АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы представляем надежную, переносимую и прогностическую систему воздействия in vitro для скрининга и мониторинга частиц, передающихся воздушно-капельным путем, относительно их острой легочной цитотоксичности, подвергая культивируемые клетки легких человека в воздушно-жидком интерфейсе (АЛИ).

Аннотация

Здесь мы представляем специально разработанную модульную систему воздействия in vitro, которая позволяет однородное воздействие культивируемых клеток легких человека в АЛИ на газы, частицы или сложные атмосферы (например, сигаретный дым), обеспечивая тем самым реалистичные физиологические воздействие актической поверхности альвеолярной области человека в воздух. В отличие от последовательных моделей воздействия с линейным аэрозолем, модульная конструкция системы радиального потока отвечает всем требованиям для непрерывного генерации и транспортировки испытательной атмосферы в клетки, однородного распределения и осаждения частиц и непрерывное удаление атмосферы. Этот метод воздействия в первую очередь предназначен для воздействия клеток на частицы, передаваемые воздушно-капельным путем, но может быть адаптирован к воздействию жидких аэрозолей и высокотоксичных и агрессивных газов в зависимости от метода генерации аэрозолей и материала модулей воздействия .

В рамках недавно завершенного исследования валидации эта система воздействия была доказана как переносимый, воспроизводимый и прогностический метод скрининга для качественной оценки острой легочной цитотоксичности частиц, передаваемых воздушно-капельным путем, тем самым потенциальное сокращение или замена экспериментов на животных, которые, как правило, обеспечивают эту токсикологические оценки.

Введение

Вдыхание токсичных частиц воздушно-капельным путем является проблемой общественного здравоохранения, что приводит к множеству рисков для здоровья во всем мире и многим миллионам смертей ежегодно1,2. Изменение климата, продолжающееся промышленное развитие и растущий спрос на энергию, сельскохозяйственную и потребительские товары способствовали росту легочных заболеваний за последние годы3,4,5,6. Знания и оценка ингаляционных веществ относительно их острой ингаляционной токсичности являются основой для оценки опасности и управления рисками, но эта информация по-прежнему отсутствует для широкого спектра этих веществ7,8. С 2006 года химическое законодательство ЕС REACH (регистрация, оценка, авторизация и ограничение химических веществ) требует, чтобы уже существующие и вновь введенные продукты подвергали токсикологическую характеристику, включая ингаляционный маршрут перед тем, как быть выставленными на рынок. Поэтому REACH фокусируется на альтернативных и бесживотных методах, реализации принципа «3R» (Замена, уточнение и сокращение экспериментов на животных) и использовании соответствующих моделей in vitro9. В последние годы, много различных и адекватных неживотных ингаляционной токсичности модели тестирования (например, в пробирке клеток культур, легких на чипе модели, точность сократить легких ломтики (PCLS)) были разработаны для того, чтобы оценить острую токсичность ингаляции частиц в воздухе5,7,10,11. С точки зрения моделей культуры клеток in vitro, культивируемые клетки могут подвергаться воздействию в условиях погружения или в АЛИ(рисунок 1). Однако достоверность исследований, связанных с воздействием на воду, ограничена в том, что касается оценки токсичности соединений, передающихся воздушно-капельным путем, особенно частиц. Методы воздействия подводных человек не соответствуют ситуации в живо человека; среда культуры клетки покрывая клетки может повлиять на физико-химические свойства и таким образом, токсические свойства испытательного вещества12,13. Модели ингаляции ALI in vitro позволяют прямое воздействие клеток на испытательные вещества без вмешательства среды клеточной культуры с испытательными частицами, таким образом, имитируя воздействие человека с более высоким физиологическим и биологическим сходством, чем погруженные воздействия12,14.

Для регулирующих процессов, таких как REACH, однако, только животные модели доступны в области острой ингаляции токсикологии, так как никаких альтернативных методов in vitro были достаточно проверены и официально приняты до сих пор14. Для этого тестовые модели должны быть проверены в соответствии с требованиями Справочной лаборатории Европейского союза по альтернативам тестированию на животных (EURL-ECVAM) в отношении действия теста15.

