Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מציגים חזקה, להעברה וניבוי מערכת חשיפה מחוץ למערכת להקרנה וניטור של חלקיקים מוטס בנוגע לרעילות חריפה של הריאות שלהם על ידי חשיפת מעובד בתאי הריאה האנושיים בממשק האוויר-נוזלי (ALI).

Abstract

כאן, אנו מציגים מודולרי מעוצב במיוחד במערכת חשיפה מחוץ לגוף המאפשרת חשיפה הומוגנית של תאי הריאה האנושיים מעובדים על ALI לגזים, חלקיקים או אטמוספרות מורכבות (למשל, עשן סיגריות), ובכך לספק פיסיולוגיים מציאותיים חשיפת המשטח האפיפיורי של האזור האנושי הכתשיים לאוויר. בניגוד מודלים חשיפה רציפים עם הדרכה תרסיס ליניארי, העיצוב המודולרי של מערכת הזרימה הרדיאלי עונה על כל הדרישות של הדור המתמשך והובלה של אווירת הבדיקה לתאים, התפלגות הומוגנית והפקדת את החלקיקים ואת ההסרה הרציפה של האטמוספירה. שיטת חשיפה זו מיועדת בעיקר לחשיפת תאים לחלקיקים מוטס, אך ניתן להתאים לחשיפה של אירוסולים נוזליים וגזים רעילים ואגרסיביים מאוד בהתאם לשיטת הדור התרסיס ולחומר של מודולי החשיפה .

במסגרת מחקר אימות שהושלם לאחרונה, מערכת חשיפה זו הוכחה כשיטת הקרנה להעברה, מוכחות וחזוי להערכת האיכות של רעילות הריאות חריפה של חלקיקים מוטס, ובכך שעלולים להפחית או להחליף ניסויים בבעלי חיים שבדרך כלל יספקו את ההערכה הטוקסיולוגית הזאת.

Introduction

האינהלציה של חלקיקים רעילים מוטס היא דאגה לבריאות הציבור, המובילה להמון סיכונים בריאותיים ברחבי העולם ומיליוני מקרי מוות מדי שנה1,2. שינוי האקלים, הפיתוח התעשייתי המתמשך והביקוש העולה לאנרגיה, מוצרי חקלאות וצרכן תרמו לגידול מחלות הריאות בשנים האחרונות3,4,5,6. ידע והערכה של חומרים הניתנים לאינהלציה בנוגע לרעילות האינהלציה החריפה שלהם, מספקים את הבסיס להערכת סיכונים ולניהול סיכוני, אך מידע זה עדיין חסר במגוון רחב של חומרים אלה7,8. מאז 2006, החקיקה הכימית של האיחוד האירופי (רישום, הערכה, מתן הרשאות והגבלת כימיקלים) דורשת שמוצרים קיימים וחדשים שכבר עוברים אפיון של הרעילות, כולל תוואי האינהלציה לפני ההנחה בשוק. לכן, הגעה מתמקדת בשיטות חלופיות וחופשיות לבעלי חיים, יישום העיקרון "3R" (החלפה, עידון והפחתה של ניסויים בבעלי חיים) והשימוש המתאים במודלים של חוץ גופית9. בשנים האחרונות, שונים והולמים שאינם בעלי חיים הרעלה רעילות מודלים (g., בתרביות תאים מחוץ למים, מודלים של ריאה על שבב, מדויק לגזור פרוסות ריאה (pcls)) פותחו על מנת להעריך את רעילות האינהלציה חריפה של חלקיקים מוטס5,7,10,11. במונחים של מודלים של תרבות תא מבחנה, תאים מעובדים ניתן לחשוף בתנאים מתחת לאור או ב-ALI (איור 1). עם זאת, את תוקפו של מחקרים חשיפה שקוע מוגבלת ביחס להערכת רעילות של תרכובות מוטס חלקיקים בעיקר. טכניקות חשיפה מתחת לגוף אינן מתאימות לאדם במצב vivo; המדיום של תרבות התא המכסה את התאים עלול להשפיע על המאפיינים פיזיקאלית-כימיים ולכן, את התכונות הרעילות של חומר מבחן12,13. עלי במודלים של שאיפת חוץ גופית מאפשרים חשיפה ישירה של תאים לחומרים בדיקה ללא הפרעה של מדיום התרבות התא עם חלקיקי מבחן, ובכך, מחקה את החשיפה האנושית עם דמיון פיזיולוגי וביולוגי גבוה יותר מאשר כיווני אויר12,14.

לתהליכים הרגולטורים כגון הגעה, לעומת זאת, רק דגמי בעלי חיים זמינים בתחום הרעלים החריפים, משום שאין אלטרנטיבה בשיטות החוץ-גופית שאושרו מספיק והתקבלו באופן רשמי עד כה14. לשם כך, יש לאמת את המודלים הבסיסיים בהתאם לדרישות המעבדה להתייחסות לאיחוד האירופי לחלופות לבדיקות בעלי חיים (EURL-ECVAM) על חוקיות הבדיקה15.

