活体和功能性鼠耳蜗毛细胞中的德特贴标签和吸收

摘要

在这里，我们提出了一种方法，用于可视化3 kDa德州红标dextran在听觉毛细胞与功能性干扰诱导通道的吸收。此外，3~10 kDa的分泌器可用于研究毛发和Corti器官支持细胞的内分泌。

摘要

发细胞调子（MET）通道在听力中起着重要的作用。然而，MET的分子特性和结构信息仍然未知。对毛细胞的电生理学研究表明，MET通道具有较大的导导率，可渗透到相对较大的荧光阳离子分子，包括一些styryl染料和德州红标氨基糖苷抗生素。在此协议中，我们描述了一种可视化和评估 Corti 外植器官毛细胞中荧光分管的产生情况的方法，该方法可用于功能 MET 通道的测定。我们发现，3 kDa德州红标记dextran特别标记功能听觉毛细胞后1⁄2小时孵育。特别是，3 kDa dextran 标记两个较短的立体细胞行，并在存在功能 MET 通道时以漫反射模式在细胞体中累积。在毛细胞和周围支持细胞的细胞体中观察到了一种类似囊泡的标记模式。我们的数据表明，3 kDa德州红dextran可用于可视化和研究细胞染料摄入的两种途径;通过功能MET通道和内分泌的毛细胞特定进入途径，这种模式也可用于更大的dextran。

引言

内耳毛细胞是检测声音和隐藏电信号机械刺激的感官细胞，最终由我们的大脑解释。这些细胞有一个楼梯形的捆绑三行基于活性蛋白的细丝，称为立体丝，从它们的锥形区域^1，2突出。机械刺激使立体丝向最长的行偏转，并触发机械转导（MET）通道³的打开。MET通道的开放导致阳离子的涌入，使细胞去极化，从而在头发细胞的基础区域发出突触囊泡的释放。

MET通道对听力至关重要的生物物理特性得到了广泛的描述。在其他属性中，这些通道是阳离子选择性的，具有相对较大的电导率（低 Ca²⁺中为 150±300 pS）4、5、6、7、8、9、10 。值得注意的是，大型荧光分子，如FM1-43和得克萨斯红标记氨胶苷是MET通道的渗透阻滞剂，导致其积累在头发细胞体，可以使用荧光显微镜11，12，13，14。相反，MET通道的分子特性和结构及其渗透途径仍然难以捉摸。越来越多的实验证据表明，跨膜样通道蛋白1（TMC1）是成熟毛细胞^{15、16、17、18、19}中MET通道的组成部分。跨膜状通道1（TMC1）中的突变会改变MET通道特性^{19、20、21、22，}并引起耳聋。此外，TMC1还本地化到MET通道^18、23的站点，并与负责将机械力传输到MET通道^24、25的尖端链路进行交互。此外，最近的生物信息学分析已经发现TMC蛋白是进化相关的对美甲敏感通道TMEM63/OSCA蛋白质和TMEM16蛋白质，钙活性氯化物通道和脂质scramblass26，27，28。基于这些蛋白质之间关系的TMC1结构模型揭示了在蛋白质-脂质界面²⁷处存在一个大腔。该腔包含两个TMC1突变，导致常染色体显性听力损失（DFNA36）27、29、30、31、32，以及选择性地修饰半胱氨酸突变体，使其在腔内残留物改变MET通道特性^28，表明它可以作为MET通道的渗透通路。TMC蛋白质中这种预测腔的较大尺寸可以解释大分子渗透MET通道的能力。为了测试MET通道包含异常大渗透通路的预测，并突破TMC1中观察到的腔体大小的极限，我们开发了一个协议，在Corti外植的器官中用更大的分子进行吸收实验，3 kDa dextran荧光标记为德州红。

Dextran是一种复杂的分枝多糖，由许多D-葡萄糖分子组成，由α-1，6糖碱基结结合。其高溶性在水中，低细胞毒性，和生物不性使其成为研究多种细胞过程的多功能工具。此外，dextran 有多种尺寸可供选择，并带有多种颜色的荧光标记。荧光标记的dextrans通常用于细胞和组织渗透性研究^33，34，研究多细胞系统^35，36的内分泌，以及神经追踪^37，38。在听觉领域，dextran分子也被用来评估细胞-细胞结的中断和听觉感觉上皮完整性的丧失后暴露于Corti^39，40的chinchilla器官的强烈噪音。

在这项工作中，我们利用一些最小的（3和10 kDa）荧光除变性器的特性，在鼠内耳毛细胞中进行吸收实验，并探索内耳毛细胞MET通道的渗透通路的大小。此外，我们使用激光扫描共聚焦显微镜（LSM）880配备了Airyscan探测器，以可视化和本地化荧光dextran在立体神经和听觉毛细胞的细胞体。