Бывшее предварительное исследование проверки и недавно завершенное исследование проверки успешно продемонстрировали область применения системы выдержки CULTEX RFS и ее переносимость, стабильность и воспроизводимость13. Эта система воздействия является системой воздействия на основе клеток in vitro, которая позволяет однородное воздействие клеток на газы, частицы или сложные атмосферы (например, сигаретный дым) в ALI из-за своей концепции распределения радиальных аэрозолей и проведения испытательного аэрозоля в непрерывном потоке над клетками16. Основной модуль этой системы радиального потока состоит из адаптера входе, аэрозоля направляющий модуль с распределением радиального аэрозоля, модуля выборки и розетки, и блокирующего модуля с ручным колесом(рисунок 2). Генерируемые частицы достигают клеток через адаптер ввода и аэрозольный направляющий модуль и откладываются на вставках клеточной культуры, которые расположены в трех радиографически расположенных камерах модуля выборки. Аэрозольный направляющий модуль, а также модуль отбора проб можно нагревать, подключившись к внешней водяной бане17.

В рамках обоих исследований, A549 клетки были использованы для всех экспериментов воздействия. Клеточная линия A549 является увековеченной эпителиальной линией клеток человека, которая очень хорошо характеризуется и используется в качестве модели in vitro для альвеолярных эпителиальных клеток II типа в многочисленных токсикологических исследованиях. Клетки характеризуются ламеллярными телами, производством сурфактанта и рядом воспаления-соответствующих факторов18. Они также показывают свойства бронхиальных эпителиальных клеток из-за их производства слизи19. Кроме того, они могут быть культивированы в ALI. Хотя эта клеточная линия не хватает в создании клеток клеток контактов, выращивание этих клеток является гораздо более удобным, дешевле дорогих и результаты, полученные из них являются донорами-независимыми по сравнению с первичными клетками20.

A549 клетки были посеяны в 6-колодцклеточной культуры вставки (ПЭТ мембрана, 4,67 см2,размер пор 0,4 мм) с плотностью 3,0 х 105 клеток на вставку и культивируется для 24 ч погруженных в условиях. Затем клетки были выставлены в трех независимых лабораториях для очистки воздуха и трех различных доз воздействия (25, 50 и 100 мкг/см2) 20 испытательных веществ в АЛИ. Доза воздействия коррелирует с временем осаждения, что приводит к постоянной скорости частиц 25 мкг/см2,50 мкг/см2 и 100 мкг/см2 на клетки после 15, 30 или 60 мин, соответственно. Отложенные частицы, однако, не были смыты после осаждения, а оставались на клетках в течение 24 ч. Таким образом, время осаждения частиц составляло 15, 30 и 60 мин, но воздействие клеток длилось в общей сложности 24 ч. Скорость осаждения испытательных веществ была определена в предварительных экспериментах по предыдущим методам17.

Жизнеспособность клеток как индикатор токсичности оценивалась 24 ч после осаждения частиц с помощью анализа жизнеспособности клеток. Особое внимание было уделено качеству контроля за чистым воздухом, оптимизации и уточнению протокола воздействия, внутри- и межлабораторной воспроизводимости и созданию модели прогнозирования (ТЧ). Вещества, которые привели к снижению жизнеспособности клеток ниже 50% (PM 50%) или 75% (PM 75%) в любой из трех доз воздействия считалось, что оказывают острую опасность ингаляции. Результаты были затем по сравнению с существующими данными in vivo (на основе по крайней мере одного надежного исследования в соответствии с руководящим принципом испытаний ОЭСР (TG) 403 или TG 43621,22),что привело к общему согласованию 85%, со специфичностью 83% и чувствительностью 88%23.

Помимо измерения жизнеспособности клеток, другие конечные точки, такие как высвобождение цитокинов, изучение клеточного лизата или мембранной целостности с помощью анализа LDH, могут быть оценены, но не были необходимы для исследования проверки. Таким образом, система воздействия (например, CULTEX RFS) была доказана как система прогностического скрининга для качественной оценки острой ингаляционной токсичности исследуемых частиц, передающихся воздушно-капельным путем, что представляет собой перспективный альтернативный метод тестирования на животных. Следующий протокол рекомендуется для экспериментов воздействия на частицы в воздухе с помощью этой системы воздействия.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол одного эксперимента воздействия охватывает три дня.