מחקר טרום-אימות לשעבר ומחקר אימות שהושלם לאחרונה הפגינו בהצלחה את אזור היישום של מערכת החשיפה CULTEX RFS ואת ההעברה, היציבות והיכולת להיות בלתי מנוצח13. מערכת חשיפה זו היא מערכת חשיפה מבוססת תא מחוץ למערכת המאפשרת חשיפה הומוגנית של תאים לגזים, חלקיקים או אטמוספרות מורכבות (למשל, עשן סיגריות) בבית עלי בשל קונספט הפצת התרסיס הרדיאלי שלה וההולכה של תרסיס הבדיקה בזרימה רציפה על התאים16. המודול הבסיסי של מערכת הזרימה הרדיאלי הזאת מורכב ממתאם האוויר, המודול המנחה את התרסיס עם התפלגות התרסיס הרדיאלי, מודול הדגימה והשקע, ומודול נעילה עם גלגל יד (איור 2). החלקיקים שנוצר להגיע לתאים באמצעות מתאם מפרץ ומודול המנחה תרסיס ומופקד על מוסיף תרבות התא, אשר ממוקמים בשלושה מסודרים רדיוally חדרי החשיפה של מודול הדגימה. המודול המנחה תרסיס, כמו גם מודול הדגימה יכול להיות מחומם על ידי התחברות לאמבטיה מים חיצוניים17.

במסגרת שני המחקרים, השתמשו בתאי A549 לכל ניסויי החשיפה. קו התא A549 הוא קו האפיתל מונצח האנושי כי הוא מאופיין היטב, שימש מודל בלתי מתורבת עבור סוג II מכתשיים האפיתל במחקרים רבים לאחר הרעילות. התאים מאופיינים בגופים מלוניים, הפקת חומרים מקצועיים ומספר גורמים הרלוונטיים לדלקת,18. הם גם מראים מאפיינים של תאים אפיתל ברונכיט בשל ייצור ריר שלהם19. יתר על כן, הם יכולים להיות מתורבתים ב-ALI. למרות שהקו הנייד הזה חסר בבניית קשרים סלולריים, הטיפוח של תאים אלה הוא הרבה יותר נוח, פחות עלות יקרה ותוצאות שנגזרות מהם אינן תלויות ביחס לתאים הראשוניים20.

A549 תאים שופרה בשנת 6-היטב התרבות תאים מוסיף (קרום PET, 4.67 ס מ2, הנקבוביות גודל 0.4 מ"מ) עם צפיפות של 3.0 x 105 תאים לכל הוספה ומעובד עבור 24 h תחת תנאים שקועים. תאים נחשפו לאחר מכן בשלוש מעבדות עצמאיות כדי לנקות אוויר ושלוש מינונים חשיפה שונים (25, 50, ו 100 μg/cm2) של 20 חומרי בדיקה ב-ALI. מינון החשיפה מתואם את זמן התצהיר וכתוצאה מכך שיעור חלקיקים קבוע של 25 μg/ס"מ2, 50 μg/cm2 ו 100 μg/cm2 על התאים לאחר 15, 30 או 60 min, בהתאמה. החלקיקים שהופקדו, לעומת זאת, לא נשטפו לאחר התצהיר, אך נשארו על התאים במשך 24 שעות. זמני התצהיר של החלקיקים היו אפוא 15, 30 ו 60 דקות, אבל החשיפה של התאים נמשך 24 h בסך הכל. שיעור התצהיר של חומרי הניסוי נקבע בניסויים ראשוניים על פי שיטות קודמות17.

באמצעות הכדאיות של התאים כאינדיקציה לרעילות הוערך 24 שעות לאחר תצהיר החלקיקים באמצעות שיטת הכדאיות של התא. מיקוד מיוחד הוגדר על איכות של בקרות אוויר נקי, אופטימיזציה ועידון של פרוטוקול החשיפה, מחדש הפנים והבין מעבדה ה, הקמת מודל חיזוי (PM). חומרים שהובילו לירידה של הכדאיות התאית מתחת 50% (PM 50%) או 75% (PM 75%) בכל אחת משלוש מנות החשיפה נחשבו לפגעי שאיפת חריפה. התוצאות הושוו לקיים בנתונים vivo (מבוסס על לפחות מחקר אמין אחד על פי מבחן ה-OECD מנחה (tg) 403 או tg 43621,22), המוביל לקונקורדנציה כוללת של 85%, עם ספציפיות של 83% ורגישות של 88%23.

מלבד המדידה של הכדאיות התא, נקודות קצה אחרות כגון שחרור ציטוקינים, בדיקת שלמות התא או ממברנה באמצעות שיטת ldh ניתן להעריך אך לא נדרשו עבור מחקר אימות. לפיכך, מערכת החשיפה (למשל, CULTEX RFS) הוכחה כמערכת סינון חזוי להערכה האיכותית של רעילות האינהלציה החריפה של החלקיקים המוטסים שנבדקו, המייצגים שיטה חלופית מבטיחה לניסויים בבעלי חיים. הפרוטוקול הבא מומלץ לניסויים בחשיפה לחלקיקים מוטס באמצעות מערכת חשיפה זו.

