen nach früheren Methoden¹⁷ermittelt.

Die Zelllebensfähigkeit als Indikator für die Toxizität wurde 24 h nach Partikelabscheidung mit einem Zelllebensfähigkeitstest bewertet. Besonderes Augenmerk wurde auf die Qualität der Reinluftsteuerungen, die Optimierung und Verfeinerung des Expositionsprotokolls, die intra- und interlaborale Reproduzierbarkeit und die Etablierung eines Vorhersagemodells (PM) gelegt. Stoffe, die zu einer Abnahme der Zelllebensfähigkeit unter 50% (PM 50%) führten oder 75% (PM 75%) bei einer der drei Expositionsdosen als akute Inhalationsgefahr angesehen. Die Ergebnisse wurden dann mit bestehenden In-vivo-Daten verglichen (basierend auf mindestens einer zuverlässigen Studie nach OECD-Testleitlinie (TG) 403 oder TG 436^21,22), was zu einer Gesamtübereinstimmung von 85 % mit einer Spezifität von 83 % und einer Sensitivität von 88%²³führte.

Neben der Messung der Zelllebensfähigkeit können weitere Endpunkte wie Zytokinfreisetzung, Untersuchung des Zelllysats oder Membranintegrität mittels LDH-Assay bewertet werden, waren aber für die Validierungsstudie nicht erforderlich. So wurde das Expositionssystem (z.B. CULTEX RFS) als prädiktives Screening-System für die qualitative Bewertung der akuten Inhalationstoxizität der getesteten Partikel in der Luft nachgewiesen, was eine vielversprechende alternative Methode zu Tierversuchen darstellt. Das folgende Protokoll wird für Expositionsexperimente mit Partikeln in der Luft empfohlen, die dieses Expositionssystem verwenden.

Protokoll

HINWEIS: Das Protokoll eines Expositionsexperiments erstreckt sich über einen Zeitraum von drei Tagen.

Tag 1

1. Allgemeine Zubereitungen und Zellkultivierung

HINWEIS: Die epitheliale Zelllinie A549 der menschlichen Lunge Adenokarzinom wurde für Expositionsexperimente verwendet. Zellen müssen unter sterilen Bedingungen behandelt werden. Andere Zelllinien, die für die Kultivierung am ALI geeignet sind, können verwendet werden.

1. Bereiten Sie das Wachstumsmedium (Dulbecco es Minimum Essential Medium (DMEM), ergänzt durch 10% fetales Rinderserum (FBS) und 5 g/ml Gentamycin) und das Expositionsmedium (DMEM, ergänzt mit 5 g/ml Gentamycin und einer abschließenden HEPES-Konzentration von 100 mM) vor.
2. Kultur A549 Zellen im Wachstumsmedium bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5%_CO2.
3. Kultivieren Sie Zellen in Zellkulturkolben von 75 cm² (T-75) in 14 ml Wachstumsmedium bis zu einem Zusammenfluss von 80-90% vor der Spaltung (alle 2-3 Tage) und einer Passage von 35.
4. Berechnen Sie das Suspensionsvolumen und die erforderliche Anzahl von Zellkultureinsätzen (drei Zellkultureinsätze als Inkubatorsteuerelemente und Zellkultureinsätze für saubere Luft und Partikelexposition) und Zellkulturplatten.
5. Vor der Trypsinisierung und Aussaat von Zellen, fügen Sie 2,5 ml gehärtetes Wachstumsmedium zu jedem Brunnen einer 6-Well-Platte. Platzieren Sie die Zellkultureinsätze ohne Zellen sorgfältig in den Brunnen und fügen Sie jedem Zellkultureinsatz 1 ml Wachstumsmedium hinzu. Inkubieren Sie die 6-Well-Platten für mindestens 30 min im Inkubator (37 °C, 5% CO₂).

2. Trypsinisierung von Zellen

1. Gehärtete Phosphat-gepufferte Saline (PBS) und Wachstumsmedium bei 37 °C und Trypsin/EDTA (0,05%/ 0.02%) Lösung bei Raumtemperatur.
2. Das Zellkulturmedium aus dem Zellkulturkolben absaugen und die Zellen vorsichtig mit 8 ml vorgeheiztem PBS waschen.
3. Entfernen Sie die PBS, fügen Sie 2 ml Trypsin/EDTA (0,05%/ 0.02%) Lösung der Zellen und inkubieren für maximal 6 min. im Inkubator bei 37 °C. Steuern Sie den Ablösungsprozess unter dem Mikroskop.
4. Neutralisieren Sie die Trypsin-Aktivität, indem Sie 8 ml vorgewärmtes Wachstumsmedium hinzufügen, die Zellen lösen, indem Sie sanft seitlich auf den Kolben tippen und die Zellen durch wiederholtes Pipetieren nach oben und unten wieder aussetzen.
5. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 50 ml-Rohr. Bestimmen Sie die Zellzahl für weitere Verfahren (z. B. Aussaat von Zellen, Zelldurchgang).