День 1

1. Общие препараты и культивирование клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Аденокарцинома человека аденокарциномы линии эпителиальной клетки A549 был использован для воздействия экспериментов. Клетки должны обрабатываться в стерильных условиях. Другие линии клетки которые целесообразны для культивирования на ALI можно использовать.

  1. Подготовьте среду роста (Минимальный основной средний (DMEM) Dulbecco, дополненную 10% сывороткой крупного рогатого скота плода (FBS) и 5 мкг/мл гентамицина) и средой воздействия (DMEM, дополненный 5 мкг/мл гентамицином и окончательной концентрацией HEPES 100 мм).
  2. Культура A549 клеток в среде роста при 37 градусах Цельсия в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO2.
  3. Культивировать клетки в колбе клеточной культуры 75 см2 (Т-75) в 14 мл среды роста до слияния 80-90% до расщепления (каждые 2-3 дня) и прохождения 35.
  4. Рассчитайте объем подвески и необходимое количество вставок клеточной культуры (три вставки клеточной культуры в качестве управления инкубатором и вставки клеточной культуры для воздействия чистого воздуха и частиц) и пластин ы культуры клеток.
  5. Перед трипсинизацией и посевом клеток добавьте 2,5 мл средней закаленной среды роста к каждой скважине 6-хорошей пластины. Поместите клеточной культуры вставки без клеток тщательно внутри скважин и добавить 1 мл роста среды для каждой клетки культуры вставки. Инкубировать 6-колодные пластины в течение не менее 30 мин в инкубаторе (37 градусов по Цельсию, 5% CO2).

2. Трипсинизация клеток

  1. Температура фосфатов буферного солира (PBS) и среды роста на 37 градусов по Цельсию и трипсин / EDTA (0,05%/ 0.02%) раствор при комнатной температуре.
  2. Аспирируйте среду культуры клетки от колбы культуры клетки и вымойте клетки тщательно с 8 mL pre-heated PBS.
  3. Удалить PBS, добавить 2 мл трипсина / EDTA (0,05%/ 0.02%) раствор для клеток и инкубировать для максимум6 мин. в инкубаторе при 37 градусах Цельсия. Контролируйте процесс отслоения под микроскопом.
  4. Нейтрализовать активность трипсина, добавив 8 мл предварительно нагретой среды роста, отсоединить клетки, осторожно нажав боком на колбу и переприостановит клетки путем повторного пипетки вверх и вниз.
  5. Перенесите суспензию ячейки на трубку 50 мл. Определите номер клетки для дальнейшей процедуры (например, посев клеток, прохождение клеток).

3. Определение номера ячейки

ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация клеток была определена с помощью счетчика клеток или камер подсчета.

  1. Разбавить 100 л суспензии клеточной культуры в чашке, наполненной 10 мл изотонического раствора. Наклоните чашку медленно, не встряхивая.
  2. Определить количество жизнеспособных ячеек/мл и жизнеспособность клеток на основе клеточных параметров измерения клеток A549.

4. Посев клеток на микропористые мембраны в клеточных вставках культуры

ПРИМЕЧАНИЕ: Система экспозиции оснащена специальными адаптерами, позволяющими использовать коммерческие вставки от различных поставщиков и различных размеров. Для этих экспериментов воздействия были использованы 6-колодские пластины и соответствующие вставки клеточной культуры. Все рабочие шаги должны быть выполнены в стерильных условиях.

  1. Обеспечить предварительно нагретый рост среды в условиях стерильной культуры клеток (ламинарный поток).
  2. Подготовьте достаточно большой объем клеточной суспензии с концентрацией клеток 3,0 х 105 клеток/мл.
  3. После закалки пластин в течение 30 минут, аспирируем среду в клеточной культуре вставки и семена 1 мл из клеток A549 с плотностью 3,0 х 105 клеток/мл в каждой вставке культуры клеток. Распределите подвеску клетки нежным качать.
  4. Инкубировать клеточной культуры вставляет с подвеской клетки для 24 h (37 c и 5% CO2).

5. Прессинг испытательных веществ

ПРИМЕЧАНИЕ: Испытательные вещества были нажаты в порошковые пирожные с помощью полностью управляемого гидравлического пресса. Пресс-пакет может применять максимальную силу 18 кН, которая отображается как текущее давление масла (в баре) пресс-пакета. В ходе предварительных испытаний необходимо установить и охарактеризовать условия для прессы (давление, время прессования) неизвестных испытательных веществ. В зависимости от свойств прессвещества можно использовать различные параметра нажатия и виды прессования.