Protocol

הערה: הפרוטוקול של ניסוי חשיפה אחד מכסה תקופה של שלושה ימים.

היום הראשון

1. ההכנות הכלליות וטיפוח התאים

הערה: הריאה האנושית אדנוקרצינומה קו אפיתל התאים A549 שימש לניסויים חשיפה. יש לטפל בתאים תחת תנאים סטריליים. ניתן להשתמש בקווי תאים אחרים המתאימים לטיפוח-תרגול ב-ALI.

  1. להכין את הצמיחה בינונית (בינונית מינימלית של מינימום של החברה (DMEM), שיושלם עם 10% סרום של שור עוברי (FBS) ו 5 μg/mL בינוני) ואת בינונית חשיפה (DMEM בתוספת עם 5 μg/mL הריכוז הסופי של HEPES 100 mM).
  2. התרבות A549 תאים בינונית צמיחה ב 37 ° c באווירה מחולל לחות המכיל 5% CO2.
  3. לטפח תאים בבקבוקון תרבות התא של 75 ס מ2 (T-75) ב 14 מ ל של בינוני גדילה עד המפגש של 80-90% לפני פיצול (כל יום 2-3) ומעבר של 35.
  4. לחשב את עוצמת ההשעיה ואת המספר הנדרש של הוספת התרבות תאים (שלוש תרבות התא מוסיף כמו בקרות החממה ומוסיף תרבות התא לחשיפה אוויר נקי החלקיקים) ולוחות תרבות התא.
  5. לפני טריסיזציה וזריעה של תאים, להוסיף 2.5 mL של בינונית צמיחה מחוסמת כל טוב של צלחת 6-היטב. מניחים את התרבות תאים מוסיף ללא תאים בזהירות בתוך הבארות ולהוסיף 1 mL בינונית צמיחה לכל הוספת תרבות התא. מודטה את 6-הצלחות לפחות 30 דקות בחממה (37 ° c, 5% CO2).

2. טריסיזציה של תאים

  1. (PBS) ואמצעי גדילה ב37 ° c וטריפסין/EDTA (0.05%) 0.02%) פתרון בטמפרטורת החדר.
  2. מטפי את המדיום תרבות התא מתוך הבקבוקון תרבות התא ולשטוף את התאים בזהירות עם 8 מ ל של PBS מחומם מראש.
  3. הסירי את ה-PBS, הוסף 2 מ ל של טריפסין/EDTA (0.05% 0.02%) הפתרון לתאים ולדגירה של 6 דקות מקסימלית בחממה ב 37 ° c. שלוט בתהליך הניתוק מתחת למיקרוסקופ.
  4. לנטרל את הטריפסין הפעילות על ידי הוספת 8 מ ל בינונית צמיחה מחומם מראש, לנתק את התאים על ידי הקשה בעדינות הצידה על הבקבוקון ולהשעות מחדש את התאים על ידי ליטוף חוזר למעלה ולמטה.
  5. העבר את ההשעיה התא לצינור 50 mL. קבע את מספר הטלפון לפרוצדורה נוספת (לדוגמה, זריעת תאים, מעבר תאים).

3. קביעת מספר התאים

הערה: ריכוז התאים נקבע באמצעות מונה תאים או תאי ספירה.

  1. לדלל 100 μL של תרבות התא השעיה בספל מלא 10 מ ל של פתרון isotonic. להטות את הספל לאט בלי לרעוד.
  2. קבע את מספר התאים הפעילים/mL ואת הכדאיות של התא בהתבסס על פרמטרי המדידה הספציפיים לתא של תאים A549.

4. זריעת תאים על מיקרופור ממברנות בתרבית תאים

הערה: מערכת החשיפה מצוידת במתאמים מיוחדים כדי לאפשר שימוש בתוספות מסחריות מספקים שונים ובגדלים שונים. עבור ניסויים אלה חשיפה, הצלחות 6-היטב ואת מוסיף תרבות התא המקביל שימשו. כל שלבי העבודה צריכים. להיעשות בתנאים סטריליים

  1. מספקים מדיום גידול מחומם מראש תחת תנאים של תרבות התא הסטרילי (זרימה שכבתית).
  2. הכן נפח גבוה מספיק של הבולם התא עם ריכוז תא של 3.0 x 105 תאים/mL.
  3. לאחר הרפיה לוחות עבור 30 דקות, מתנפות את המדיום בתוך מוסיף תרבות התא וזרע 1 מ ל של תאים A549 עם צפיפות של 3.0x 10 תאים /mL בכל הוספת תרבות התא. לפזר את ההשעיה התא על ידי הנדנדה עדין.
  4. מכשיר התרבות התא מוסיף עם ההשעיה התא עבור 24 h (37 ° צ' ו 5% CO2).

