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  • Déclarations de divulgation
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Résumé

Ici, nous présentons une méthode pour visualiser l’apaisement de 3 kDa Texas Red-labeled dextran dans les cellules ciliées auditives avec des canaux fonctionnels de mécannotransduction. En outre, dextrans de 3 à 10 kDa peuvent être utilisés pour étudier l’endocytose dans les cheveux et les cellules de soutien de l’organe de Corti.

Résumé

Le canal de mécanotransduction de cellules capillaires (MET) joue un rôle important dans l’audition. Cependant, l’identité moléculaire et les informations structurelles du MET restent inconnues. Les études électrophysiologiques des cellules ciliées ont indiqué que le canal de MET a une grande conductance et est perméable aux molécules cationic fluorescentes relativement grandes, y compris quelques colorants de styryl et antibiotiques d’aminoglycoside Red-étiquetés du Texas. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode pour visualiser et évaluer l’utilisation du dextrans fluorescent dans les cellules ciliées de l’organe des explants de Corti qui peuvent être utilisés pour évaluer les canaux MET fonctionnels. Nous avons constaté que 3 kDa Texas Red-labeled dextran étiquette spécifiquement les cellules ciliées auditives fonctionnelles après l’incubation de 1/2 h. En particulier, 3 kDa dextran étiquette les deux lignes stéréocilia plus courtes et s’accumule dans le corps cellulaire dans un modèle diffus lorsque les canaux MET fonctionnels sont présents. Un modèle supplémentaire de vésicule-comme de l’étiquetage a été observé dans le corps cellulaire des cellules ciliées et des cellules de soutien environnantes. Nos données suggèrent que le dextran Texas-Rouge de 3 kDa puisse être employé pour visualiser et étudier deux voies pour l’utilisation cellulaire de colorant ; une voie d’entrée spécifique aux cellules capillaires à travers les canaux MET fonctionnels et l’endocytose, un modèle également disponible pour les plus grands dextran.

Introduction

Les cellules ciliées de l’oreille interne sont les cellules sensorielles qui détectent le son et les stimuli mécaniquement dans les signaux électriques, qui sont finalement interprétés par notre cerveau. Ces cellules ont un faisceau en forme d’escalier de trois rangées de filaments à base d’actine, connus sous le nom de stéréocilia, qui dépassent de leur région apaïque1,2. Les stimuli mécaniques détournent les filaments stéréociliens vers la plus longue rangée et déclenchent l’ouverture des canaux de mécanotransduction (MET)3. L’ouverture des canaux MET conduit à un afflux de cations qui dépolarise la cellule et signale par conséquent la libération de vésicules synapses à la région basale de la cellule capillaire.

Les propriétés biophysiques du canal MET essentielles à l’audition ont été largement caractérisées. Entre autres propriétés, ces canaux sont cationic sélective et ont une conductance relativement grande (150-300 pS en basse Ca2)4,5,6,7,8,9,10. Remarquablement, de grandes molécules fluorescentes telles que FM1-43 et les aminoglycosides à étiquette rouge du Texas sont des bloqueurs perméats du canal MET, ce qui entraîne leur accumulation dans le corps des cellules capillaires qui peuvent être visualisées à l’aide de la microscopie de fluorescence11,12,13,14. Inversement, l’identité moléculaire et la structure du canal MET et sa voie de perméation sont restées insaisissables. De plus en plus de preuves expérimentales indiquent que la protéine de canal transmembrane-like 1 (TMC1) est un composant du canal MET dans les cellules ciliées matures15,16,17,18,19. Les mutations dans le canal transmembrane-comme 1 (TMC1) modifient les propriétés de canal DE MET19,20,21,22 et causent la surdité. En outre, TMC1 localise le site du canal MET18,23 et interagit avec le lien de pointe responsable de la transmission de la force mécanique au canal MET24,25. En outre, l’analyse bioinformatique récente a identifié les protéines TMC comme évolutives liées aux canaux mécanosensibles TMEM63/OSCA protéines et les protéines TMEM16, une famille de canaux de chlorure activés par le calcium et brouillages lipidiques26,27,28. Un modèle structurel de TMC1 basé sur la relation entre ces protéines a révélé la présence d’une grande cavité à l’interface protéine-lipide27. Cette cavité abrite les deux mutations TMC1 qui causent la perte auditive dominante autosomique (DFNA36)27,29,30,31,32, et la modification sélective des mutants de cystéine pour les résidus dans la cavité modifient les propriétés du canal MET28, indiquant qu’il pourrait fonctionner comme la voie de perméation du canal MET. La grande taille de cette cavité prévue dans les protéines TMC pourrait expliquer la capacité des grosses molécules à imprégner le canal MET. Pour tester la prédiction que le canal MET contient une voie de perméation exceptionnellement grande et pour repousser les limites de la taille de la cavité observée dans TMC1, nous avons développé un protocole pour effectuer des expériences d’adoption dans l’organe des explants de Corti avec une molécule plus grande, 3 kDa dextran fluorescente étiquetée avec Texas Red.

Dextran est un polysaccharide ramifié complexe composé de nombreuses molécules de D-glucose liées par des liaisons alpha-1,6 glycosidiques. Sa solubilité élevée dans l’eau, sa faible toxicité cellulaire et sa bioinerité en font un outil polyvalent pour étudier plusieurs processus cellulaires. En outre, dextran est disponible dans un large éventail de tailles et fluorescente étiqueté avec des fluorophores de plusieurs couleurs. Les dextrans étiquetés fluorescents sont couramment utilisés dans la recherche sur la perméabilité des cellules et des tissus33,34, pour étudier l’endocytose dans plusieurs systèmes cellulaires35,36, et pour le traçage neuronal37,38. Dans le domaine auditif, des molécules de dextran ont également été utilisées pour évaluer la perturbation de la jonction cellule-cellule et la perte de l’intégrité auditive de l’épithélium sensoriel après l’exposition à un bruit intense dans l’organe chinchilla de Corti39,40.

Dans ce travail, nous avons exploité les propriétés de certains des plus petits (3 et 10 kDa) dextrans fluorescents pour effectuer des expériences d’uptake dans les cellules ciliées de l’oreille interne murine et d’explorer la taille de la voie de perméation de la cellule capillaire de l’oreille interne MET canal. En outre, nous avons utilisé un microscope confocal à balayage laser (LSM) 880 équipé d’un détecteur Airyscan pour visualiser et localiser le dextran fluorescent à la stéréocilie et au corps cellulaire des cellules ciliées auditives.

Protocole

Les soins aux animaux et les procédures expérimentales ont été effectués conformément aux lignes directrices pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire, qui ont été approuvées par le Comité des soins et de l’utilisation des animaux de l’Institut national des troubles neurologiques et des accidents vasculaires cérébraux (protocole animal #1336 à KJS).

1. Souris

  1. Établiz un couple de couples reproducteurs de type sauvage C57BL/6J pour qu’ils se reproduisent dans l’établissement animalier afin de contrôler la date de naissance des portées et de suivre l’âge des chiots.

2. Dissection de Cochleae

  1. Définir un espace propre près d’un stéréomicroscope pour effectuer les dissections (Figure 1A). Utilisez 70% d’éthanol pour nettoyer l’espace et les environs et placez un banc propre. Un sac en plastique de déchets pathologiques médicaux (MPW) serait nécessaire pour jeter les carcasses d’animaux.
  2. Préparez plusieurs plats de 35 mm avec quelques supports L15 de Leibovitz.
    REMARQUE : Le support cellulaire L-15 de Leibovitz contient 1 à 2 mM Ca2,qui est nécessaire pour maintenir l’intégrité des pointes et contient des acides aminés essentiels, des vitamines et du pyruvate de sodium pour améliorer la santé et la survie des cellules. Le sérum a été exclu pour éviter la variabilité expérimentale en raison de sa composition mal définie et de l’interférence potentielle avec le dextran.
  3. Euthanasiez les souris postnatales-jour-6 (P6) par décapitation.
    REMARQUE : Les souris de 6 jours sont quelque peu résistantes aux anesthésiques inhalants. Bien que des expositions prolongées à l’isoflurane ou au CO2 (jusqu’à 50 min) puissent être utilisées pour l’euthanasie, une méthode physique secondaire est recommandée pour assurer la mort.
  4. Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour enlever la peau du crâne en faisant une coupe superficielle de l’antérieur à l’extrémité postérieure et à travers les canaux auditifs externes.
  5. Pliez la peau vers le nez pour exposer le crâne (Figure 2B).
  6. Faire une incision de l’arrière à l’avant du crâne et à travers la ligne des yeux (Figure 2B-C).
  7. Séparer le crâne en deux moitiés et enlever le cerveau à l’utilisation d’une petite spatule pour exposer les os temporels (Figure 2C-D).
  8. Avec de petits ciseaux, couper autour des os temporels, et d’exciser le tissu.
  9. Placez les deux os temporels dans un plat de 35 mm et assurez-vous qu’ils sont recouverts de supports L15 (figure 2E).
    REMARQUE : Les étapes suivantes sont effectuées sous le stéréomicroscope. Un fond noir aide habituellement à visualiser le tissu pendant les étapes fines de dissection.
  10. Sous un stéréomicroscope équipé d’un oculaire à champ large (une puissance de grossissement de 10X (WF10X) et d’une source de lumière halogène externe à courant alternatif (AC), retirez le tissu cochlée environnant, les canaux semi-circulaires et les organes vestibulaires avec forceps chirurgicaux (Figure 2F).
  11. Pour permettre aux supports dextran et L15 d’entrer dans le conduit cochléaire, effectuer deux limites de perforation sur les cochlées disséquées, l’une sur la fenêtre ronde et l’autre à la région cochléaire acétique.
  12. Ajoutez 300 ml de la lune de Leibovitz dans chaque puits à partir d’une plaque de dépression en verre de 9 puits.
  13. Placer au moins trois cochlées disséquées sur chaque puits.

3. Étiquetage Dextran

  1. Reconstituer le dextran dans la solution de sel équilibrée de Hanks sans Ca2 et Mg 2 (HBSS-CFM) à une concentration finale de 10 mg/mL. Cette solution de stock doit être aliquoted dans des tubes noirs opaques (protégés de la lumière) et stocké à -30 oC jusqu’à l’utilisation.
    REMARQUE : L’utilisation du dextran lysine-fixable est critique pour un résultat réussi de ce protocole.
  2. Préparer chaque dextran à une concentration finale de 2 mg/ml dans 500 ml de la légiabide de Leibovitz.
  3. Retirez le support de la cochlée et ajoutez le support L15 de Leibovitz contenant le dextran d’intérêt à une concentration finale de 2 mg/mL.
    REMARQUE: Bien qu’une proportion des canaux MET soient ouverts au repos41,42, l’incubation dextran a été effectuée avec une douce secousse des explants pour augmenter la probabilité ouverte du canal MET.
  4. Incuber à température ambiante pendant 2 h en secouant doucement (25 tr/min) à l’aide d’un shaker tridimensionnel avec un angle incliné de 25 degrés.
    REMARQUE : Le dextran étiqueté fluorescent doit être protégé de la lumière lorsque c’est possible. Pour protéger le dextran pendant l’incubation de 2 h, placez la plaque de verre de 9 puits à l’intérieur d’un plat P150 de culture cellulaire enveloppé dans du papier d’aluminium.

4. Préparation d’échantillons pour l’imagerie

  1. Après l’incubation avec le dextran, laver le tissu pendant 2 min deux fois avec le support et une fois avec HBSS.
  2. Incuber le tissu à température ambiante pendant 30 min avec 4% de paraformaldéhyde dans la solution de sel équilibrée de Hanks (HBSS).
    CAUTION : L’exposition au formaldéhyde peut être irritante pour les yeux, le nez et les voies respiratoires supérieures. Chez certaines personnes, l’exposition répétée de la peau au formaldéhyde peut provoquer une sensibilisation qui peut entraîner une dermatite allergique. Le formaldéhyde est un cancérogène connu pour l’homme et un risque reproducteur suspecté.
  3. Lavez rapidement et doucement le tissu fixe deux fois avec HBSS pour enlever le paraformaldéhyde.
    REMARQUE : La décalcification des os temporels n’est pas nécessaire à ce stade développemental de la cochlée.
  4. Enlever le ligament spiralé et la membrane tectoriale avec des forceps fins pour disséquer l’organe de Corti (Figure 2G).
  5. Enlever tous les petits morceaux de tissu et laver le tissu avec HBSS.
  6. Perméabilize le tissu dans 0,5% Triton X-100 dans PBS contenant de la phalloidin fluorescente (conjugué au vert ou rouge lors de l’essai de l’upper de TR- ou FITC étiqueté dextran, respectivement) à une dilution de 1:200 pendant 30 min pour étiqueter F-actin et visualiser le stéréocilia basée sur l’actine.
  7. Laver le tissu 2 à 3 fois pendant 2 minutes à chaque fois avec le tampon HBSS pour enlever l’excès de triton et de phalloidin, et une fois avec PBS pour enlever les sels.
  8. Montez l’organe des tissus de Corti sur une lame de microscope et couvrez-le de supports de montage.
    REMARQUE: Lors du montage du tissu, assurez-vous que le côté du tissu contenant la stéréocilie des cellules capillaires est face à la couverture.
  9. Enlevez toutes les bulles potentielles générées lors de l’ajout du support de montage et empêchez la génération de nouvelles bulles pendant le placement du coverslip.
    REMARQUE: Aspirez avec une pipette toute bulle générée lors de l’ajout du support de montage. Pour éviter que les bulles d’air ne soient emprisonnées sous le borderet, placez un bord de la glissière près de l’échantillon et abaissez soigneusement et lentement la glissière de couverture sur le tissu à l’aide de forceps ou d’une pointe de pipette.
  10. Couvrir le tissu dans les supports de montage avec un couvercle en verre (Figure 2H).
    REMARQUE : Les objectifs avec une ouverture numérique supérieure à 0,4 sont conçus pour utiliser #1,5 couvertures (0,17 mm d’épaisseur). L’utilisation d’un faux bordereau peut avoir de graves répercussions sur l’intensité et la qualité des images.
  11. Incuber le tissu monté pendant la nuit à température ambiante pour laisser sécher le support de montage et ranger les lames à 4 oC jusqu’à l’imagerie.

5. Acquisition d’images et traitement d’image

REMARQUE : Les images confocales ont été prises avec un microscope confocal LSM 880 équipé d’un détecteur Airyscan de 32 canaux dans le mode43 de super-résolution (SR) et d’un objectif 63x.

  1. Ajouter une petite goutte d’huile d’immersion sur l’objectif.
  2. Placez la lame de microscope contenant l’échantillon de tissu monté dans l’étape du microscope avec la couverture en verre face à l’huile d’immersion.
  3. Concentrez-vous sur l’échantillon et définiz les paramètres d’imagerie à l’aide du logiciel d’acquisition d’images.
  4. Utilisez des paramètres d’acquisition d’images identiques et des paramètres optimaux pour la résolution x, y et z pour chaque expérience indépendante. Un système de mise au point axé sur le piezo est nécessaire pour déplacer rapidement et précisément l’objectif lors de l’acquisition de la z-pile d’images.
    REMARQUE: Pour l’image de toute la région apical des cellules ciliées, recueillir une z-pile d’images de la stéréocilie à la moitié apanique du corps des cellules capillaires en utilisant les paramètres optimaux. Il est crucial de recueillir une grande z-pile le long de la cellule capillaire pour assurer l’imagerie des particules de la vésicule.
  5. Utilisez le logiciel d’acquisition d’images pour traiter les images brutes confocales à l’aide de l’algorithme de reconstruction 3D Airyscan avec les paramètres automatiques de filtre de déconvolution par défaut.
  6. Ouvrez les images confocales dans un logiciel de traitement d’image pour ajuster la luminosité et le contraste, ajouter la barre d’échelle et exporter les images pour les chiffres finaux.

Résultats

Nous avons observé un étiquetage robuste et spécifique des cellules ciliées après l’incubation de 2h d’organes d’explants de Corti provenant de souris de type sauvage postnatal-jour-6 (P6) avec 3 kDa dextran fluorescents étiquetés avec Texas Red (dextran-TR) (Figure 2A-B). L’étiquetage de Dextran a été observé dans les cellules ciliées intérieures et externes (IHC et OHC) aux régions basales, moyennes et apatiques de l’organe de Corti (

Discussion

Ce protocole décrit comment effectuer des expériences d’adoption dans l’organe murine des explants de Corti avec 3 kDa dextran Texas Red. L’objectif de cette méthode est de tester si les molécules plus grandes que d’autres précédemment testées ont également été en mesure d’étiqueter spécifiquement les cellules ciliées auditives et imprégner par le canal MET. Des protocoles expérimentaux similaires ont déjà été utilisés pour évaluer la perméabilité des cellules ciliées à d’autres color...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à révéler.

Remerciements

Nous remercions Vincent Schram du noyau de microscopie et d’imagerie NICHD pour son aide à l’acquisition d’images confocales, et Tsg-Hui Chang pour son aide inestimable dans la gestion des colonies et les soins aux souris. Cette recherche a été appuyée par le Programme de recherche intra-muros du NINDS, NIH, Bethesda, MD, à K.J.S. A.B. a été soutenue par le Programme de recherche intra-muros du NINDS, NIH, et par une bourse postdoctorale Robert Wenthold du programme de recherche intra-muros du NIDCD.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
#1.5 glass coverslips 18mmWarner Instruments64-0714
Alexa Fluor 488 PhalloidinThermoFisherA12379
Alexa Fluor 594 PhalloidinThermoFisherA12381
alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objectiveCarl Zeiss420780-9970-000
Amiloride hydrochlorideEMD MILLIPORE129876
Benchwaver 3-dimensional RockerBenchmarks scientificB3D5000
C57BL/6J wild-type micestrain 000664The Jackson Laboratory
Cell impermeant BAPTA tetrapotassium saltThermoFisherB1204
Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine FixableThermoFisherD1820
Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine FixableThermoFisherD1863
Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine FixableThermoFisherD3328
Formaldehyde Aqueous Solution EM GradeElectron microscopy science15710
HBSS, calcium, magnesium, no phenol redThermoFisher14025
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol redThermoFisher14170
Image J or FIJINIHhttp://fiji.sc/
Immersol 518F oil immersion mediaCarl Zeiss444970-9000-000
Leibovitz's L-15 Medium, GlutaMAX SupplementThermoFisher31415029
neomycin trisulfate salt hydrateSigmaN6386
PBS (10X), pH 7.4ThermoFisher70011069
Phalloidin-CF405MBiotium00034
ProLong Diamond antifade mounting mediaThermoFisherP36970
superfrost plus microscope slideFisherbrand22-037-246
Triton X-100SigmaT8787
Zen Black 2.3 SP1 softwareCarl Zeisshttps://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html

Références

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