ВНИМАНИЕ: Носите защитное оборудование при нажатии токсичных или опасных веществ.

  1. Установите время нажатия с помощью контроля времени на передней стороне пресса.
  2. Откройте запас сжатого воздуха на клапане сжатого воздуха. Установите давление сжатого воздуха примерно до 2 бар (указано датчиком давления на передней стороне) с помощью регулятора давления на передней стороне пресса или на клапане сжатого воздуха сжатого воздуха. Вытяните ящик, нажмите кнопку "Нажмите" и прочитайте нажатие на цифровой переключатель давления.
    1. Прочитайте только давление на регуляторе давления, если давление слишком высокое или слишком низкое.
  3. Сборка контейнера вещества и убедитесь, что стеклянный цилиндр правильно центрированный(Дополнительная рисунок 1). Заполните контейнер вещества небольшим количеством испытательного вещества. Вставьте поршень в контейнер вещества и поверните его немного вперед и назад, чтобы равномерно распределить порошок в контейнере.
  4. Поместите контейнер вещества с поршенем в ящик и нажмите кнопку «Нажмите кнопку». Гидравлический поршень пресса перемещается на поршень и оказывает давление на испытательное вещество в течение установленного времени нажатия. Откройте ящик и удалите поршень.
  5. Повторите шаги 5.3 и 5.4 до тех пор, пока контейнер вещества не будет заполнен не менее чем наполовину.
  6. После завершения работы по нажатию выньте контейнер вещества из ящика и переверните его вверх дном, чтобы удалить рыхлые и отложенные частицы.
  7. Если контейнер вещества не нужен в тот же день, закройте контейнер вещества с parafilm для того чтобы предотвратить вещество испытания от высыхания или поглощать влагу.

День 2

6. Сборка системы экспозиции и подключение периферического оборудования

ПРИМЕЧАНИЕ: Более подробное представление представлено на рисунке 3, Дополнительная рисунок 2 и Дополнительная рисунок 3. Соберите оба модуля и генератор аэрозолей в соответствии с инструкциями производителя.

  1. Поместите систему экспозиции на твердую и ровную поверхность, с водоснабжением вперед. Соедините контроллеры массового потока с аэрозольной генератором и трехшеей бутылкой, подключенной к модулю для чистого воздействия воздуха.
  2. Подключите контроллер потока и вакуумный насос. Соедините трубки от контроллеров потока с разъемом трубки на креплениях аэрозомного направляющего модуля. Соедините трубы на другой стороне контроллеров потока с вакуумным насосом. Убедитесь, что поток идет от модуля через контроллеры потока к вакуумный насос.
  3. Соедините водяную баню с подачей воды отопления. Подача воды идет от водяной ванны к впуску воды на аэрозольной направляющей модуле. Соедините выход воды аэрозольной направляющей модуля с водозабором модуля отбора проб. Закройте круг с подключением от выхода воды модуля выборки к водяной бане.
  4. Поместите генератор аэрозолей, включая элутриатор, близко к модулю экспозиции и соедините избыточные линии элутриатора и модуля воздействия и чистого воздуха с большими микрофильтрами, а также всасывание камер экспозиции с небольшими микрофильтрами (например, одноразовые фильтры). Элутриатор служит резервуаром для генерируемых частиц атмосферы и сохраняет частицы больше, чем около 7 мкм, в то время как мелкие частицы транспортируются в модуль экспозиции.
  5. Подключите компьютер, используемый для управления генерацией аэрозолей, к USB-порту верхней части аэрозольных генераторов с помощью USB-кабеля и источника питания в порт питания. Подключите вилку питания блока питания к розетке (220-240 V).
  6. Соедините трубы для среднего питания и удаления с двумя насосами. Вместо использования насоса для среднего питания, среда также может быть заполнена вручную.