5. הקשה על חומרי בדיקה

הערה: חומרי בדיקה היו לחוצים לתוך עוגות אבקה באמצעות מכבש הידראולי בשליטה מלאה. חבילת העיתונות יכולה להחיל כוח מרבי של 18 kN, אשר מוצג כלחץ הנפט הנוכחי (בבר) של חבילת העיתונות. מצבי לחץ (לחץ לחיצה, זמן לחיצה) של חומרי בדיקה לא ידועים צריכים להיות מבוססים ומאופיינים במבחנים ראשוניים. בהתאם למאפייני העיתונות של חומר, ניתן להשתמש בפרמטרים דחופים שונים ובסוגים של בוכנה לחיצה.

התראה: לבשו ציוד הגנה בעת הקשה על חומרים רעילים או מסוכנים.

  1. הגדר את זמן ההקשה באמצעות בקרת הזמן בצד הקדמי של העיתונות.
  2. פתח את אספקת האוויר הדחוסה. בשסתום האווירי הדחוס הגדר את לחץ האוויר הדחוס כ 2 בר (המצוין על ידי מד לחץ בצד הקדמי) באמצעות וסת הלחץ בצד הקדמי של העיתונות או על שסתום האוויר הדחוס של אספקת האוויר הדחוס. להוציא את המגירה, לחץ על לחצן העיתונות ולקרוא את הלחץ לחיצה על מתג הלחץ הדיגיטלי.
    1. לקרוא רק את הלחץ על וסת הלחץ אם הלחץ גבוה מדי או נמוך מדי.
  3. הרכבה של מיכל החומר וודא שצילינדר הזכוכית ממורכז כראוי (איור משלים 1). מלא את מיכל החומר עם כמות קטנה של חומר הבדיקה. הכנס את הבוכנה לתוך מיכל החומר והפוך אותו מעט אחורה ואחורה כדי לפזר את האבקה במיכל באופן שווה.
  4. מקם את מיכל החומר עם הבוכנה במגירה ולחץ על כפתור העיתונות . בוכנה הידראולית של העיתונות נעה על הבוכנה ומפעילה לחץ על החומר מבחן עבור הזמן לחיצה על הסט. פתח את המגירה והסר את הבוכנה.
  5. חזור על שלבים 5.3 ו-5.4 עד שמיכל החומר הוא לפחות חצי מלא.
  6. לאחר השלמת העבודה הדחופה, הסר את מיכל החומר מהמגירה והפוך אותו למטה כדי להסיר חלקיקים רופפים ומופקד.
  7. אם אין צורך במיכל החומר באותו היום, סגרו את מיכל החומר באמצעות parafilm כדי למנוע מחומר הבחינה להתייבש או סופג לחות.

היום השני

6. הרכבת מערכת החשיפה וחיבור הציוד ההיקפי

הערה: השקפה מפורטת יותר מסופקת באיור 3, באיור המשלים 2 ובאיור 3. הכנס את שני המודולים ואת גנרטור התרסיס לפי הוראות היצרן.

  1. מניחים את מערכת החשיפה על משטח אחיד ואף מוצק, כאשר אספקת המים פונה קדימה. חברו את בקרי הזרימה ההמונית עם גנרטור התרסיס ובקבוק שלוש-העורף המחובר למודול לחשיפה לאוויר נקי.
  2. חבר את בקר הזרימה ואת משאבת הוואקום. לחבר את הצינורות מתוך בקרי הזרימה עם מחבר הצינור על קבצים מצורפים של המודול המנחה תרסיס. לחבר את הצינורות בצד השני של בקרי הזרימה עם משאבת ואקום. ודא כי הזרימה הולכת מתוך המודול דרך בקרי הזרימה למשאבת ואקום.
  3. חברו את אמבטיית המים עם אספקת מי החימום. אספקת המים מגיע ממרחץ המים אל מפרץ המים על המודול המנחה את התרסיס. לחבר את משקע המים של המודול המנחה תרסיס עם כניסת המים של מודול הדגימה. סגרו את המעגל עם חיבור משקע המים של מודול הדגימה לאמבט המים.
  4. מניחים את הגנרטור תרסיס כולל האלוטריאטור קרוב מודול החשיפה ולחבר את הקווים העודפים של המוטריאטור ואת החשיפה מודול אוויר נקי עם מיקרו מסננים גדולים, ואת היניקה של תאי החשיפה עם מיקרו מסננים קטנים (g., מסננים חד פעמיים). המיטריאטור משמש כמאגר לאווירת החלקיקים הנוצרת ומחזיקה בחלקיקים גדולים מ-7 μm, בעוד שחלקיקים קטנים יותר מועברים למודול החשיפה.
  5. חבר את המחשב המשמש לשליטה בדור התרסיס ליציאת ה-USB של מחולל התרסיס באמצעות כבל USB ואספקת החשמל ליציאת ספק הכוח. חבר את תקע זרם החילופין של יחידת אספקת החשמל לשקע (220-240 V).
  6. חבר את הצינורות לאספקה בינונית ולהסרה עם שני משאבות. במקום להשתמש במשאבה לאספקת המדיום, ניתן גם למלא את המדיום באופן ידני.