3. Bestimmung der Zellnummer

HINWEIS: Die Zellkonzentration wurde mit einem Zellzähler oder Zählkammern bestimmt.

1. Verdünnen Sie 100 l der Zellkultursuspension in einer Tasse, die mit 10 ml isotonischer Lösung gefüllt ist. Kippen Sie den Becher langsam ohne zu schütteln.
2. Bestimmen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen/ml und die Zelllebensfähigkeit basierend auf den zellspezifischen Messparametern von A549-Zellen.

4. Aussaat von Zellen auf mikroporösen Membranen in Zellkultureinsätzen

HINWEIS: Das Belichtungssystem ist mit speziellen Adaptern ausgestattet, um die Verwendung von kommerziellen Einsätzen verschiedener Lieferanten und unterschiedlicher Größe zu ermöglichen. Für diese Expositionsexperimente wurden 6-Well-Platten und die entsprechenden Zellkultureinsätze verwendet. Alle Arbeitsschritte müssen unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.

1. Bieten Sie ein vorgewärmtes Wachstumsmedium unter sterilen Zellkulturbedingungen (laminaren Fluss).
2. Bereiten Sie ein ausreichend hohes Volumen der Zellsuspension mit einer Zellkonzentration von 3,0 x 10⁵ Zellen/ml vor.
3. Nach dem Temperieren der Platten für 30 min, aspirieren Sie das Medium innerhalb der Zellkultur Einsätze und Samen 1 ml A549-Zellen mit einer Dichte von 3,0 x 10⁵ Zellen/ml in jedem Zellkultureinsatz. Verteilen Sie die Zellsuspension durch sanftes Schaukeln.
4. Inkubieren Sie die Zellkultureinsätze mit der Zellsuspension für 24 h (37 °C und 5%_CO2).

5. Pressen von Prüfsubstanzen

HINWEIS: Prüfsubstanzen wurden mit einer vollständig steuerbaren Hydraulikpresse in Pulverkuchen gepresst. Das Presspaket kann eine maximale Kraft von 18 kN anwenden, die als aktueller Öldruck (in bar) des Presspakets angezeigt wird. Pressbedingungen (Pressdruck, Presszeit) unbekannter Prüfsubstanzen müssen in Vorversuchen ermittelt und charakterisiert werden. Je nach Presseigenschaften einer Substanz können unterschiedliche Pressparameter und Presskolbenarten verwendet werden.

VORSICHT: Schutzausrüstung beim Pressen giftiger oder gefährlicher Stoffe tragen.

1. Stellen Sie die Presszeit über die Zeitsteuerung auf der Vorderseite der Presse ein.
2. Öffnen Sie die Druckluftzufuhr am Druckluftventil. Stellen Sie den Druckdruck auf ca. 2 bar (angezeigt durch ein Manometer auf der Vorderseite) über den Druckregler auf der Vorderseite der Presse oder auf das Druckluftventil der Druckluftzufuhr. Ziehen Sie die Schublade heraus, drücken Sie die Taste drücken und lesen Sie den Druck auf den digitalen Druckschalter.
   1. Lesen Sie nur den Druck am Druckregler, wenn der Druck zu hoch oder zu niedrig ist.
3. Montieren Sie den Stoffbehälter und stellen Sie sicher, dass der Glaszylinder richtig zentriert ist (Zusatzabbildung 1). Füllen Sie den Stoffbehälter mit einer kleinen Menge der Prüfsubstanz. Setzen Sie den Kolben in den Stoffbehälter ein und drehen Sie ihn leicht hin und her, um das Pulver gleichmäßig im Behälter zu verteilen.
4. Legen Sie den Stoffbehälter mit dem Kolben in die Schublade und drücken Sie die Taste drücken. Der Hydraulikkolben der Presse bewegt sich auf den Kolben und übt einen Druck auf die Prüfsubstanz für die eingestellte Presszeit aus. Öffnen Sie die Schublade und entfernen Sie den Kolben.
5. Wiederholen Sie die Schritte 5.3 und 5.4, bis der Stoffbehälter mindestens halb voll ist.
6. Nach Abschluss der Pressarbeiten den Stoffbehälter aus der Schublade nehmen und auf den Kopf stellen, um lose und abgelagerte Partikel zu entfernen.
7. Wenn der Stoffbehälter am selben Tag nicht benötigt wird, schließen Sie den Stoffbehälter mit Parafilm, um zu verhindern, dass die Prüfsubstanz austrocknet oder Feuchtigkeit absorbiert.