7. Подготовка к воздействию чистого воздуха и частиц

  1. Включите вакуумный насос, контроллеры потока и водяную ванну (37 градусов по Цельсию) в течение периода разогрева не менее 30 мин.
  2. Откройте запас сжатого воздуха. Установите контроллеры массового потока до 8 л/мин для линии поставки аэрозольной генератора и до 3 л/мин для линии поставки к трехшеей бутылке. Закройте вкладки контроллеров массового потока.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти значения могут варьироваться в зависимости от характеристик испытательного вещества.
  3. Отрегулируйте контроллеры потока через компьютер, чтобы регулировать поток модуля (1,5 л/мин) и всасывание камеры (30 мл/мин).

8. Испытание утечки системы радиального потока

ПРИМЕЧАНИЕ: Проверка утечки должна быть выполнена в вакууме и для обоих модулей (экспозиция и модуль чистого воздуха) для того, чтобы убедиться, что модуль был собран должным образом.

  1. Удалите адаптер входе и отражатель конденсата из аэрозольной направляющей модуля. Закройте три аэрозольные скважины в аэрозольных направляющих модулями с вилками и средними соединениями снабжения в модуле выборки с манекенами.
  2. Соедините вакуумные линии без фильтра с трубным разъемом аэрозольной направляющей модуля. Закройте модуль с помощью ручного колеса и измерьте значение контроллеров потока. Значения должны уменьшаться через несколько минут после закрытия ниже 5 мл/мин.
  3. После проверки непроницаемости, удалить все пробки и манекен закрылки, вставьте адаптер входе и конденсат отражатель в аэрозоль руководящий модуль и подключить трубы для среднего питания и удаления.

9. Поколение аэрозолей

  1. Запустите компьютер и программное обеспечение(Дополнительная рисунок 4). Запустите программное обеспечение генератораэро аэрозолей, дважды нажав на кнопку запуска генератора аэрозолей на рабочем столе компьютера. Появляется окно сообщения и спрашивает, следует ли сбросить настройки или нет. Нажмите Да, если программное обеспечение запущено в первый раз в этот день. Установите значения для позиции слайдов и позиции скрепы к значениям по умолчанию. Нажмите Нет, чтобы сохранить значения для позиции слайда и позиции скребка или слайд не находится в исходном положении.
  2. Завинчивай вещество скребок в трубу, которая находится в центральном отверстии верхнего генератора аэрозоля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от характеристик пресса, различные типы вещества скребок могут быть использованы.
  3. Используйте кнопку Самонаводящийся режим, если вещество скребок не находится в самом низком положении.
  4. Поместите контейнер вещества с прессованным испытательным материалом вверх дном над веществом скребок. Убедитесь, что стекло контейнера вещества выходит на переднюю часть. Убедитесь, что два отверстия в контейнере вещества помещаются на две булавки верхнего генератора аэрозолей. Поместите запирающую пластину в слот над контейнером вещества и затяните черный винт.
  5. Измените значения для Feed (от 0,24 до 20 мм/ч) и Вращения (от 1 до 800 оборотов/ч) на желаемые параметры. Концентрация частиц может быть изменена путем увеличения или уменьшения значения корма или скорости потока газа носителя.
  6. Используйте нисходящие стрелки, чтобы нажать вниз слайд с веществом контейнера, пока вещество скребок рядом с прессованным веществом.
  7. Откройте сжатое подачу воздуха в аэрозольный генератор одним нажатием контроллера массового потока и начните генерацию аэрозолей, нажав на кнопку «Пуск». Установите скорость подачи до 15-20 мм/ч, чтобы избежать длительного ожидания.
  8. Управляйте правильной генерацией частиц, наблюдая за мелким облаком пыли с помощью небольшого фонарика (расположенного снизу за стеклянной трубкой Elutriator). Измените значение Feed обратно в желаемые параметры, когда первый аэрозольный пар непрерывно достигает Elutriator и нажмите на кнопку Стоп.