研究方案

动物护理和实验程序按照《实验室动物护理和使用指南》进行，该准则经国家神经疾病和中风研究所动物护理和使用委员会批准（动物协议#1336到KJS）。

1. 老鼠

1. 设置一对C57BL/6J野生型的繁殖对在动物设施中繁殖，以控制幼崽的出生日期，并跟踪幼崽的年龄。

2. 耳蜗解剖

1. 设置一个靠近立体显微镜的清洁空间以执行解剖（图1A）。使用 70% 乙醇清洁空间和周围环境，并放置干净的台垫。需要医疗病理废物（MPW）塑料袋才能丢弃动物尸体。
2. 准备几个35毫米的菜肴与一些莱博维茨的L15介质。
   注:莱博维茨的L-15细胞介质含有1⁄2 mM Ca^2+，这是保持尖端链接完整性所必需的，并含有必需氨基酸、维生素和丙酸钠，以改善细胞健康和生存。血清被排除，以避免实验变异，由于其定义不良的成分和潜在的干扰dextran。
3. 通过斩首使产后6天6（P6）小鼠安乐死。
   注:6天大的小鼠对吸入麻醉剂有一定的抵抗力。虽然共和胶或长时间的_CO2暴露（长达50分钟）可用于安乐死，但建议采用辅助物理方法确保死亡。
4. 使用手术剪刀，通过从前到后端和穿过外部听觉管的浅切去除头骨的皮肤。
5. 将皮肤折叠到鼻子上，露出颅骨（图2B）。
6. 从头骨背面到头骨前部，穿过眼线切口（图2B-C）。
7. 将头骨分成两半，用小铲子去除大脑（图2C-D）。
8. 用小剪刀，切周围的时间骨骼，并切除组织。
9. 将两个临时骨骼放入 35 mm 的培养皿中，并确保它们被 L15 介质覆盖（图 2E）。
   注:以下步骤在立体显微镜下执行。黑色背景通常有助于在精细解剖步骤期间可视化组织。
10. 在配备宽场目镜（10倍放大功率（WF10X）和外部交流电（AC）卤素光源）的立体显微镜下，用手术钳切除周围的耳蜗组织、半圆形管道和前庭器官（图2F）。
11. 为了让 dextran 和 L15 介质进入耳蜗管，请在解剖的耳蜗上执行两个穿刺边界，一个在圆窗上，另一个在耳蜗区域。
12. 从 9 孔玻璃凹陷板中在每个孔中加入 300 mL 的 Leibovitz L15 介质。
13. 在每个井上至少放置三个解剖的耳蜗。

3. 德特森标签

1. 在汉克斯的平衡盐溶液中重组dextran，无Ca²⁺和Mg 2+（HBSS-CFM），最终浓度为10mg/mL。此库存溶液必须在不透明的黑色管中加报价（防止光线照射），并储存在 -30°C 下，直到使用。
   注: 使用可莱辛可修复的dextran对于该协议的成功结果至关重要。
2. 在莱博维茨的L15介质的500 mL中，以2mg/mL的最终浓度制备每个dextran。
3. 从耳蜗中取出介质，并添加莱博维茨的L15介质，该介质含有2mg/mL的最终浓度， 含有感兴趣的dextran。
   注:虽然一定比例的MET通道在休息时打开^41，42，但dextran孵育是在对外植物轻轻摇动后进行的，以增加MET通道的开放概率。
4. 使用倾斜角度为 25°的三维摇床，在室温下孵育 2 小时，轻轻摇动（25 rpm）。
   注: 在可能的情况下，必须保护标有荧光标记的 dextran 免受光线照射。为了保护在2小时孵育期间，将9孔玻璃板放入用铝箔包裹的细胞培养P150盘中。

4. 成像样品制备

1. 使用 dextran 孵育后，用介质洗涤组织 2 分钟两次，用 HBSS 洗涤一次。
2. 在室温下用4%的甲醛在汉克斯的平衡盐溶液（HBSS）中孵育组织30分钟。
   注意:接触甲醛会刺激眼睛、鼻子和上呼吸道。在某些个体中，皮肤反复接触甲醛会导致过敏性皮肤炎。甲醛是已知的人类致癌物质，是一种疑似生殖危害。
3. 用HBSS快速轻轻清洗固定组织两次，以去除甲醛。
   注:在耳蜗的这个发育阶段，不需要对骨骼进行去化。
4. 去除螺旋韧带和细尖钳膜，以解剖Corti的器官（图2G）。
5. 取出所有小块组织，用哈佛商学院清洗组织。
6. 在 PBS 中渗透 0.5% Triton X-100 中的组织，其中含有荧光标记的 phalloidin（在分别测试 TR-或 FITC 标记的 dextran 时与绿色或红色结合），在 1:200 稀释 30 分钟，以标记 F-actin 并可视化基于功能的立体性。
7. 用HBSS缓冲液每次清洗组织2~3次2分钟，去除三吨和噬菌体素的过量，用PBS去除盐。
8. 将 Corti 组织的器官安装在显微镜幻灯片上，并用安装介质覆盖它。
   注:安装组织时，确保包含发细胞立体膜的组织侧朝向盖玻片。
9. 清除在添加安装介质过程中产生的任何潜在气泡，并防止在盖玻片放置过程中产生新的气泡。
   注:在添加安装介质期间产生任何气泡，用移液器吸气。为防止气泡卡在盖玻片下，请将盖玻片的边缘靠近样品，并使用钳子或移液器尖端小心并缓慢地将盖玻片降至组织上。
10. 用玻璃盖玻片盖住安装介质中的组织 （图 2H）。
    注: 数值孔径高于 0.4 的孔径设计用于使用 #1.5 盖玻片（0.17 mm 厚度）。使用错误的盖玻片可能会对图像的强度和质量产生严重影响。
11. 在室温下孵育安装组织过夜，让安装介质干燥，并将幻灯片储存在 4°C，直到成像。

5. 图像采集和图像处理

注:共聚焦图像采用LSM 880共聚焦显微镜，在超分辨率（SR）模式⁴³和63倍物镜中配备32通道Airyscan探测器。

1. 在目标上加入一小滴浸入油。
2. 将装有安装的组织样品的显微镜滑块放在显微镜阶段，玻璃盖玻片面向浸入油。
3. 关注示例并使用图像采集软件设置成像参数。
4. 为每个独立实验使用相同的图像采集设置和最佳参数，用于 x、y 和 z 分辨率。在获取 z 堆栈图像时，需要压电驱动对焦系统快速、精确地移动目标。
   注: 要对毛细胞的整个杏子区域进行成像，请使用最佳设置从立体细胞体到头发细胞体的半张图像收集 z 堆栈图像。沿毛细胞收集一个大的 z 堆栈以确保囊泡状颗粒的成像至关重要。
5. 使用图像采集软件使用 Airyscan 3D 重建算法使用自动默认反卷积滤波器设置来处理原始共聚焦图像。
6. 在图像处理软件中打开共聚焦图像以调整亮度和对比度，添加比例尺，并导出最终图形的图像。

结果

我们观察到，在野生型产后6（P6）小鼠的Corti外体器官孵育2小时后，毛细胞的强健和特殊标记，3 kDa dextran荧光标记有德州红（dextran-TR）（图2A-B）。在Corti器官的基底、中、顶区域（图2B）的内侧和外发细胞（IHC和OHC）中观察到了Dextran标记。

荧光标记的phalloidin用于对抗丝状物（F-actin）和可视化基于功能素...

讨论

该协议描述了如何在3 kDa dextran德州红的Corti外植植物的鼠器官中执行接受实验。这种方法的目的是测试之前测试的分子是否也能够专门标记听觉毛细胞，并渗透到MET通道。类似的实验方案以前曾用于评估毛细胞与其他荧光染料的渗透性，如FM1-43（0.56 kDa）12、19、20和得克萨斯州红标记的氨糖苷（1.29~1.43 kDa）13、52。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 glass coverslips 18mm	Warner Instruments	64-0714
Alexa Fluor 488 Phalloidin	ThermoFisher	A12379
Alexa Fluor 594 Phalloidin	ThermoFisher	A12381
alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective	Carl Zeiss	420780-9970-000
Amiloride hydrochloride	EMD MILLIPORE	129876
Benchwaver 3-dimensional Rocker	Benchmarks scientific	B3D5000
C57BL/6J wild-type mice	strain 000664	The Jackson Laboratory
Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt	ThermoFisher	B1204
Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable	ThermoFisher	D1820
Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable	ThermoFisher	D1863
Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable	ThermoFisher	D3328
Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade	Electron microscopy science	15710
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red	ThermoFisher	14025
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red	ThermoFisher	14170
Image J or FIJI	NIH	http://fiji.sc/
Immersol 518F oil immersion media	Carl Zeiss	444970-9000-000
Leibovitz's L-15 Medium, GlutaMAX Supplement	ThermoFisher	31415029
neomycin trisulfate salt hydrate	Sigma	N6386
PBS (10X), pH 7.4	ThermoFisher	70011069
Phalloidin-CF405M	Biotium	00034
ProLong Diamond antifade mounting media	ThermoFisher	P36970
superfrost plus microscope slide	Fisherbrand	22-037-246
Triton X-100	Sigma	T8787
Zen Black 2.3 SP1 software	Carl Zeiss	https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html