Tag 2

6. Montage des Belichtungssystems und Anschluss der Peripheriegeräte

ANMERKUNG: Eine ausführlichere Ansicht ist in Abbildung 3, Ergänzende Abbildung 2 und ergänzende Abbildung 3dargestellt. Montieren Sie beide Module und den Aerosolgenerator gemäß den Anweisungen des Herstellers.

1. Stellen Sie das Belichtungssystem auf eine feste und gleichmäßige Oberfläche, wobei die Wasserversorgung nach vorne gerichtet ist. Schließen Sie die Massenstromregler mit dem Aerosolgenerator und einer mit dem Modul verbundenen Dreihalsflasche an, um saubere Luft zu reinigen.
2. Schließen Sie den Durchflussregler und die Vakuumpumpe an. Verbinden Sie die Rohre der Durchflussregler mit dem Rohranschluss an den Anbaugeräten des Aerosolführungsmoduls. Schließen Sie die Rohre auf der anderen Seite der Durchflussregler mit der Vakuumpumpe an. Stellen Sie sicher, dass der Durchfluss vom Modul über die Durchflussregler zur Vakuumpumpe fließt.
3. Schließen Sie das Wasserbad mit der Heizungswasserversorgung an. Die Wasserversorgung erfolgt vom Wasserbad zum Wassereinlass am Aerosolführungsmodul. Schließen Sie den Wasserauslass des Aerosolführungsmoduls mit dem Wassereinlass des Probenahmemoduls an. Schließen Sie den Kreis mit einem Anschluss vom Wasserauslass des Probenahmemoduls zum Wasserbad.
4. Stellen Sie den Aerosolgenerator einschließlich des Elutriators in der Nähe des Belichtungsmoduls und verbinden Sie die überschüssigen Leitungen des Elutriators und das Belichtungs- und Reinluftmodul mit großen Mikrofiltern sowie die Absaugung der Belichtungskammern mit kleinen Mikrofiltern (z. B. Einwegfilter). Der Elutriator dient als Reservoir für die erzeugte Partikelatmosphäre und hält Partikel über ca. 7 m, während kleinere Partikel zum Expositionsmodul transportiert werden.
5. Schließen Sie den Computer, mit dem die Aerosolerzeugung gesteuert wird, über ein USB-Kabel an den USB-Anschluss des Aerosolgenerators und das Netzteil an den Netzteilanschluss an. Schließen Sie den Netzstecker des Netzteils an eine Steckdose (220-240 V) an.
6. Verbinden Sie die Rohre für die mittlere Versorgung und Entfernung mit zwei Pumpen. Anstelle einer Pumpe für die mittlere Versorgung kann das Medium auch manuell befüllt werden.

7. Vorbereitung auf saubere Luft und Partikelexposition

1. Schalten Sie die Vakuumpumpe, die Durchflussregler und das Wasserbad (37 °C) für eine Aufwärmphase von mindestens 30 min ein.
2. Öffnen Sie die Druckluftzufuhr. Stellen Sie die Massenstromregler auf 8 L/min für die Versorgungsleitung zum Aerosolgenerator und auf 3 l/min für die Versorgungsleitung zur dreihalsigen Flasche ein. Schließen Sie die Registerkarten der Massenflussregler.
   HINWEIS: Diese Werte können je nach den Eigenschaften der Prüfsubstanz variieren.
3. Stellen Sie die Durchflussregler über den Computer ein, um den Modulstrom (1,5 l/min) und die Kammerabsaugung (30 ml/min) zu regulieren.

8. Dichtheitsprüfung des Radialdurchflusssystems

HINWEIS: Die Leckageprüfung muss unter Vakuum und für beide Module (Belichtungs- und Reinluftmodul) durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass das Modul ordnungsgemäß wieder montiert wurde.

1. Entfernen Sie den Einlassadapter und den Kondensatreflektor aus dem Aerosolführungsmodul. Schließen Sie die drei Aerosol-Fütterungsbohrungen im Aerosolführungsmodul mit Steckern und die mittleren Versorgungsanschlüsse am Probenahmemodul mit Dummyklappen.
2. Schließen Sie die Vakuumleitungen ohne Filter mit dem Rohranschluss des Aerosolführungsmoduls an. Schließen Sie das Modul mit dem Handrad und messen Sie den Wert der Durchflussregler. Die Werte sollten einige Minuten nach dem Schließen unter 5 ml/min abnehmen.
3. Entfernen Sie nach der Undurchlässigkeitsprüfung alle Stecker und Dummyklappen, legen Sie den Einlassadapter und den Kondensatreflektor in das Aerosolführungsmodul ein und schließen Sie die Rohre für die mittlere Versorgung und Entfernung an.

9. Aerosol-Erzeugung

1. Starten Sie den Computer und die Software (ergänzende Abbildung 4). Starten Sie die Aerosol-Generator-Software, indem Sie auf den Startknopf des Aerosolgenerators auf dem Desktop des Computers doppelklicken. Ein Meldungsfenster wird angezeigt und fragt, ob die Einstellungen zurückgesetzt werden sollen oder nicht. Klicken Sie auf Ja, wenn die Software an diesem Tag zum ersten Mal gestartet wird. Legen Sie die Werte für Slide Position und Scraper Position auf die Standardwerte fest. Klicken Sie auf Nein, um die Werte für Folienposition und Schaberposition beizubehalten, oder die Folie befindet sich nicht in der Startposition.
2. Schrauben Sie einen Substanzschaber in das Rohr, der sich in der zentralen Öffnung des Aerosolgenerators oben befindet.
   HINWEIS: Je nach Presseigenschaften können unterschiedliche Arten von Stoffschaber verwendet werden.
3. Verwenden Sie den Homing-Modus, wenn sich der Substanzschaber nicht in der niedrigsten Position befindet.
4. Stellen Sie den Stoffbehälter mit dem gepressten Prüfmaterial kopfüber über den Substanzschaber. Stellen Sie sicher, dass das Glas des Stoffbehälters nach vorne zeigt. Stellen Sie sicher, dass die beiden Löcher im Stoffbehälter auf die beiden Stifte des Aerosolgenerators oben passen. Legen Sie die Verriegelungsplatte in den Schlitz über dem Stoffbehälter und ziehen Sie die schwarze Schraube fest.
5. Ändern Sie die Werte für Feed (0,24 bis 20 mm/h) und Rotation (1 bis 800 U/h) auf die gewünschten Einstellungen. Die Partikelkonzentration kann durch Erhöhung oder Abnahme des Vorschubwertes oder des Trägergasdurchflusses verändert werden.
6. Verwenden Sie die Abwärtspfeile, um den Schlitten mit dem Stoffbehälter nach unten zu drücken, bis sich der Substanzschaber in der Nähe der gepressten Substanz befindet.
7. Öffnen Sie die Druckluftzufuhr zum Aerosolgenerator mit einem Hahn des Massenstromreglers und starten Sie die Aerosol-Generierung, indem Sie auf die Starttaste klicken. Stellen Sie die Vorschubrate auf 15-20 mm/h ein, um lange Wartezeiten zu vermeiden.
8. Steuern Sie die richtige Partikelerzeugung, indem Sie die Feinstaubwolke mit einer kleinen Taschenlampe beobachten (von unten hinter dem Glasrohr des Elutriators positioniert). Ändern Sie den Wert für Feed zurück zu den gewünschten Einstellungen, wenn der erste Aerosoldampf kontinuierlich den Elutriator erreicht, und klicken Sie auf die Stopp-Taste.

10. Expositionsexperimente

1. Starten Sie die mittlere Versorgung mit vorgewärmten Belichtungsmedium und füllen Sie die Probenahmemodule, bis die Fallrohre abgedeckt sind, während das Modul geöffnet ist. Verwenden Sie die mittlere Pumpe oder füllen Sie das Medium manuell (25 ml pro Einzelbelichtungskammer).
2. Fügen Sie Blindzellkultureinsätze (Inserts ohne Zellen) in das Belichtungsmodul ein. Pumpen Sie das Belichtungsmedium nach unten, bis die Fallrohre mit Medium bedeckt sind und die Unterseite der Einsätze mit Medium in Kontakt sind.
3. Starten Sie den Aerosolgenerator, schließen Sie das Belichtungsmodul und schließen Sie das Belichtungsmodul an den Belichtungsmodulausgang des Aerosolgenerators. Geben Sie dem Aerosolgenerator eine Vorlaufzeit von mindestens 20-30 min, bevor Belichtungen gestartet werden, um eine stabile Partikelerzeugung zu ermöglichen.
4. Bereiten Sie die Post-Inkubationsplatten für die Inkubator-Steuerelemente und die exponierten Zellkultureinsätze während der Vorlaufzeit vor. 1,5 ml Wachstumsmedium pro Brunnen hinzufügen und die Platten im Inkubator inkubieren (37 °C, 5%_CO2).
5. Nach der Vorlaufzeit den Belichtungsmodulauslass des Elutriators mit einem Gummistecker versiegeln und die Blindeinsätze entfernen. Füllen Sie das Belichtungsmedium (mit der Pumpe oder manuell) auf, bis die Fallrohre mit Medium abgedeckt sind. Öffnen Sie nun auch die Druckluftzufuhr zum Reinluftmodul mit dem Hahn des Massenstromreglers (3 L/min)
6. Entfernen Sie die Zellkultureinsätze mit Hilfe einer Pinzette von den 6-Well-Platten. Gießen Sie das Wachstumsmedium vorsichtig aus der Zellkultur setzt durch Umstürzen der Einsätze und Aspirieren und entsorgen Sie die Restflüssigkeit mit einer Pipette. Legen Sie die Einsätze in die Belichtungskammern beider Module, das Belichtungs- und Reinluftmodul.
7. Schließen Sie die Module und starten Sie die Belichtungsexperimente, indem Sie das Belichtungsmodul gleichzeitig an den Expositionsmodulausgang des Aerosolgenerators und das Reinluftmodul an die Trägergasversorgung anschließen.
   HINWEIS:Die Partikelkonzentration kann durch Erhöhung/Verringerung des Vorschubwertes, des Trägergasdurchflusses oder des Zeitpunkts der Exposition geändert werden.
8. Trennen Sie die Belichtungs- und Reinluftmodule nach Abschluss des Experiments und versiegeln Sie den Auslass des Belichtungsmoduls.
9. Stoppen Sie die Druckluftzufuhr und den Aerosolgenerator, indem Sie auf die Stopp-Taste klicken.
10. Öffnen Sie das Belichtungs- und Reinluftmodul und übertragen Sie die Zellkultureinsätze mit einer Pinzette auf die vorbereiteten Post-Inkubationsplatten. Inkubieren Sie die 6-Well-Platten für 24 h (37 °C, 5% CO₂) am ALI.
    HINWEIS: Wiederholen Sie die Schritte 10.5 -10.10, wenn weitere Expositionsexperimente geplant sind.
11. Heben Sie die Zellkultureinsätze an, die als Inkubatorsteuerungen für die ALI verwendet werden, unter den gleichen Bedingungen wie die exponierten Zellkultureinsätze und inkubieren Sie sie für 24 h (37 °C, 5%_CO2) am ALI.
12. Verwenden Sie die Schaltfläche Homing-Modus, um den Stoffbehälter zu entfernen. Schließen Sie die Aerosolgenerator-Software, indem Sie auf das X in der oberen rechten Ecke klicken und den Computer ausschalten.
13. Reinigen Sie nach Abschluss aller Expositionsexperimente den Aerosolgenerator und beide Belichtungsmodule. Schließen Sie den Stoffbehälter mit Parafilm, wenn die Prüfsubstanz in den nächsten Tagen weiter verwendet wird.

Tag 3

11. Zelllebensfähigkeit

HINWEIS: Die Zelllebensfähigkeit wurde 24 h nach Partikelabscheidung ermittelt, indem die mitochondriale Aktivität mit dem WST-1-Test gemessen wurde. Der Test wurde nach dem Herstellerprotokoll durchgeführt. Die Zelllebensfähigkeit kann auch durch andere Zelllebensfähigkeitstests (z. B. XTT) bestimmt werden.

1. Temperaturwachstumsmedium bei 37 °C und Tauauf der Lichtschutzlösung WST-1. Bereiten Sie eine angemessene Anzahl neuer 6-Well-Platten mit 2,5 ml Wachstumsmedium pro Brunnen vor und inkubieren Sie die Platten im Inkubator.
2. Bereiten Sie die WST-1-Verdünnung vor, indem Sie eine ausreichende Menge an WST-1 1:7 im Wachstumsmedium verdünnen
3. Fügen Sie die Zellkultureinsätze 24 h nach Belichtung in die neu vorbereiteten 6-Well-Platten ein. Fügen Sie 1 ml der frisch zubereiteten WST-1-Lösung zu jedem Zellkultureinsatz hinzu. Die Platten sorgfältig schaukeln, um die Lösung homogen auf die Zellen zu verteilen. Inkubieren Sie die 6-Well-Platten mit den Zellkultureinsätzen für 1 h (37 °C, 5% CO₂).
4. Übertragen Sie 100 l des Überstandes in Triplicaten von jedem 6-Well auf eine 96-Well-Platte. Messen Sie die Absorption bei 450 nm mit einer Referenzwellenlänge von 650 nm mit einem Mikroplattenleser.

12. Statistik

1. Normalisieren Sie die Zelllebensfähigkeit der einzelnen Inkubatorkontrollen auf 100%.
2. Geben Sie die Lebensfähigkeit der exponierten Zellen in Bezug auf die einzelnen Inkubatorkontrollen an. Die Zytotoxizität von Prüfsubstanzen wurde mit den jeweiligen Inkubatorkontrollen verglichen und als Indikator für die Toxizität verwendet.

Ergebnisse

Das CULTEX RFS ist ein speziell entwickeltes modulares In-vitro-Expositionssystem, das die direkte und homogene Exposition von Zellen am ALI ermöglicht. In einer früheren Vorvalidierungsstudie wurden die allgemeine Anwendbarkeit dieses Expositionssystems und seine Übertragbarkeit, Stabilität und Reproduzierbarkeit erfolgreich nachgewiesen. In einem kürzlich vom Bundesministerium für Bildung und Forschung geförderten Forschungsprojekt wurde das Expositionssystem erfolgreich validier...

Diskussion

Viele nicht-tierische Inhalationstoxizitätstestmodelle wurden in den letzten Jahren entwickelt, um Informationen über die akute Inhalationsgefahr von inhalierbaren Partikeln zu gewinnen und Tierversuche nach dem 3R-Prinzip²⁵zu reduzieren und zu ersetzen.

In Bezug auf Zellkulturmodelle kann die Exposition von Zellen unter getauchten Bedingungen oder am ALI erfolgen. Die Exposition von Zellen unter getauchten Bedingungen kann die physikalisch-chemischen Eigenschaften un...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells
A549	ATCC	CCL-185
Cell culture medium and supplies
DMEM	Biochrom, Berlin, Germany	FG 0415	used as growth medium
DMEM	Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany	22320	used as exposure medium
FBS superior	Biochrom, Berlin, Germany	S 0615
Gentamycin (10mg/mL)	Biochrom, Berlin, Germany	A 2710
HEPES 1M	Th. Geyer, Renningen, Germany	L 0180
PBS	Biochrom, Berlin, Germany	L 1825
Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%)	Biochrom, Berlin, Germany	L 2143
Cell culture material
CASY Cups	Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany	REF 05651794
Cell culture plates	Corning, Wiesbaden, Germany	3516	6­-well plates
Corning Transwell cell culture inserts	Corning, Wiesbaden, Germany	3450	24mm inserts; 6-­well plates; 0.4 µm
Chemicals
CASYton	Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany	REF 05651808001
Compressed Air (DIN EN 12021)	Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschleißheim, Germany	2290152
WST-1	Abcam, Cambridge, United Kingdom	ab155902
Instruments + equipment
CASY Cell Counter	Schärfe System GmbH, Reutlingen, Germany
Circulation thermostat	LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany	Ecoline RE 100
CULTEX HyP - Hydraulic Press	Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX insert sleeve	Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for particle exposure)	Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for clean air exposure)	Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX supply
Flow controller 0-30 ml/min (IQ-Flow)	Bronkhorst Deutschland Nord GmbH
Flow controller 0-1,5 l/min (EL-Flow)	Bronkhorst Deutschland Nord GmbH
Filters (large)	Munktell & Filtrak GmbH, Sachsen, Germany	LP-050	Munktell Sterile Filter; Particle retention efficiency > 99,999%
Filters (small)	Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany	9933-05-DQ	Balston disposable filter
Medium pump	Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany	Ismatec IPC High Precision Multichannel Dispenser	digital peristaltic pump
Microplate Reader Infinite M200 Pro	Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany
Vakuum pump	KNF, Freiburg, Germany	N86 KT.18
Vögtlin mass flow controller 0,2-10 l/min	TrigasFI GmbH	Vögtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20
Water Bath	LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany	Ecoline Staredition RE 104