10. Эксперименты на экспозиции

  1. Запустите средний запас с предварительно нагретой средой экспозиции и заполните модули выборки до тех пор, пока не будут покрыты вниз трубы, пока модуль открыт. Используйте средний насос или заполнить среду вручную (25 мл на индивидуальную камеру экспозиции).
  2. Вставьте вставить в модуле экспозиции вставки слепой культуры клеток (вставляется без ячеек). Насос воздействия среды вниз до вниз по трубам покрыты средой и нижней стороне вставки находятся в контакте со средой.
  3. Запустите генератор аэрозолей, закройте модуль экспозиции и подключите модуль экспозиции к выходу модуля экспозиции аэрозольной генератора. Дайте генератору аэрозолей время свинца, по крайней мере 20-30 минут до начала воздействия, с тем чтобы обеспечить стабильное поколение частиц.
  4. Подготовьте постинкубационные пластины для управления инкубатором и вставные клеточные культуры во время времени. Добавьте 1,5 мл среды роста на скважину и инкубируют пластины в инкубаторе (37 градусов по Цельсию, 5% CO2).
  5. После времени проведения уплотнение модуля экспозиции Elutriator резиновой вилкой и снимите слепые вставки. Пополнить среду экспозиции (с помощью насоса или вручную) до тех пор, пока вниз трубы покрыты средой. Теперь, откройте также сжатое подачу воздуха к модулю чистого воздуха с касанием регулятора потока массы (3 L/min)
  6. Удалите вставки клеточной культуры с 6-колодных пластин с помощью пинцета. Налейте среды роста тщательно от клеточной культуры вставляет путем свержения вставки и аспирировать и отказаться от остаточной жидкости с помощью пипетки. Поместите вставки в экспозиционные камеры обоих модулей, экспозицию и модуль чистого воздуха.
  7. Закройте модули и начните эксперименты по экспозиции, подключив модуль экспозиции к выходу модуля экспозиции аэрозольной генератора и модулю чистого воздуха к газоснабжению носителя одновременно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация частиц может быть изменена путем увеличения/уменьшения значения корма, скорости потока газа носителя или времени воздействия.
  8. Отключите экспозицию и модули чистого воздуха после завершения эксперимента и загерметизируйте выход модуля экспозиции.
  9. Остановите подачу сжатого воздуха и генератор аэрозолей, нажав на кнопку «Стоп».
  10. Откройте экспозицию и модуль чистого воздуха и перенесите вставки клеточной культуры на подготовленные постинкубационные пластины с помощью пинцета. Инкубировать 6-колодьные пластины для 24 ч (37 кв.к., 5% CO2) в ALI.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите шаги 10.5 -10.10, если запланированы дальнейшие эксперименты по воздействию.
  11. Поднимите вставки клеточной культуры, которые используются в качестве управления инкубатором в ALI в тех же условиях, что и открытые вставки клеточной культуры, и инкубировать их в течение 24 ч (37 градусов по Цельсию, 5% CO2)в ALI.
  12. Используйте режим наведения кнопки, чтобы удалить контейнер вещества. Закройте программное обеспечение генератора аэрозолей, нажав на X в правом верхнем углу и выключите компьютер.
  13. После завершения всех экспериментов воздействия, очистить генератор аэрозолей и оба модуля экспозиции. Закройте контейнер вещества с parafilm если вещество испытания более добавочно будет использовано в пределах следующих дней.

День 3

11. Жизнеспособность клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность клеток была определена 24 ч после осаждения частиц путем измерения митохондриальной активности с помощью оценки WST-1. Ассес проводился в соответствии с протоколом производителя. Жизнеспособность клеток также может быть определена с помощью других тестов жизнеспособности клеток (например, XTT).

  1. Температура среды роста при температуре 37 градусов по Цельсию и оттаивания раствора WST-1 защищен от света. Подготовьте соответствующее количество новых 6-колодных пластин со средой роста 2,5 мл на скважину и инкубируйтесь в инкубаторе.
  2. Подготовка WST-1 разбавления путем разбавления достаточное количество WST-1 1:7 в среде роста
  3. Вставьте клеточной культуры вставляет 24 ч после воздействия в новых подготовленных 6-колодец пластин. Добавьте 1 мл свежеподготовленного раствора WST-1 к каждой вставке культуры клеток. Раскачивать пластины тщательно для того, чтобы распределить раствор однородно на клетки. Инкубировать 6-колодцы пластины с клеточной культурой вставки для 1 ч (37 кв.к., 5% CO2).
  4. Передача 100 злитрового в триплицирует от каждого 6-ну в 96-хорошую пластину. Измерьте абсорбцию на уровне 450 нм с эталонной длиной волны 650 нм с помощью микроплитного считывателя.

12. Статистика

  1. Нормализовать жизнеспособность клеток индивидуального инкубатора управления до 100%.
  2. Выразить жизнеспособность подвергшихся воздействию клеток по отношению к отдельным управлениям инкубатора. Цитотоксичность испытательных веществ сравнивалась с соответствующими элементами управления инкубатором и использовалась в качестве индикатора токсичности.

Результаты

CULTEX RFS является специально разработанной модульной системой воздействия in vitro, которая обеспечивает прямое и однородное воздействие клеток на ALI. В рамках бывшего предварительного исследования были успешно продемонстрирована общая применимость этой системы воздейс?...

Обсуждение

Многие неживотные модели тестирования токсичности ингаляции были разработаны в последние годы для того, чтобы получить информацию об острой опасности ингаляции ингаляционных частиц и уменьшить и заменить эксперименты на животных в соответствии с принципом 3R25.

Раскрытие информации

Авторам AT, KG, AB, SH, HM, TG, HT и DS нечего раскрывать. Компания Cultex Technology GmbH (ранее Cultex Laboratories GmbH) производит инструменты (например, CULTEX RFS, CULTEX DG), используемые в этой статье. НМ был сотрудником Cultex Laboratories GmbH во время этого исследования. OK является сотрудником Cultex Technology GmbH (ранее Cultex Laboratories GmbH). Патент PCT/EP2009/007054 для устройства принадлежит основателю Cultex Technology GmbH профессору доктору Ульриху Мору (ранее Cultex Laboratories GmbH).

Благодарности

Эта работа была поддержана Федеральным министерством образования и исследований Германии (Bundesministerium f'r Bildung und Forschung, BMBF, Германия (Grant 031A581, подпроект A-D)) и Немецким исследовательским фондом (Deutsche Forschungsgesellschaft, DFG, Исследовательская учебная группа GRK 2338).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Cells
A549ATCCCCL-185
Cell culture medium and supplies
DMEMBiochrom, Berlin, GermanyFG 0415used as growth medium
DMEMGibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany22320used as exposure medium
FBS superiorBiochrom, Berlin, GermanyS 0615
Gentamycin (10mg/mL)Biochrom, Berlin, GermanyA 2710
HEPES 1MTh. Geyer, Renningen, GermanyL 0180
PBSBiochrom, Berlin, GermanyL 1825
Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%)Biochrom, Berlin, GermanyL 2143
Cell culture material
CASY CupsRoche Diagnostic GmbH, Mannheim, GermanyREF 05651794
Cell culture platesCorning, Wiesbaden, Germany35166­-well plates
Corning Transwell cell culture insertsCorning, Wiesbaden, Germany345024mm inserts; 6-­well plates; 0.4 µm
Chemicals
CASYtonRoche Diagnostic GmbH, Mannheim, GermanyREF 05651808001
Compressed Air (DIN EN 12021)Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschleißheim, Germany2290152
WST-1Abcam, Cambridge, United Kingdomab155902
Instruments + equipment
CASY Cell CounterSchärfe System GmbH, Reutlingen, Germany
Circulation thermostatLAUDA, Lauda-Königshofen, GermanyEcoline RE 100
CULTEX HyP - Hydraulic PressCultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX insert sleeveCultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for particle exposure)Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for clean air exposure)Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX supply
Flow controller 0-30 ml/min (IQ-Flow)Bronkhorst Deutschland Nord GmbH
Flow controller 0-1,5 l/min (EL-Flow)Bronkhorst Deutschland Nord GmbH
Filters (large)Munktell & Filtrak GmbH, Sachsen, GermanyLP-050Munktell Sterile Filter; Particle retention efficiency > 99,999%
Filters (small)Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany9933-05-DQBalston disposable filter
Medium pumpCole-Parmer GmbH, Wertheim, GermanyIsmatec IPC High Precision Multichannel Dispenserdigital peristaltic pump
Microplate Reader Infinite M200 ProTecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany
Vakuum pumpKNF, Freiburg, GermanyN86 KT.18
Vögtlin mass flow controller 0,2-10 l/minTrigasFI GmbHVögtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20
Water BathLAUDA, Lauda-Königshofen, GermanyEcoline Staredition RE 104

Ссылки

  1. Faber, S. C., McCullough, S. D. Through the Looking Glass: In vitro Models for Inhalation Toxicology and Interindividual Variability in the Airway. Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 115-128 (2018).
  2. De Matteis, S., et al. Current and new challenges in occupational lung diseases. European Respiratory Review. 26 (146), 1-15 (2017).
  3. LANUV Nordrhein-Westfalen. . Gesundheitliche Risiken von Nanomaterialien nach inhalativer Aufnahme. , (2009).
  4. Bérubé, K., et al. In vitro Models of Inhalation Toxicity and Disease. The report of a FRAME workshop. Alternatives To Laboratory Animals. 37 (1), 89-141 (2009).
  5. Lopez, A. D., Murray, C. C. The global burden of disease, 1990-2020. Nature Medicine. 4 (11), 1241-1243 (1998).
  6. Clippinger, A. J., et al. Alternative approaches for acute inhalation toxicity testing to address global regulatory and non-regulatory data requirements: An international workshop report. Toxicology In vitro. 48, 53-70 (2018).
  7. Agrawal, M. R., Winder, C. Frequency and Occurrence of LD50 Values for Materials in the Workplace. Journal Of Applied Toxicology. 16 (5), 407-422 (1996).
  8. Amtsblatt der Europäischen Union. Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 des Europäischen Parlaments und des Rates. Europäische Union. 860, (2006).
  9. Huh, D., et al. Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  10. Fisher, R. L., et al. The Use of Human Lung Slices in Toxicology. Human and Experimental Toxicology. 13 (7), 466-471 (1994).
  11. Lenz, A. G., et al. Inflammatory and Oxidative Stress Responses of an Alveolar Epithelial Cell Line to Airborne Zinc Oxide Nanoparticles at the Air-Liquid Interface. Biomed Research International. 12, (2013).
  12. Steinritz, D., et al. Use of the CULTEX Radial Flow System as an in vitro exposure method to assess acute pulmonary toxicity of fine dusts and nanoparticles with special focus on the intra- and inter-laboratory reproducibility. Chemico-Biological Interactions. 206 (3), 479-490 (2013).
  13. Lacroix, G., et al. Air-Liquid Interface In vitro Models for Respiratory Toxicology Research. Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 91-106 (2018).
  14. Eskes, C., Whelan, M. . Validation of Alternative Methods for Toxicity Testing. 418, (2016).
  15. Rach, J., Budde, J., Möhle, N., Aufderheide, M. Direct exposure at the air-liquid interface: Evaluation of an in vitro approach for simulating inhalation of airborne substances. Journal Of Applied Toxicology. 34 (5), 506-515 (2014).
  16. Aufderheide, M., Halter, B., Möhle, N., Hochrainer, D. The CULTEX RFS: A comprehensive Technical Approach for the In vitro Exposure of Airway Epithelial Cells to the Particulate Matter at the Air-Liquid Interface. Biomed Research International. 15, (2013).
  17. Lieber, M., Todaro, G., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W. A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells. International Journal Of Cancer. 17 (1), 62-70 (1976).
  18. Carterson, A. J., et al. A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: Alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection And Immunity. 73 (2), 1129-1140 (2005).
  19. Kim, K. J., Borok, Z., Crandall, E. D. A useful in vitro model for transport studies of alveolar epithelial barrier. Pharmaceutical Research. 18 (3), 253-255 (2001).
  20. OECD. Test No. 403: Acute Inhalation Toxicity. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2009).
  21. OECD. Test No. 436: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2009).
  22. Tsoutsoulopoulos, A., et al. Validation of the CULTEX Radial Flow System for the assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles. Toxicology In vitro. 58, 245-255 (2019).
  23. Tsoutsoulopoulos, A., et al. A novel exposure system generating nebulized aerosol of sulfur mustard in comparison to the standard submerse exposure. Chemico-Biological Interactions. 298, 121-128 (2019).
  24. Tsoutsoulopoulos, A., et al. Optimization of the CULTEX radial flow system for in vitro investigation of lung damaging agents. Toxicology Letters. 244, 28-34 (2016).
  25. Osman, J. J., Birch, J., Varley, J. The response of GS-NS0 myeloma cells to pH shifts and pH perturbations. Biotechnology and Bioengineering. 75 (1), 63-73 (2001).
  26. OECD. Test Guideline 433: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2018).
  27. OECD. . Guidance Document on Inhalation Toxicity Studies. , (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

156in vitro

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены