Évaluation de la toxicité par inhalation aigue des particules aéroportées en exposant les cellules pulmonaires humaines cultivées à l’interface air-liquide

Résumé

Nous présentons un système robuste, transférable et prédictif d’exposition in vitro pour le criblage et la surveillance des particules aéroportées concernant leur cytotoxicité pulmonaire aigue en exposant les cellules pulmonaires humaines cultivées à l’interface air-liquide (ALI).

Résumé

Ici, nous présentons un système modulaire d’exposition in vitro spécialement conçu qui permet l’exposition homogène des cellules pulmonaires humaines cultivées à l’ALI aux gaz, aux particules ou aux atmosphères complexes (par exemple, la fumée de cigarette), fournissant ainsi des aspects physiologiques réalistes l’exposition de la surface apaïque de la région alvéolienne humaine à l’air. Contrairement aux modèles d’exposition séquentielle avec guidage linéaire d’aérosol, la conception modulaire du système d’écoulement radial répond à toutes les exigences pour la génération et le transport continus de l’atmosphère d’essai aux cellules, une distribution homogène et le dépôt de particules et l’élimination continue de l’atmosphère. Cette méthode d’exposition est principalement conçue pour l’exposition des cellules aux particules en suspension dans l’air, mais peut être adaptée à l’exposition d’aérosols liquides et de gaz hautement toxiques et agressifs selon la méthode de production d’aérosols et le matériau des modules d’exposition. .

Dans le cadre d’une étude de validation récemment terminée, ce système d’exposition a été prouvé comme une méthode de dépistage transférable, reproductible et prédictive pour l’évaluation qualitative de la cytotoxicité pulmonaire aigue des particules en suspension dans l’air, potentiellement réduire ou remplacer les expériences animales qui fourniraient normalement cette évaluation toxicologique.

Introduction

L’inhalation de particules toxiques en suspension dans l’air est un problème de santé publique, entraînant une multitude de risques pour la santé dans le monde entier et plusieurs millions de décès par an^1,2. Le changement climatique, le développement industriel en cours et la demande croissante d’énergie, d’agriculture et de produits de consommation ont contribué à l’augmentation des maladies pulmonaires au cours des dernières années^3,4,5,6. La connaissance et l’évaluation des substances inhalables concernant leur toxicité par inhalation grave constituent la base de l’évaluation des risques et de la gestion des risques, mais cette information fait encore défaut pour un large éventail de ces substances^7,8. Depuis 2006, la législation de l’UE sur les produits chimiques REACH (Enregistrement, Évaluation, Autorisation et Restriction des produits chimiques) exige que les produits déjà existants et nouvellement introduits subissent une caractérisation toxicologique, y compris la voie d’inhalation, avant d’être mis sur le marché. Par conséquent, REACH met l’accent sur les méthodes alternatives et sans animaux, la mise en œuvre du principe « 3R » (Remplacement, raffinement et réduction des expériences animales) et l’utilisation de modèles in vitro appropriés⁹. Au cours des dernières années, de nombreux modèles d’essais de toxicité par inhalation non animale différents et adéquats (p. ex., cultures cellulaires in vitro, modèles de poumons sur puce, tranches de poumoncoupées de précision (PCLS)) ont été développés afin d’évaluer la toxicité par inhalation aigue des particules en suspension dans l’air^5,7,10,11. En ce qui concerne les modèles de culture cellulaire in vitro, les cellules cultivées peuvent être exposées dans des conditions immergées ou à l’ALI (Figure 1). Cependant, la validité des études d’exposition submergée est limitée en ce qui concerne l’évaluation de la toxicité des composés en suspension dans l’air, en particulier les particules. Les techniques d’exposition submergée ne correspondent pas à la situation in vivo humaine; le milieu de culture cellulaire couvrant les cellules peut affecter les propriétés physico-chimiques et donc, les propriétés toxiques d’une substance d’essai^12,13. Les modèles d’inhalation in vitro ALI permettent l’exposition directe des cellules aux substances d’essai sans interférence du milieu de culture cellulaire avec des particules d’essai, imitant ainsi l’exposition humaine avec une similitude physiologique et biologique plus élevée que les expositions submergées^12,14.

Pour les processus réglementaires tels que REACH, cependant, seuls les modèles animaux sont disponibles dans le domaine de la toxicologie par inhalation aigue, car aucune autre méthode in vitro n’a été suffisamment validée et officiellement acceptée jusqu’à présent¹⁴. À cette fin, les modèles d’essai doivent être validés conformément aux exigences du Laboratoire de référence de l’Union européenne pour les principes d’alternatives à l’expérimentation animale (EURL-ECVAM) sur la validité des tests¹⁵.

Une ancienne étude de pré-validation et une étude de validation récemment terminée ont démontré avec succès la zone d’application du système d’exposition À la RFS DELET et sa transférabilité, sa stabilité et sa reproductibilité¹³. Ce système d’exposition est un système d’exposition cellulaire in vitro qui permet une exposition homogène des cellules aux gaz, aux particules ou aux atmosphères complexes (p. ex. fumée de cigarette) à l’ALI en raison de son concept de distribution d’aérosols radiaux et de la conduction de l’aérosol d’essai dans un flux continu sur les cellules¹⁶. Le module de base de ce système d’écoulement radial se compose de l’adaptateur d’entrée, du module de guidage d’aérosol avec une distribution d’aérosols radiaux, du module d’échantillonnage et de prise, et d’un module de verrouillage avec une roue à main (Figure 2). Les particules générées atteignent les cellules par l’intermédiaire de l’adaptateur d’entrée et du module de guidage des aérosols et sont déposées sur les inserts de culture cellulaire, qui sont situés dans les trois chambres d’exposition radialement disposées du module d’échantillonnage. Le module de guidage des aérosols ainsi que le module d’échantillonnage peuvent être chauffés en se connectant à un bain d’eau externe¹⁷.

Dans le cadre des deux études, les cellules A549 ont été utilisées pour toutes les expériences d’exposition. La lignée cellulaire A549 est une lignée cellulaire épithéliale immortalisée par l’homme qui est très bien caractérisée et a été utilisée comme modèle in vitro pour les cellules épithéliales alvéoliennes de type II dans de nombreuses études toxicologiques. Les cellules sont caractérisées par des corps lamellar, la production de surfactant et un certain nombre de facteurs inflammation-pertinents¹⁸. Ils montrent également des propriétés des cellules épithéliales bronchiques en raison de leur production de mucus¹⁹. En outre, ils peuvent être cultivés à l’ALI. Bien que cette lignée cellulaire est déficiente dans la construction de contacts cellule-cellule, la culture de ces cellules est beaucoup plus pratique, moins coûteux et les résultats dérivés de celui-ci sont indépendants des donneurs par rapport aux cellules primaires²⁰.

Les cellules A549 ont été enseventées dans des inserts de culture cellulaire de 6 puits (membrane DE PET, 4,67 cm², taille de pore 0,4 mm) avec une densité de 3,0 x 10⁵ cellules par insert et cultivées pendant 24 h dans des conditions immergées. Les cellules ont ensuite été exposées dans trois laboratoires indépendants à l’air pur et à trois doses d’exposition différentes (25, 50 et 100 'g/cm²) de 20 substances d’essai à l’ALI. La dose d’exposition est corrélée au temps de dépôt, ce qui entraîne un taux de particules constants de 25 g/cm^2,50 g/cm² et 100 g/cm² sur les cellules après 15, 30 ou 60 min, respectivement. Les particules déposées, cependant, n’ont pas été lavées après dépôt, mais sont restées sur les cellules pendant 24 h. Les temps de dépôt des particules étaient donc de 15, 30 et 60 min, mais l’exposition des cellules a duré 24 h au total. Le taux de dépôt des substances d’essai a été déterminé dans des expériences préliminaires selon les méthodes précédentes¹⁷.

La viabilité cellulaire comme indicateur de toxicité a été évaluée 24 h après dépôt de particules à l’aide d’un exemple de viabilité cellulaire. Un accent particulier a été mis sur la qualité des contrôles de l’air pur, l’optimisation et le raffinement du protocole d’exposition, la reproductibilité intra- et inter-laboratoire et l’établissement d’un modèle de prévision (PM). Substances qui ont entraîné une diminution de la viabilité cellulaire en dessous de 50 % (PM 50 %) ou 75% (PM 75%) à l’une des trois doses d’exposition ont été considérées comme exerçant un risque aigu d’inhalation. Les résultats ont ensuite été comparés aux données in vivo existantes (basées sur au moins une étude fiable selon les lignes directrices des tests de l’OCDE (TG) 403 ou TG 436^21,22), conduisant à une concordance globale de 85%, avec une spécificité de 83% et une sensibilité de 88%²³.

Outre la mesure de la viabilité cellulaire, d’autres critères d’évaluation tels que la libération de cytokine, l’examen du lysate cellulaire ou l’intégrité de la membrane par l’analyse DeLH peuvent être évalués, mais n’ont pas été requis pour l’étude de validation. Ainsi, le système d’exposition (p. ex., LE RFS DE L’ESSAI DE CULTEX) a été prouvé comme un système de dépistage prédictif pour l’évaluation qualitative de la toxicité par inhalation aigue des particules testées dans l’air, ce qui représente une méthode alternative prometteuse à l’expérimentation animale. Le protocole suivant est recommandé pour les expériences d’exposition aux particules en suspension dans l’air à l’aide de ce système d’exposition.

Protocole

REMARQUE : Le protocole d’une expérience d’exposition couvre une période de trois jours.

Jour 1

1. Préparations générales et culture des cellules

REMARQUE : La ligne épithéliale d’adénocarcinome humain d’adénocarcinome A549 a été employée pour des expériences d’exposition. Les cellules doivent être manipulées dans des conditions stériles. D’autres lignées cellulaires qui conviennent à la culture à l’ALI peuvent être utilisées.

1. Préparer le milieu de croissance (le milieu essentiel minimum (DMEM) de Dulbecco, complété par 10 % de sérum bovin fœtal (SGF) et de 5 g/mL de gentamycine) et le milieu d’exposition (DMEM, complété par une gentamycine de 5 g/mL et une concentration finale de 100 mM de HEPES).
2. Culture Cellules A549 dans le milieu de croissance à 37 oC dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO₂.
3. Cultiver des cellules dans un flacon de culture cellulaire de 75 cm² (T-75) dans 14 ml de milieu de croissance jusqu’à une confluence de 80-90% avant de se diviser (tous les 2-3 jours) et un passage de 35.
4. Calculer le volume de suspension et le nombre requis d’inserts de culture cellulaire (trois inserts de culture cellulaire comme contrôle d’incubateur et insertions de culture cellulaire pour l’exposition à l’air pur et aux particules) et les plaques de culture cellulaire.
5. Avant la trypsinisation et l’ensemencement des cellules, ajouter 2,5 ml de milieu de croissance tempéré à chaque puits d’une plaque de 6 puits. Placez les inserts de culture cellulaire sans cellules soigneusement à l’intérieur des puits et ajoutez 1 ml de milieu de croissance à chaque insert de culture cellulaire. Incuber les plaques de 6 puits pendant au moins 30 min dans l’incubateur (37 oC, 5 % CO₂).

2. Trypsinisation des cellules

1. Tempère phosphate tamponné saline (PBS) et milieu de croissance à 37 oC et la trypsine/EDTA (0,05 %/ 0.02%) solution à température ambiante.
2. Aspirez le milieu de culture cellulaire du flacon de culture cellulaire et lavez soigneusement les cellules avec 8 ml de PBS préchauffé.
3. Retirez le PBS, ajoutez 2 ml de la trypsine/EDTA (0,05%/ 0.02%) solution aux cellules et incuber pendant 6 min maximum dans l’incubateur à 37 oC. Contrôler le processus de détachement au microscope.
4. Neutraliser l’activité de la trypsine en ajoutant 8 ml de milieu de croissance préchauffé, détacher les cellules en tapant doucement latéralement sur le flacon et resuspendre les cellules en faisant des pipes répétées de haut en bas.
5. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 50 ml. Déterminer le numéro de cellule pour la suite (p. ex., ensemencement des cellules, passage des cellules).

3. Détermination du numéro de cellule

REMARQUE : La concentration cellulaire a été déterminée à l’aide d’un compteur cellulaire ou de chambres de comptage.

1. Diluer 100 l de la suspension de culture cellulaire dans une tasse remplie de 10 ml de solution isotonique. Inclinez la tasse lentement sans trembler.
2. Déterminer le nombre de cellules/mL viables et la viabilité cellulaire en fonction des paramètres de mesure propres aux cellules des cellules A549.

4. Ensemencement des cellules sur des membranes microporeuses dans les inserts de culture cellulaire

REMARQUE : Le système d’exposition est équipé d’adaptateurs spéciaux pour permettre l’utilisation d’inserts commerciaux de différents fournisseurs et de différentes tailles. Pour ces expériences d’exposition, des plaques de 6 puits et les inserts de culture cellulaire correspondants ont été utilisés. Toutes les étapes de travail doivent être effectuées dans des conditions stériles.

1. Fournir un milieu de croissance préchauffé dans des conditions de culture cellulaire stérile (flux laminaire).
2. Préparer un volume suffisamment élevé de la suspension cellulaire avec une concentration cellulaire de 3,0 x 10⁵ cellules/mL.
3. Après avoir tempéré les plaques pendant 30 min, aspirer le milieu dans la culture cellulaire insère et graines 1 ml de cellules A549 avec une densité de 3,0 x 10⁵ cellules/mL dans chaque insert de culture cellulaire. Distribuez la suspension de la cellule par basculement doux.
4. Incuber les inserts de culture cellulaire avec la suspension cellulaire pendant 24 h (37 oC et 5 % CO₂).

5. Pressage des substances d’essai

REMARQUE : Les substances d’essai ont été pressées dans des gâteaux en poudre à l’aide d’une presse hydraulique entièrement contrôlable. Le paquet de presse peut appliquer une force maximale de 18 kN, qui est affichée comme la pression actuelle de l’huile (dans la barre) du paquet de presse. Les conditions de presse (pression pressante, temps de pressage) des substances d’essai inconnues doivent être établies et caractérisées dans les tests préliminaires. Selon les propriétés de presse d’une substance, différents paramètres pressants et différents types de piston pressant peuvent être utilisés.

CAUTION : Portez de l’équipement de protection lorsque vous pressez des substances toxiques ou dangereuses.

1. Définir le temps de pression via le contrôle du temps sur le côté avant de la presse.
2. Ouvrez l’alimentation en air comprimé à la soupape à air comprimé. Régler la pression d’air comprimé à environ 2 barres (indiquée par une jauge de pression sur le côté avant) à l’aide du régulateur de pression sur le côté avant de la presse ou sur la soupape d’air comprimé de l’alimentation en air comprimé. Sortez le tiroir, appuyez sur le bouton Appuyez sur et lisez la pression sur le commutateur de pression numérique.
   1. Lisez juste la pression au régulateur de pression si la pression est trop élevée ou trop basse.
3. Assemblage du récipient de substance et de s’assurer que le cylindre de verre est correctement centré (Figure supplémentaire 1). Remplir le contenant de substance avec une petite quantité de la substance d’essai. Insérez le piston dans le contenant de substance et tournez-le légèrement d’avant en arrière pour répartir uniformément la poudre dans le récipient.
4. Placez le contenant de substance avec le piston dans le tiroir et appuyez sur le bouton Appuyez sur. Le piston hydraulique de la presse se déplace sur le piston et exerce une pression sur la substance d’essai pour le temps de pressage ensemble. Ouvrez le tiroir et retirez le piston.
5. Répétez les étapes 5.3 et 5.4 jusqu’à ce que le contenant de substance soit au moins à moitié plein.
6. Après l’achèvement des travaux de pressage, retirer le contenant de substance du tiroir et le retourner à l’envers pour enlever les particules lâches et déposées.
7. Si le contenant de substance n’est pas nécessaire le même jour, fermez le contenant de substance avec le parafilm afin d’empêcher la substance d’essai de sécher ou d’absorber l’humidité.

Jour 2

6. Assemblage du système d’exposition et raccordement de l’équipement périphérique

REMARQUE : Une vue plus détaillée est fournie à la figure 3, à la figure 2 et à la figure 3 supplémentaire. Assembler les deux modules et le générateur d’aérosols selon les instructions du fabricant.

1. Placez le système d’exposition sur une surface solide et uniforme, avec l’approvisionnement en eau tourné vers l’avant. Connectez les contrôleurs de débit de masse avec le générateur d’aérosols et une bouteille à trois cous reliée au module pour une exposition à l’air pur.
2. Connectez le contrôleur de débit et la pompe à vide. Connectez les tubes des contrôleurs de débit avec le connecteur de tube sur les pièces jointes du module de guidage d’aérosol. Connectez les tubes de l’autre côté des contrôleurs de débit avec la pompe à vide. Assurez-vous que le flux va du module à travers les contrôleurs de flux à la pompe à vide.
3. Connectez le bain d’eau avec l’approvisionnement en eau de chauffage. L’approvisionnement en eau va du bain d’eau à l’inlet d’eau sur le module de guidage d’aérosol. Connectez la sortie d’eau du module de guidage des aérosols avec l’inlet d’eau du module d’échantillonnage. Fermez le cercle avec une connexion de la sortie d’eau du module d’échantillonnage au bain d’eau.
4. Placez le générateur d’aérosols, y compris l’elutriateur, près du module d’exposition et connectez les lignes excédentaires de l’élutriateur et le module d’exposition et d’air pur avec de grands microfiltres, et l’aspiration des chambres d’exposition avec de petits microfiltres (p. ex., filtres jetables). L’élutriateur sert de réservoir pour l’atmosphère de particules générées et retient les particules plus grandes que les environs 7 m, tandis que les particules plus petites sont transportées vers le module d’exposition.
5. Connectez l’ordinateur utilisé pour contrôler la génération d’aérosols au port USB du haut du générateur d’aérosols via un câble USB et l’alimentation électrique au port d’alimentation. Connectez la prise d’alimentation AC de l’unité d’alimentation à une prise (220-240 V).
6. Connectez les tuyaux pour l’alimentation moyenne et l’enlèvement avec deux pompes. Au lieu d’utiliser une pompe pour l’approvisionnement moyen, le milieu peut également être rempli manuellement.

7. Préparation à l’exposition à l’air pur et aux particules

1. Allumez la pompe à vide, les contrôleurs d’écoulement et le bain d’eau (37 oC) pendant une période d’échauffement d’au moins 30 min.
2. Ouvrez l’alimentation en air comprimé. Définir les contrôleurs de débit de masse à 8 L/min pour la ligne d’approvisionnement du générateur d’aérosols et à 3 L/min pour la ligne d’approvisionnement de la bouteille à trois cous. Fermez les onglets des contrôleurs de débit de masse.
   REMARQUE : Ces valeurs peuvent varier en fonction des caractéristiques de la substance d’essai.
3. Ajuster les contrôleurs de débit via l’ordinateur pour réguler le débit du module (1,5 L/min) et l’aspiration de la chambre (30 ml/min).

8. Test de fuite du système d’écoulement radial

REMARQUE : La vérification des fuites doit être effectuée sous vide et pour les deux modules (module d’exposition et d’air pur) afin de s’assurer que le module a été réassemblé correctement.

1. Retirez l’adaptateur d’inlet et le réflecteur de condensat du module de guidage des aérosols. Fermez les trois aérosols d’alimentation du module de guidage des aérosols avec des bouchons et les connexions d’approvisionnement moyen au module d’échantillonnage avec des volets factices.
2. Connectez les lignes de vide sans filtre avec le connecteur tube du module de guidage des aérosols. Fermez le module à l’aide de la roue à main et mesurez la valeur des contrôleurs de débit. Les valeurs devraient diminuer quelques minutes après la fermeture en dessous de 5 ml/min.
3. Après la vérification de l’imperméabilité, retirez tous les bouchons et les volets factices, insérez l’adaptateur d’entrée et le réflecteur de condensat dans le module de guidage d’aérosol et connectez les tuyaux pour l’approvisionnement moyen et l’enlèvement.

9. Génération d’aérosols

1. Démarrer l’ordinateur et le logiciel (Figure supplémentaire 4). Démarrez le logiciel de générateur d’aérosols en cliquant doublement sur le bouton de démarrage du générateur d’aérosols sur le bureau de l’ordinateur. Une fenêtre de message s’affiche et demande si les paramètres doivent être réinitialisés ou non. Cliquez oui si le logiciel est démarré pour la première fois ce jour-là. Définir les valeurs de la position de glissement et de la position de la raquette aux valeurs par défaut. Cliquez sur Non pour conserver les valeurs de la position de diapositive et de la position de la limite ou la diapositive n’est pas en position de départ.
2. Visser un grattoir de substance dans le tuyau, qui est situé dans l’ouverture centrale du dessus du générateur d’aérosols.
   REMARQUE : Selon les caractéristiques de la presse, des types distincts de grattoir sépeutur peuvent être utilisés.
3. Utilisez le bouton Mode Homing si le grattoir de substance n’est pas dans la position la plus basse.
4. Placez le contenant de substance avec le matériau d’essai pressé à l’envers sur le grattoir à substance. Assurez-vous que le verre du contenant de substance fait face à l’avant. Assurez-vous que les deux trous dans le contenant de substance s’adaptent sur les deux broches du dessus du générateur d’aérosols. Placez la plaque de verrouillage dans la fente sur le récipient de substance et serrez la vis noire.
5. Modifier les valeurs de l’alimentation (0,24 à 20 mm/h) et de la rotation (1 à 800 tours/h) aux paramètres souhaités. La concentration de particules peut être modifiée en augmentant ou en diminuant la valeur d’alimentation ou le débit de gaz porteur.
6. Utilisez les flèches vers le bas pour pousser vers le bas la glissière avec le contenant de substance jusqu’à ce que le grattoir de substance soit près de la substance pressée.
7. Ouvrez l’alimentation en air comprimé au générateur d’aérosols d’un robinet du contrôleur de débit de masse et démarrez la génération d’aérosols en cliquant sur le bouton Démarrer. Définir le taux d’alimentation à 15-20 mm/h pour éviter de longs temps d’attente.
8. Contrôlez la bonne génération de particules en observant le nuage de poussière fine avec une petite lampe de poche (positionnée par le bas derrière le tube de verre de l’Elutriator). Modifiez la valeur de Feed vers les réglages souhaités lorsque la première vapeur d’aérosol atteint en permanence l’elutriateur et cliquez sur le bouton Stop.

10. Expériences d’exposition

1. Démarrez l’approvisionnement moyen avec un milieu d’exposition préchauffé et remplissez les modules d’échantillonnage jusqu’à ce que les tuyaux d’abaissement soient couverts pendant l’ouverture du module. Utilisez la pompe moyenne ou remplissez le milieu manuellement (25 ml par chambre d’exposition individuelle).
2. Insérer des inserts de culture cellulaire aveugle (inserts sans cellules) dans le module d’exposition. Pomper le milieu d’exposition vers le bas jusqu’à ce que les tuyaux d’abaissement sont couverts avec le milieu et le côté inférieur des inserts sont en contact avec le milieu.
3. Démarrez le générateur d’aérosols, fermez le module d’exposition et connectez le module d’exposition à la sortie du module d’exposition du générateur d’aérosols. Donnez au générateur d’aérosols un délai d’au moins 20-30 minutes avant le début des expositions afin de permettre une génération stable de particules.
4. Préparer les plaques post-incubation pour les commandes de l’incubateur et les inserts de culture cellulaire exposée pendant la période de plomb. Ajouter 1,5 ml de milieu de croissance par puits et incuber les plaques dans l’incubateur (37 oC, 5 % CO₂).
5. Après le délai, scellez la sortie du module d’exposition de l’elutriator à l’avance à l’avance et retirez les inserts abat-jour. Remplissez le milieu d’exposition (à l’aide de la pompe ou manuellement) jusqu’à ce que les tuyaux d’abaissement soient recouverts de milieu. Maintenant, ouvrez également l’approvisionnement en air comprimé au module d’air pur avec le robinet du contrôleur de débit de masse (3 L/min)
6. Retirez les inserts de culture cellulaire des plaques de 6 puits à l’aide d’une pince à épiler. Verser soigneusement le milieu de croissance de la culture cellulaire s’insère en renversant les inserts et en aspirer et jeter le liquide résiduel à l’aide d’une pipette. Placez les inserts dans les chambres d’exposition des deux modules, le module d’exposition et d’air pur.
7. Fermez les modules et commencez les expériences d’exposition en connectant le module d’exposition à la sortie du module d’exposition du générateur d’aérosols et au module d’air pur à l’approvisionnement en gaz du transporteur simultanément.
   REMARQUE : La concentration de particules peut être modifiée en augmentant/diminuant la valeur d’alimentation, le débit de gaz porteur ou le moment de l’exposition.
8. Débranchez les modules d’exposition et d’air pur après la fin de l’expérience et scellez la sortie du module d’exposition.
9. Arrêtez l’alimentation en air comprimé et le générateur d’aérosols en cliquant sur le bouton Stop.
10. Ouvrez le module d’exposition et d’air pur et transférez les inserts de culture cellulaire sur les plaques préparées après l’incubation à l’aide d’une pince à épiler. Incuber les plaques de 6 puits pendant 24 h (37 oC, 5 % CO₂) à l’ALI.
    REMARQUE : Répétez les étapes 10.5 -10.10 si d’autres expériences d’exposition sont prévues.
11. Soulevez les inserts de culture cellulaire, qui sont utilisés comme contrôles d’incubateur à l’ALI dans les mêmes conditions que la culture cellulaire exposée insère et les incube pendant 24 h (37 oC, 5 % CO₂) à l’ALI.
12. Utilisez le bouton Mode Homing pour enlever le contenant de substance. Fermez le logiciel de générateur d’aérosols en cliquant sur le X dans le coin supérieur droit et éteignez l’ordinateur.
13. Après avoir terminé toutes les expériences d’exposition, nettoyez le générateur d’aérosols et les deux modules d’exposition. Fermer le contenant de substance avec du parafilm si la substance d’essai sera encore utilisée dans les prochains jours.

Jour 3

11. Viabilité cellulaire

REMARQUE : La viabilité cellulaire a été déterminée 24 h après dépôt de particule en mesurant l’activité mitochondriale en utilisant l’analyse WST-1. L’assay a été effectué selon le protocole du fabricant. La viabilité des cellules peut également être déterminée en utilisant d’autres tests de viabilité cellulaire (p. ex., XTT).

1. Tempérer le milieu de croissance à 37 oC et décongeler la solution WST-1 protégée de la lumière. Préparer un nombre approprié de nouvelles plaques de 6 puits avec un milieu de croissance de 2,5 ml par puits et incuber les plaques dans l’incubateur.
2. Préparer la dilution Du TSM-1 en diluant une quantité suffisante de WST-1 1:7 dans le milieu de croissance
3. Insérer la culture cellulaire insère 24 h après l’exposition dans les nouvelles plaques préparées 6 puits. Ajoutez 1 ml de la solution WST-1 fraîchement préparée à chaque insert de culture cellulaire. Basculer soigneusement les plaques afin de répartir la solution de façon homogène sur les cellules. Incuber les plaques de 6 puits avec les inserts de culture cellulaire pendant 1 h (37 oC, 5 % CO₂).
4. Transférer 100 l du supernatant dans des tripliciats de chaque 6 puits à une assiette de 96 puits. Mesurer l’absorption à 450 nm avec une longueur d’onde de référence de 650 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques.

12. Statistiques

1. Normaliser la viabilité cellulaire des contrôles individuels de l’incubateur à 100%.
2. Exprimez la viabilité des cellules exposées par rapport aux contrôles individuels de l’incubateur. La cytotoxicité des substances d’essai a été comparée aux contrôles respectifs d’incubateur et utilisée comme indicateur de toxicité.

Résultats

Le CULTEX RFS est un système d’exposition in vitro modulaire spécialement conçu qui permet l’exposition directe et homogène des cellules de l’ALI. Dans le cadre d’une ancienne étude de pré-validation, l’applicabilité générale de ce système d’exposition et sa transférabilité, sa stabilité et sa reproductibilité ont été démontrées avec succès. Dans le cadre d’un récent projet de recherche financé par le Ministère fédéral allemand de l’éducation et de...

Discussion

De nombreux modèles d’essais de toxicité par inhalation non animale ont été développés ces dernières années afin d’obtenir des informations sur le risque aigu d’inhalation de particules inhalables et de réduire et de remplacer les expériences animales selon le principe 3R²⁵.

En termes de modèles de culture cellulaire, l’exposition des cellules peut se faire dans des conditions immergées ou à l’ALI. L’exposition des cellules dans des conditions i...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells
A549	ATCC	CCL-185
Cell culture medium and supplies
DMEM	Biochrom, Berlin, Germany	FG 0415	used as growth medium
DMEM	Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany	22320	used as exposure medium
FBS superior	Biochrom, Berlin, Germany	S 0615
Gentamycin (10mg/mL)	Biochrom, Berlin, Germany	A 2710
HEPES 1M	Th. Geyer, Renningen, Germany	L 0180
PBS	Biochrom, Berlin, Germany	L 1825
Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%)	Biochrom, Berlin, Germany	L 2143
Cell culture material
CASY Cups	Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany	REF 05651794
Cell culture plates	Corning, Wiesbaden, Germany	3516	6­-well plates
Corning Transwell cell culture inserts	Corning, Wiesbaden, Germany	3450	24mm inserts; 6-­well plates; 0.4 µm
Chemicals
CASYton	Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany	REF 05651808001
Compressed Air (DIN EN 12021)	Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschleißheim, Germany	2290152
WST-1	Abcam, Cambridge, United Kingdom	ab155902
Instruments + equipment
CASY Cell Counter	Schärfe System GmbH, Reutlingen, Germany
Circulation thermostat	LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany	Ecoline RE 100
CULTEX HyP - Hydraulic Press	Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX insert sleeve	Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for particle exposure)	Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for clean air exposure)	Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX supply
Flow controller 0-30 ml/min (IQ-Flow)	Bronkhorst Deutschland Nord GmbH
Flow controller 0-1,5 l/min (EL-Flow)	Bronkhorst Deutschland Nord GmbH
Filters (large)	Munktell & Filtrak GmbH, Sachsen, Germany	LP-050	Munktell Sterile Filter; Particle retention efficiency > 99,999%
Filters (small)	Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany	9933-05-DQ	Balston disposable filter
Medium pump	Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany	Ismatec IPC High Precision Multichannel Dispenser	digital peristaltic pump
Microplate Reader Infinite M200 Pro	Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany
Vakuum pump	KNF, Freiburg, Germany	N86 KT.18
Vögtlin mass flow controller 0,2-10 l/min	TrigasFI GmbH	Vögtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20
Water Bath	LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany	Ecoline Staredition RE 104