7. הכנה לאוויר נקי וחשיפה לחלקיקים

  1. הפעל את משאבת הוואקום, בקרי הזרימה ומרחץ המים (37 ° c) לתקופה חמה של לפחות 30 דקות.
  2. . פתח את אספקת האוויר הדחוסה הגדר את בקרי הזרימה ההמונית ל-8 L/min עבור קו האספקה למחולל התרסיס ו-3 ל/דקות עבור קו האספקה לבקבוק בעל שלושת העורף. סגור את הכרטיסיות של בקרי זרימת המונים.
    הערה: ערכים אלה עשויים להשתנות בהתאם למאפיינים של חומר הבדיקה.
  3. כוונן את בקרי הזרימה דרך המחשב כדי לווסת את זרימת המודול (1.5 L/min) ואת היניקה הקאמרית (30 מ ל/דקות).

8. מבחן דליפה של מערכת הזרימה הרדיאלי

הערה: בדיקת הדליפה חייבת להתבצע תחת ואקום ועבור שני המודולים (חשיפה ומודול אוויר נקי) כדי להבטיח שהמודול הוכנס כראוי.

  1. הסר את מתאם ה-מפרץ ואת מאור האור העיבוי ממודול המנחה תרסיס. סגור את שלושת האכלה תרסיס משעממת במודול המנחה תרסיס עם תקעים וחיבורים אספקה בינונית במודול דגימה עם מדפים דמה.
  2. חבר את קווי ואקום ללא מסנן עם מחבר צינור של המודול המנחה תרסיס. סגרו את המודול בעזרת גלגל היד ומדדו את הערך של בקרי הזרימה. הערכים אמורים להצטמצם כמה דקות לאחר הסגירה מתחת ל-5 mL/min.
  3. לאחר בדיקת היכולת האטום, להסיר את כל התקעים ומדפים דמה, להכניס את מתאם המים ואת האור מחזיר לתוך המודול המנחה תרסיס ולחבר את הצינורות עבור אספקה בינונית והסרה.

9. תרסיס הדור

  1. הפעל את המחשב ואת התוכנה (איור משלים 4). הפעל את מחולל תרסיס תוכנה על ידי לחיצה כפולה על כפתור תרסיס להתחיל מחולל בשולחן העבודה של המחשב. מופיע חלון הודעה ושואל אם יש לאפס את ההגדרות או לא. לחץ על כן אם התוכנה מתחילה בפעם הראשונה באותו יום. הגדר את הערכים עבור מיקום שקופית ומיקום מגרד לערכי ברירת המחדל. לחץ על לא כדי לשמור את הערכים עבור מיקום שקופית ומיקום מגרד או שהשקופית אינה נמצאת במיקום ההתחלה.
  2. לעזאזל מגרד חומר לתוך הצינור, אשר ממוקם בפתח המרכזי של הגנרטור תרסיס מחולל.
    הערה: בהתאם למאפייני העיתונות, ניתן להשתמש בסוגים שונים של מגרד חומר.
  3. השתמש לחצן מצב הביות אם המגרד החומר אינו במצב הנמוך ביותר.
  4. מניחים את מיכל החומר עם החומר מבחן לחצה הפוך על מגרד החומר. ודא שהזכוכית של מיכל החומר פונה לחזית. ודא ששני החורים במיכל החומר מתאימים לשני הפינים של מחולל התרסיס. הניחו את לוחית הנעילה בחריץ שמעל מיכל החומר והדקו את הבורג השחור.
  5. שנה את הערכים עבור הזנה (0.24 עד 20 מ"מ/h) וסיבוב (1 עד 800 revs/h) להגדרות הרצויות. ריכוז החלקיקים ניתן לשינוי על-ידי הגדלה או הקטנה של ערך ההזנה או קצב זרימת הגז של המנשא.
  6. השתמש בחיצים כלפי מטה כדי לדחוף את השקופית עם מיכל החומר עד המגרד החומר ליד החומר הלחוץ.
  7. פתח את אספקת האוויר הדחוס כדי גנרטור תרסיס עם ברז של בקר הזרם ההמוני ולהתחיל את הדור תרסיס על ידי לחיצה על כפתור התחל . הגדר את קצב ההזנה ל-15-20 מ"מ/h כדי להימנע משעות המתנה ארוכות.
  8. שלוט בדור החלקיקים הנכון על ידי התבוננות בענן האבק המשובח עם פנס קטן (ממוקם מתחת לצינור הזכוכית של המיטריאטור). לשנות את הערך עבור הזנה בחזרה להגדרות הרצויות כאשר אדי התרסיס הראשון מגיע ברציפות האלוטריאטור ולחץ על לחצן עצור .

10. ניסויים בחשיפה

  1. הפעל את האספקה הבינונית עם אמצעי חשיפה מחומם מראש ומלא את מודולי הדגימה עד שהצינורות מכוסים כאשר המודול פתוח. השתמש במשאבה הבינונית או מלא את המדיום באופן ידני (25 מ"ל לכל חדר חשיפה ליחיד).
  2. הוסף שיבוצי תרבות תא עיוור (מוסיף ללא תאים) לתוך מודול החשיפה. לשאוב את החשיפה בינונית למטה עד שהמנורות מכוסות במדיום והצד התחתון של התוספות במגע עם המדיום.
  3. הפעל את גנרטור תרסיס, לסגור את מודול החשיפה ולחבר את מודול החשיפה לשקע מודול חשיפה של גנרטור תרסיס. תן את גנרטור תרסיס זמן חפיפה של לפחות 20-30 דקות לפני הפעלת חשיפות על מנת לאפשר דור יציב של חלקיקים.
  4. הכינו את הלוחות שלאחר הדגירה של בקרת החממה ואת מוסיף התרבות הסלולרית החשופה בזמן החפיפה. הוסף 1.5 mL של בינוני גדילה לכל טוב ומודאת לוחיות בחממה (37 ° c, 5% CO2).
  5. לאחר הזמן החפיפה, לאטום את מודול החשיפה לשקע של האלוטריאטור עם תקע גומי ולהסיר את התוספות העיוורות. למלא את החשיפה בינונית (באמצעות המשאבה או באופן ידני) עד downpipes מכוסים בינוני. כעת, פתח גם את אספקת האוויר הדחוס אל מודול האוויר הנקי עם הברז של בקר הזרימה ההמונית (3 L/דקות)
  6. הסר את מוסיף תרבות התא מן הצלחות 6-היטב בעזרת tweezer. יוצקים את המדיום הצמיחה בזהירות מן התרבות התא מוסיף על ידי הפלת מוסיף ומאונן ולהשליך את השאריות נוזל באמצעות פיפטה. מניחים את התוספות בתאי החשיפה של שני המודולים, החשיפה ומודול אוויר נקי.
  7. סגור את המודולים והתחל את ניסויי החשיפה על-ידי חיבור מודול החשיפה לשקע החשיפה של מודול מחולל התרסיס ומודול האוויר הנקי לאספקת הגז המוביל בו זמנית.
    הערה: ניתן לשנות את ריכוז החלקיקים על-ידי הגדלה/הקטנה של ערך ההזנה , קצב זרימת הגז של המנשא או זמן החשיפה.
  8. נתק את החשיפה ומודולי האוויר הנקיים לאחר השלמת הניסוי ואטום את שקע החשיפה של המודול.
  9. לעצור את אספקת האוויר הדחוס ואת גנרטור תרסיס ידי לחיצה על לחצן עצור .
  10. פתח את החשיפה מודול אוויר נקי ולהעביר את התרבות התאים מוסיף לוחיות שלאחר הדגירה הכין באמצעות tweezer. מודטה את 6-צלחות לוחות עבור 24 שעות (37 ° צ', 5% CO2) ב-ALI.
    הערה: חזור על שלבים 10.5-10.10 אם מתוכננים ניסויים נוספים בחשיפה.
  11. הרימו את מוסיף תרבות התא, המשמשים כבקרי חממה ל-ALI תחת אותם תנאים כמו של תרבות התא חשוף מוסיף ו הדגירה אותם עבור 24 h (37 ° c, 5% CO2) ב-ALI.
  12. השתמש במצב ביות לחצן כדי להסיר את מיכל החומר. סגור את תוכנת הגנרטור תרסיס על ידי לחיצה על X בפינה הימנית העליונה ולכבות את המחשב.
  13. לאחר סיום כל ניסויי החשיפה, נקו את גנרטור התרסיס ומודולי החשיפה. סגור את מיכל החומר עם parafilm אם חומר הבדיקה יהיה בשימוש נוסף בתוך הימים הבאים.

היום השלישי

11. יכולת הכדאיות של התא

הערה: כדאיות התאים נקבעה 24 שעות לאחר התצהיר על ידי מדידת פעילות מיטוכונדריאלי באמצעות השיטה WST-1. הביצוע בוצע על פי פרוטוקול היצרן. יכולת הכדאיות של התא יכולה להיקבע גם באמצעות בדיקות הכדאיות האחרות של התאים (לדוגמה, XTT).

  1. מדיום צמיחה המזג ב 37 ° c ולהפשיר את WST-1 פתרון מוגן מפני אור. הכן מספר מתאים של הצלחות 6-היטב חדש עם 2.5 mL בינוני גדילה לכל טוב ומודאת לוחיות בחממה.
  2. הכינו את הדילול WST-1 על ידי דילול סכום מספיק של WST-1 1:7 בינוני בצמיחה
  3. הכנס את תרבות התא מוסיפה 24 שעות לאחר החשיפה בלוחות החדשים המוכנים 6-היטב. הוסף 1 מ ל של הפתרון WST-1 המוכן מחדש לכל תרבות תא להוסיף. טלטל את הצלחות בזהירות על מנת להפיץ את הפתרון בצורה מבשלה על התאים. מודאת 6-צלחת צלחות עם התרבות תאים מוסיף 1 h (37 ° צ', 5% CO2).
  4. העבר 100 μL של הסופרנטנט בטריליטים מכל 6-ובכן לצלחת 96-באר. למדוד את ספיגת ב 450 ננומטר עם אורך הגל התייחסות של 650 ננומטר באמצעות קורא מיקרופלייט.

12. סטטיסטיקות

  1. לנרמל את הכדאיות התאית של שולט האינקובטור הבודדים ל-100%.
  2. בטא את הכדאיות של התאים החשופים ביחס לבקרי האינקובטור הבודדים. רעילות ציטואת חומרי הניסוי הושוו לבקרי החממה המתאימים ומשמש כאינדיקטור לרעילות.

תוצאות

CULTEX RFS הוא מודולרי תוכנן במיוחד מערכת חשיפה מחוץ למערכת המאפשרת חשיפה ישירה והומוגנית של תאים ב-ALI. במסגרת מחקר טרום-אימות לשעבר, הישימות הכללית של מערכת החשיפה הזאת והיכולת שלה, היציבות והתוכסות הוכחו בהצלחה. בפרויקט מחקר שנערך לאחרונה במימון משרד החינוך והמחקר הגרמני, מ...

Discussion

מודלים רבים של הרעלת שאיפת בעלי חיים לא פותחו בשנים האחרונות על מנת לקבל מידע על מפגעי האינהלציה החריפה של חלקיקי שאיפה ולהפחית ולהחליף ניסויים בבעלי חיים על פי עיקרון ה-3R25.

במונחים של מודלים של תרבות התא, חשיפה של תאים ניתן לבצע בתנאים מתחת לאור או ב-ALI. חשיפת הת...

Disclosures

המחברים AT, ק ג, AB, SH, HM, TG, HT ו-DS אין מה לחשוף. החברה Cultex טכנולוגיה GmbH (לשעבר מעבדות Cultex GmbH) מייצרת מכשירים (g., CULTEX RFS, CULTEX DG) בשימוש במאמר זה. NM הייתה עובדת של GmbH מעבדות Cultex במהלך המחקר הזה. בסדר הוא עובד של Cultex הטכנולוגיה GmbH (לשעבר מעבדות Cultex GmbH). PCT פטנט/EP2009/007054 עבור המכשיר הוא להחזיק על ידי מייסד הטכנולוגיה Cultex GmbH פרופ ' ד ר אולריך Mohr (לשעבר מעבדות Cultex GmbH).

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי משרד החינוך והמחקר הגרמני (Bundesministerium ger בילדונג ו Forschung, BMBF, גרמניה (גרנט 031A581, תת-פרוייקט A-D)) ועל ידי הקרן המחקר הגרמני (דויטשה פורשונגסגסםהסלבירכתיים, DFG, מחקר קבוצת הדרכה GRK 2338).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Cells
A549ATCCCCL-185
Cell culture medium and supplies
DMEMBiochrom, Berlin, GermanyFG 0415used as growth medium
DMEMGibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany22320used as exposure medium
FBS superiorBiochrom, Berlin, GermanyS 0615
Gentamycin (10mg/mL)Biochrom, Berlin, GermanyA 2710
HEPES 1MTh. Geyer, Renningen, GermanyL 0180
PBSBiochrom, Berlin, GermanyL 1825
Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%)Biochrom, Berlin, GermanyL 2143
Cell culture material
CASY CupsRoche Diagnostic GmbH, Mannheim, GermanyREF 05651794
Cell culture platesCorning, Wiesbaden, Germany35166­-well plates
Corning Transwell cell culture insertsCorning, Wiesbaden, Germany345024mm inserts; 6-­well plates; 0.4 µm
Chemicals
CASYtonRoche Diagnostic GmbH, Mannheim, GermanyREF 05651808001
Compressed Air (DIN EN 12021)Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschleißheim, Germany2290152
WST-1Abcam, Cambridge, United Kingdomab155902
Instruments + equipment
CASY Cell CounterSchärfe System GmbH, Reutlingen, Germany
Circulation thermostatLAUDA, Lauda-Königshofen, GermanyEcoline RE 100
CULTEX HyP - Hydraulic PressCultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX insert sleeveCultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for particle exposure)Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for clean air exposure)Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX supply
Flow controller 0-30 ml/min (IQ-Flow)Bronkhorst Deutschland Nord GmbH
Flow controller 0-1,5 l/min (EL-Flow)Bronkhorst Deutschland Nord GmbH
Filters (large)Munktell & Filtrak GmbH, Sachsen, GermanyLP-050Munktell Sterile Filter; Particle retention efficiency > 99,999%
Filters (small)Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany9933-05-DQBalston disposable filter
Medium pumpCole-Parmer GmbH, Wertheim, GermanyIsmatec IPC High Precision Multichannel Dispenserdigital peristaltic pump
Microplate Reader Infinite M200 ProTecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany
Vakuum pumpKNF, Freiburg, GermanyN86 KT.18
Vögtlin mass flow controller 0,2-10 l/minTrigasFI GmbHVögtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20
Water BathLAUDA, Lauda-Königshofen, GermanyEcoline Staredition RE 104

References

  1. Faber, S. C., McCullough, S. D. Through the Looking Glass: In vitro Models for Inhalation Toxicology and Interindividual Variability in the Airway. Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 115-128 (2018).
  2. De Matteis, S., et al. Current and new challenges in occupational lung diseases. European Respiratory Review. 26 (146), 1-15 (2017).
  3. LANUV Nordrhein-Westfalen. . Gesundheitliche Risiken von Nanomaterialien nach inhalativer Aufnahme. , (2009).
  4. Bérubé, K., et al. In vitro Models of Inhalation Toxicity and Disease. The report of a FRAME workshop. Alternatives To Laboratory Animals. 37 (1), 89-141 (2009).
  5. Lopez, A. D., Murray, C. C. The global burden of disease, 1990-2020. Nature Medicine. 4 (11), 1241-1243 (1998).
  6. Clippinger, A. J., et al. Alternative approaches for acute inhalation toxicity testing to address global regulatory and non-regulatory data requirements: An international workshop report. Toxicology In vitro. 48, 53-70 (2018).
  7. Agrawal, M. R., Winder, C. Frequency and Occurrence of LD50 Values for Materials in the Workplace. Journal Of Applied Toxicology. 16 (5), 407-422 (1996).
  8. Amtsblatt der Europäischen Union. Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 des Europäischen Parlaments und des Rates. Europäische Union. 860, (2006).
  9. Huh, D., et al. Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  10. Fisher, R. L., et al. The Use of Human Lung Slices in Toxicology. Human and Experimental Toxicology. 13 (7), 466-471 (1994).
  11. Lenz, A. G., et al. Inflammatory and Oxidative Stress Responses of an Alveolar Epithelial Cell Line to Airborne Zinc Oxide Nanoparticles at the Air-Liquid Interface. Biomed Research International. 12, (2013).
  12. Steinritz, D., et al. Use of the CULTEX Radial Flow System as an in vitro exposure method to assess acute pulmonary toxicity of fine dusts and nanoparticles with special focus on the intra- and inter-laboratory reproducibility. Chemico-Biological Interactions. 206 (3), 479-490 (2013).
  13. Lacroix, G., et al. Air-Liquid Interface In vitro Models for Respiratory Toxicology Research. Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 91-106 (2018).
  14. Eskes, C., Whelan, M. . Validation of Alternative Methods for Toxicity Testing. 418, (2016).
  15. Rach, J., Budde, J., Möhle, N., Aufderheide, M. Direct exposure at the air-liquid interface: Evaluation of an in vitro approach for simulating inhalation of airborne substances. Journal Of Applied Toxicology. 34 (5), 506-515 (2014).
  16. Aufderheide, M., Halter, B., Möhle, N., Hochrainer, D. The CULTEX RFS: A comprehensive Technical Approach for the In vitro Exposure of Airway Epithelial Cells to the Particulate Matter at the Air-Liquid Interface. Biomed Research International. 15, (2013).
  17. Lieber, M., Todaro, G., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W. A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells. International Journal Of Cancer. 17 (1), 62-70 (1976).
  18. Carterson, A. J., et al. A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: Alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection And Immunity. 73 (2), 1129-1140 (2005).
  19. Kim, K. J., Borok, Z., Crandall, E. D. A useful in vitro model for transport studies of alveolar epithelial barrier. Pharmaceutical Research. 18 (3), 253-255 (2001).
  20. OECD. Test No. 403: Acute Inhalation Toxicity. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2009).
  21. OECD. Test No. 436: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2009).
  22. Tsoutsoulopoulos, A., et al. Validation of the CULTEX Radial Flow System for the assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles. Toxicology In vitro. 58, 245-255 (2019).
  23. Tsoutsoulopoulos, A., et al. A novel exposure system generating nebulized aerosol of sulfur mustard in comparison to the standard submerse exposure. Chemico-Biological Interactions. 298, 121-128 (2019).
  24. Tsoutsoulopoulos, A., et al. Optimization of the CULTEX radial flow system for in vitro investigation of lung damaging agents. Toxicology Letters. 244, 28-34 (2016).
  25. Osman, J. J., Birch, J., Varley, J. The response of GS-NS0 myeloma cells to pH shifts and pH perturbations. Biotechnology and Bioengineering. 75 (1), 63-73 (2001).
  26. OECD. Test Guideline 433: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2018).
  27. OECD. . Guidance Document on Inhalation Toxicity Studies. , (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

156

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved