JoVE Logo
Autoren
Kontakt

Anmelden

Zum Anzeigen dieser Inhalte ist ein JoVE-Abonnement erforderlich. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.

In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir eine Methode zur Visualisierung der Aufnahme von 3 kDa Texas Red-labeled dextran in auditiven Haarzellen mit funktionellen Mechanotransduktionskanälen. Darüber hinaus kann Dextrans von 3–10 kDa verwendet werden, um Endozytose im Haar und unterstützenden Zellen des Organs von Corti zu studieren.

Zusammenfassung

Der Haarzell-Mechanotransduktionskanal (MET) spielt beim Hören eine wichtige Rolle. Die molekulare Identität und die strukturellen Informationen der ME bleiben jedoch unbekannt. Elektrophysiologische Untersuchungen von Haarzellen ergaben, dass der MET-Kanal eine große Leitfähigkeit hat und für relativ große fluoreszierende kationische Moleküle durchlässig ist, darunter einige Styrylfarbstoffe und Texas Rot-markierte Aminoglykosid-Antibiotika. In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode zur Visualisierung und Bewertung der Aufnahme von fluoreszierender Dextrans in Haarzellen des Organs der Corti-Explants, die verwendet werden können, um funktionelle MET-Kanäle zu untersuchen. Wir fanden heraus, dass 3 kDa Texas Red-labeled dextran speziell funktionelle auditive Haarzellen nach 1-2 h Inkubation kennzeichnet. Insbesondere beschriftet 3 kDa dextran die beiden kürzeren Stereocilia-Reihen und sammelt sich im Zellkörper in einem diffusen Muster an, wenn funktionelle MET-Kanäle vorhanden sind. Ein zusätzliches vesikelartiges Etikettierungsmuster wurde im Zellkörper von Haarzellen und umgebenden stützenden Zellen beobachtet. Unsere Daten deuten darauf hin, dass 3 kDa Texas-Red Dextran verwendet werden kann, um zwei Wege für die Aufnahme von zellulären Farbstoffen zu visualisieren und zu untersuchen; eine haarzellspezifische Einstiegsroute durch funktionelle MET-Kanäle und Endozytose, ein Muster, das auch für größere Dextran verfügbar ist.

Einleitung

Die Haarzellen des Innenohrs sind die Sinneszellen, die Schall erkennen und die mechanischen Reize in elektrischen Signalen verdeckt, die letztlich von unserem Gehirn interpretiert werden. Diese Zellen haben ein treppenförmiges Bündel von drei Reihen von actinbasierten Filamenten, bekannt als Stereocilia, die aus ihrer apikalen Region1,2hervorragen. Die mechanischen Reize lenken die Stereocilia-Filamente in Richtung der längsten Reihe ab und lösen die Öffnung der Mechanotransduktionskanäle (MET)3aus. Die Öffnung der MET-Kanäle führt zu einem Zustrom von Kationen, die die Zelle depolarisieren und folglich die Freisetzung von Synapsenbläschen im Basalbereich der Haarzelle signalisieren.

Die biophysikalischen Eigenschaften des für das Hören wesentlichen MET-Kanals wurden extensiv charakterisiert. Unter anderen Eigenschaften sind diese Kanäle kationisch selektiv und haben eine relativ große Leitfähigkeit (150–300 pS in niedrigen Ca2+) 4,5,6,7,8,9,10. Bemerkenswert ist, dass große fluoreszierende Moleküle wie FM1-43 und Texas Rotmarkierte Aminoglykoside permeant Blocker des MET-Kanals sind, was zu ihrer Ansammlung im Haarzellkörper führt, die mit Fluoreszenzmikroskopie11,12,13,14visualisiert werden kann. Umgekehrt sind die molekulare Identität und die Struktur des MET-Kanals und sein Permeationsweg schwer fassbar geblieben. Zunehmende experimentelle Belege deuten darauf hin, dass das transmembranartige Kanalprotein 1 (TMC1) ein Bestandteil des MET-Kanals in reifen Haarzellen15,16,17,18,19ist. Mutationen im transmembranartigen Kanal 1 (TMC1) verändern die MET-Kanaleigenschaften19,20,21,22 und verursachen Taubheit. Darüber hinaus lokalisiert TMC1 auf die Stelle des MET-Kanals18,23 und interagiert mit dem Tip-Link, der für die Übertragung der mechanischen Kraft an den MET-Kanal24,25verantwortlich ist. Darüber hinaus hat eine kürzlich durchgeführte Bioinformatik-Analyse die TMC-Proteine als evolutionär identifiziert, die mit den mechanosensitiven Kanälen TMEM63/OSCA-Proteinen und den TMEM16-Proteinen zusammenhängen, einer Familie von Calcium-aktivierten Chloridkanälen und Lipid-Scramblases26,27,28. Ein Strukturmodell von TMC1, das auf der Beziehung zwischen diesen Proteinen basiert, zeigte das Vorhandensein eines großen Hohlraums an der Protein-Lipid-Schnittstelle27. Dieser Hohlraum enthält die beiden TMC1-Mutationen, die autosomal dominanten Hörverlust (DFNA36)27,29,30,31,32, und selektive Modifikation von Cysteinmutanten für Rückstände in der Kavität verändern MET-Kanaleigenschaften28, was darauf hindeutet, dass es als Permeationsweg des MET-Kanals funktionieren könnte. Die große Größe dieser vorhergesagten Kavität in TMC-Proteinen könnte die Fähigkeit großer Moleküle erklären, den MET-Kanal zu durchdringen. Um die Vorhersage zu testen, dass der MET-Kanal einen ungewöhnlich großen Permeationsweg enthält, und um die Grenzen der Größe der in TMC1 beobachteten Kavität zu überschreiten, haben wir ein Protokoll entwickelt, um Aufnahmeexperimente im Organ von Corti-Explants mit einem größeren Molekül durchzuführen, 3 kDa Dextran fluoreszierend mit Texas Red beschriftet.

Dextran ist ein komplexes verzweigtes Polysaccharid, das aus vielen D-Glucose-Molekülen besteht, die durch alpha-1,6 glykodidische Verbindungen gebunden sind. Seine hohe Löslichkeit in Wasser, geringe Zelltoxizität und Bioinertity machen es zu einem vielseitigen Werkzeug, um mehrere zelluläre Prozesse zu studieren. Darüber hinaus ist dextran in einer Vielzahl von Größen erhältlich und fluoreszierend mit Fluorophoren in verschiedenen Farben gekennzeichnet. Fluoreszierend beschriftet dextrans werden häufig in der Zell- und Gewebedurchlässigkeitsforschung33,34, zur Untersuchung der Endozytose in mehreren zellulären Systemen35,36, und für die neuronale Tracing37,38. Im hörbaren Bereich wurden dextran Moleküle auch verwendet, um die Störung der Zell-Zell-Kreuzung und den Verlust der auditiven sensorischen Epithelintegrität nach Exposition gegenüber intensivem Rauschen im Chinchilla-Organ von Corti39,40zu bewerten.

In dieser Arbeit nutzten wir die Eigenschaften einiger der kleinsten (3 und 10 kDa) fluoreszierenden Dextrans, um Aufnahmeexperimente in murinen Innenohrhaarzellen durchzuführen und die Größe des Permeationswegs des Met-Kanals der Inneren Ohrhaarzelle zu untersuchen. Darüber hinaus verwendeten wir ein Laserscanning Konfokalmikroskop (LSM) 880 mit einem Airyscan-Detektor, um fluoreszierende Dextran an der Stereocilia und dem Zellkörper von auditiven Haarzellen zu visualisieren und zu lokalisieren.

Protokoll

Die Tierpflege und die experimentellen Verfahren wurden gemäß den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt, die vom Animal Care and Use Committee des National Institute of Neurological Disorders and Stroke (Animal Protocol #1336 to KJS) genehmigt wurden.

1. Mäuse

  1. Legen Sie ein paar Brutpaare von C57BL/6J Wildtyp in der Tieranlage zu brüten, um das Geburtsdatum der Würfe zu kontrollieren und das Alter der Welpen zu verfolgen.

2. Cochleae-Sektion

  1. Stellen Sie einen Randbereich in der Nähe eines Stereomikroskops ein, um die Sezierungen durchzuführen (Abbildung 1A). Verwenden Sie 70% Ethanol, um den Raum und die Umgebung zu reinigen und legen Sie eine saubere Bank Pad. Eine Plastiktüte medical Pathological Waste (MPW) wäre erforderlich, um die Tierkadaver zu entsorgen.
  2. Bereiten Sie mehrere 35 mm Gerichte mit einigen Leibovitz L15 Medien.
    HINWEIS: Leibovitz' L-15-Zellmedium enthält 1–2 mM Ca2+,das erforderlich ist, um die Integrität der Tip-Links zu erhalten, und enthält essentielle Aminosäuren, Vitamine und Natriumpyruvat, um die Gesundheit und das Überleben der Zellen zu verbessern. Serum wurde ausgeschlossen, um experimentelle Variabilität aufgrund seiner schlecht definierten Zusammensetzung und potenziellen Interferenzen mit dem Dextran zu vermeiden.
  3. Euthanisieren Postnatal-Day-6 (P6) Mäuse durch Enthauptung.
    HINWEIS: 6 Tage alte Mäuse sind etwas resistent gegen inhalative Anästhetika. Obwohl Isofluran oder verlängerteCO2-Expositionen (bis zu 50 min) zur Euthanasie verwendet werden können, wird eine sekundäre physikalische Methode empfohlen, um den Tod zu gewährleisten.
  4. Verwenden Sie eine chirurgische Schere, um die Haut des Schädels zu entfernen, indem Sie einen oberflächlichen Schnitt vom vorderen zum hinteren Ende und über die äußeren Gehörkanäle machen.
  5. Falten Sie die Haut in Richtung der Nase, um den Schädel auszusetzen (Abbildung 2B).
  6. Machen Sie einen Schnitt von der Rückseite nach vorne des Schädels und über die Augenlinie (Abbildung 2B-C).
  7. Trennen Sie den Schädel in zwei Hälften und entfernen Sie das Gehirn mit einem kleinen Spachtel, um die zeitlichen Knochen zu belichten (Abbildung 2C-D).
  8. Mit einer kleinen Schere, um die zeitlichen Knochen schneiden, und verbrauchen das Gewebe.
  9. Legen Sie beide temporalen Knochen in eine 35-mm-Schale und stellen Sie sicher, dass sie mit L15-Medien bedeckt sind (Abbildung 2E).
    HINWEIS: Die folgenden Schritte werden unter dem Stereomikroskop ausgeführt. Ein schwarzer Hintergrund hilft in der Regel, das Gewebe während der feinen Sezierschritte zu visualisieren.
  10. Entfernen Sie unter einem Stereomikroskop, das mit einem Weitfeld-Okular (10X Vergrößerungsleistung (WF10X) und einer externen Wechselstrom-Halogen-Lichtquelle ausgestattet ist, das umgebende Cochlea-Gewebe, halbkreisförmige Kanäle und vestibuläre Organe mit chirurgischen Zangen (Abbildung 2F).
  11. Damit die Dextran- und L15-Medien in den Cochlea-Kanal gelangen, führen Sie zwei Punktionsgrenzen an der sezierten Cochleae durch, eine am runden Fenster und eine andere im apikalen Cochlea-Bereich.
  12. Fügen Sie 300 ml Leibovitz L15 Medien in jedem Brunnen von einer 9-Well-Glas-Depressionplatte.
  13. Legen Sie mindestens drei sezierte Cochleae auf jeden Brunnen.

3. Dextran Etikettierung

  1. Stellen Sie das Dextran in der ausgewogenen Salzlösung von Hanks ohne Ca2+ und Mg2+ (HBSS-CFM) in einer Endkonzentration von 10 mg/ml wieder her. Diese Lagerlösung muss in undurchsichtigen schwarzen Rohren (lichtgeschützt) angeboten und bis zur Verwendung bei -30 °C gelagert werden.
    HINWEIS: Die Verwendung von Lysin-fixierbarem Dextran ist entscheidend für ein erfolgreiches Ergebnis dieses Protokolls.
  2. Bereiten Sie jeden Dextran in einer Endkonzentration von 2 mg/ml in 500 ml von Leibovitz' L15-Medien vor.
  3. Entfernen Sie die Medien aus der Cochlea und fügen Sie Leibovitz L15-Medien, die den Dextran von Interesse in einer endigen Konzentration von 2 mg/ml enthalten.
    HINWEIS: Obwohl ein Teil der MET-Kanäle in Ruhe41,42offen ist, wurde die Dextran-Inkubation mit einem sanften Schütteln der Expflanzen durchgeführt, um die offene Wahrscheinlichkeit des MET-Kanals zu erhöhen.
  4. Bei Raumtemperatur für 2 h mit sanftem Schütteln (25 Umdrehungen pro Minute) mit einem dreidimensionalen Shaker mit einem Neigungswinkel von 25° bebrüten.
    HINWEIS: Fluoreszierend dextran muss nach Möglichkeit vor Licht geschützt werden. Um den Dextran während der 2 h Inkubation zu schützen, legen Sie die 9-Well-Glasplatte in eine Zellkultur P150 Schale in Aluminiumfolie gewickelt.

4. Probenvorbereitung für die Bildgebung

  1. Nach der Inkubation mit dem Dextran das Gewebe zweimal mit Medien und einmal mit HBSS waschen.
  2. Inkubieren Sie das Gewebe bei Raumtemperatur 30 min mit 4% Paraformaldehyd in Hanks' ausgewogener Salzlösung (HBSS).
    VORSICHT: Die Exposition gegenüber Formaldehyd kann die Augen, die Nase und die oberen Atemwege reizen. Bei bestimmten Personen kann eine wiederholte Exposition der Haut gegenüber Formaldehyd zu Einer Sensibilisierung führen, die zu allergischer Dermatitis führen kann. Formaldehyd ist ein bekanntes menschliches Karzinogen und eine vermutete Fortpflanzungsgefahr.
  3. Waschen Sie das fixierte Gewebe zweimal mit HBSS, um das Paraformaldehyd zu entfernen.
    HINWEIS: Eine Entkalkung der zeitlichen Knochen ist in dieser Entwicklungsphase der Cochlea nicht erforderlich.
  4. Entfernen Sie das Spiralband und die tektoriale Membran mit feinen Spitzenzangen, um das Organ von Corti zu sezieren (Abbildung 2G).
  5. Entfernen Sie alle kleinen Gewebestücke und waschen Sie das Gewebe mit HBSS.
  6. Permeabilisieren Sie das Gewebe in 0,5% Triton X-100 in PBS, das fluoreszentrisch markiertes Phalloidin (konjugiert zu grün oder rot, wenn die Aufnahme von TR- oder FITC-markiertem Dextran getestet wird) bei einer Verdünnung von 1:200 für 30 min enthält, um F-Actin zu kennzeichnen und die aktinbasierte Stereocilia.
  7. Waschen Sie das Gewebe 2–3 Mal für 2 min jedes Mal mit HBSS Puffer, um den Überschuss an Triton und Phalloidin zu entfernen, und einmal mit PBS, um die Salze zu entfernen.
  8. Montieren Sie das Organ von Corti-Geweben auf einem Mikroskopschlitten und bedecken Sie es mit Montagemedien.
    HINWEIS: Achten Sie bei der Montage des Gewebes darauf, dass die Seite des Gewebes, die die Stereocilia der Haarzelle enthält, dem Deckelzuschlag zugewandt ist.
  9. Entfernen Sie mögliche Blasen, die beim Hinzufügen der Montagemedien entstehen, und verhindern Sie die Erzeugung neuer Blasen während der Platzierung des Deckblatts.
    HINWEIS: Aspirieren Sie mit einer Pipette jede Blase, die während der Zugabe des Montagemediums erzeugt wird. Um zu verhindern, dass Luftblasen unter dem Deckelschlupf gefangen werden, legen Sie eine Kante des Deckels in der Nähe der Probe und senken Sie vorsichtig und langsam den Deckelrutsch über dem Gewebe mit Zangen oder einer Pipettespitze.
  10. Bedecken Sie das Gewebe in Montagemedien mit einem Glasdeckel (Abbildung 2H).
    HINWEIS: Objektive mit einer numerischen Blende über 0,4 sind für die Verwendung von #1,5 Abdeckungen (0,17 mm Dicke) ausgelegt. Die Verwendung des falschen Deckzettels kann schwerwiegende Auswirkungen auf die Intensität und Qualität der Bilder haben.
  11. Inkubieren Sie das montierte Gewebe über Nacht bei Raumtemperatur, um die Montagemedien trocknen zu lassen und die Dias bis zur Bildgebung bei 4 °C zu lagern.

5. Bildaufnahme und Bildverarbeitung

HINWEIS: Die konfokalen Bilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop LSM 880 aufgenommen, das mit einem 32-Kanal Airyscan-Detektor im Superauflösungsmodus (SR)43 und einem 63-fachen Objektiv ausgestattet ist.

  1. Fügen Sie einen kleinen Tropfen Tauchöl auf das Ziel.
  2. Platzieren Sie den Mikroskopschlitten mit der montierten Gewebeprobe in der Mikroskopstufe mit dem Glasdeckel, der auf das Tauchöl gerichtet ist.
  3. Konzentrieren Sie sich auf das Beispiel und legen Sie die Bildparameter mit der Bildaufnahmesoftware fest.
  4. Verwenden Sie für jedes unabhängige Experiment identische Bildaufnahmeeinstellungen und optimale Parameter für die X-, Y- und Z-Auflösung. Ein piezogesteuertes Fokussystem ist erforderlich, um das Ziel beim Erfassen des Z-Stacks von Bildern schnell und präzise zu bewegen.
    HINWEIS: Um den gesamten apikalen Bereich der Haarzellen abzubilden, sammeln Sie einen Z-Stack von Bildern von der Stereocilia zur apikalen Hälfte des Haarzellkörpers mit den optimalen Einstellungen. Es ist wichtig, einen großen Z-Stack entlang der Haarzelle zu sammeln, um die Bildgebung der vesikelartigen Partikel zu gewährleisten.
  5. Verwenden Sie die Bildaufnahmesoftware, um die rohen konfokalen Bilder mit dem Airyscan 3D-Rekonstruktionsalgorithmus mit den automatischen Standard-Dekonvolution-Filtereinstellungen zu verarbeiten.
  6. Öffnen Sie die konfokalen Bilder in einer Bildverarbeitungssoftware, um Helligkeit und Kontrast anzupassen, die Maßstabsleiste hinzuzufügen und die Bilder für die endgültigen Zahlen zu exportieren.

Ergebnisse

Wir beobachteten eine robuste und spezifische Kennzeichnung von Haarzellen nach 2h Inkubation von Organen von Corti-Explants von wildtypen postnatalen Tagesmäusen (P6) mit 3 kDa Dextran fluoreszierend mit Texas Red (dextran-TR)(Abbildung 2A-B). Die Dextran-Etikettierung wurde sowohl in inneren als auch äußeren Haarzellen (IHC und OHC) an den basalen, mittleren und apikalen Bereichen des Corti-Organs beobachtet (Abbildung 2B)....

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt, wie Aufnahmeexperimente in murinen Organ von Corti-Explants mit 3 kDa dextran Texas Red durchzuführen. Ziel dieser Methode ist es zu testen, ob Moleküle, die größer als andere zuvor getestetwurden, auch in der Lage waren, auditive Haarzellen gezielt zu kennzeichnen und durch den MET-Kanal zu durchdringen. Ähnliche experimentelle Protokolle wurden bisher verwendet, um die Durchlässigkeit von Haarzellen zu anderen fluoreszierenden Farbstoffen wie FM1-43 (0,56 kDa)12

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Wir danken Vincent Schram vom NICHD-Mikroskopie- und Bildgebungskern für die Unterstützung bei der konfokalen Bildaufnahme und Tsg-Hui Chang für die unschätzbare Hilfe bei der Verwaltung von Kolonien und der Mäusepflege. Diese Forschung wurde unterstützt durch das Intramural Research Program des NINDS, NIH, Bethesda, MD, an K.J.S. A.B. wurde durch das Intramural Research Program des NINDS, NIH, und durch ein Robert Wenthold Postdoktorandenstipendium aus dem intramurarischen Forschungsprogramm unterstützt. der NIDCD.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
#1.5 glass coverslips 18mmWarner Instruments64-0714
Alexa Fluor 488 PhalloidinThermoFisherA12379
Alexa Fluor 594 PhalloidinThermoFisherA12381
alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objectiveCarl Zeiss420780-9970-000
Amiloride hydrochlorideEMD MILLIPORE129876
Benchwaver 3-dimensional RockerBenchmarks scientificB3D5000
C57BL/6J wild-type micestrain 000664The Jackson Laboratory
Cell impermeant BAPTA tetrapotassium saltThermoFisherB1204
Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine FixableThermoFisherD1820
Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine FixableThermoFisherD1863
Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine FixableThermoFisherD3328
Formaldehyde Aqueous Solution EM GradeElectron microscopy science15710
HBSS, calcium, magnesium, no phenol redThermoFisher14025
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol redThermoFisher14170
Image J or FIJINIHhttp://fiji.sc/
Immersol 518F oil immersion mediaCarl Zeiss444970-9000-000
Leibovitz's L-15 Medium, GlutaMAX SupplementThermoFisher31415029
neomycin trisulfate salt hydrateSigmaN6386
PBS (10X), pH 7.4ThermoFisher70011069
Phalloidin-CF405MBiotium00034
ProLong Diamond antifade mounting mediaThermoFisherP36970
superfrost plus microscope slideFisherbrand22-037-246
Triton X-100SigmaT8787
Zen Black 2.3 SP1 softwareCarl Zeisshttps://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html

Referenzen

  1. Furness, D. N., Hackney, C. M. . The Structure and Composition of the Stereociliary Bundle of Vertebrate Hair Cells. , (2006).
  2. Barr-Gillespie, P. G. Assembly of hair bundles, an amazing problem for cell biology. Molecular Biology of the Cell. 26 (15), 2727-2732 (2015).
  3. Shotwell, S. L., Jacobs, R., Hudspeth, A. J. Directional sensitivity of individual vertebrate hair cells to controlled deflection of their hair bundles. Annals of the New York Academy of Sciences. 374, 1-10 (1981).
  4. Fettiplace, R., Kim, K. X. The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing. Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).
  5. Fettiplace, R. Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).
  6. Corey, D. P., Hudspeth, A. J. Ionic basis of the receptor potential in a vertebrate hair cell. Nature. 281 (5733), 675-677 (1979).
  7. Beurg, M., Evans, M. G., Hackney, C. M., Fettiplace, R. A large-conductance calcium-selective mechanotransducer channel in mammalian cochlear hair cells. The Journal of Neuroscience. 26 (43), 10992-11000 (2006).
  8. Geleoc, G. S., Lennan, G. W., Richardson, G. P., Kros, C. J. A quantitative comparison of mechanoelectrical transduction in vestibular and auditory hair cells of neonatal mice. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 264 (1381), 611-621 (1997).
  9. Kros, C. J., Rusch, A., Richardson, G. P. Mechano-electrical transducer currents in hair cells of the cultured neonatal mouse cochlea. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 249 (1325), 185-193 (1992).
  10. Ohmori, H. Mechano-electrical transduction currents in isolated vestibular hair cells of the chick. The Journal of Physiology. 359, 189-217 (1985).
  11. Gale, J. E., Marcotti, W., Kennedy, H. J., Kros, C. J., Richardson, G. P. FM1-43 dye behaves as a permeant blocker of the hair-cell mechanotransducer channel. The Journal of Neuroscience. 21 (18), 7013-7025 (2001).
  12. Lelli, A., Asai, Y., Forge, A., Holt, J. R., Geleoc, G. S. Tonotopic gradient in the developmental acquisition of sensory transduction in outer hair cells of the mouse cochlea. Journal of Neurophysiology. 101 (6), 2961-2973 (2009).
  13. Alharazneh, A., et al. Functional hair cell mechanotransducer channels are required for aminoglycoside ototoxicity. PLoS One. 6 (7), 22347 (2011).
  14. Marcotti, W., van Netten, S. M., Kros, C. J. The aminoglycoside antibiotic dihydrostreptomycin rapidly enters mouse outer hair cells through the mechano-electrical transducer channels. The Journal of Physiology. 567, 505-521 (2005).
  15. Corns, L. F., Jeng, J. Y., Richardson, G. P., Kros, C. J., Marcotti, W. TMC2 Modifies Permeation Properties of the Mechanoelectrical Transducer Channel in Early Postnatal Mouse Cochlear Outer Hair Cells. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 326 (2017).
  16. Kawashima, Y., Kurima, K., Pan, B., Griffith, A. J., Holt, J. R. Transmembrane channel-like (TMC) genes are required for auditory and vestibular mechanosensation. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 467 (1), 85-94 (2015).
  17. Kim, K. X., Fettiplace, R. Developmental changes in the cochlear hair cell mechanotransducer channel and their regulation by transmembrane channel-like proteins. The Journal of General Physiology. 141 (1), 141-148 (2013).
  18. Kurima, K., et al. TMC1 and TMC2 Localize at the Site of Mechanotransduction in Mammalian Inner Ear Hair Cell Stereocilia. Cell Reports. 12 (10), 1606-1617 (2015).
  19. Pan, B., et al. TMC1 and TMC2 are components of the mechanotransduction channel in hair cells of the mammalian inner ear. Neuron. 79 (3), 504-515 (2013).
  20. Kawashima, Y., et al. Mechanotransduction in mouse inner ear hair cells requires transmembrane channel-like genes. Journal of Clinical Investigation. 121 (12), 4796-4809 (2011).
  21. Beurg, M., Goldring, A. C., Fettiplace, R. The effects of Tmc1 Beethoven mutation on mechanotransducer channel function in cochlear hair cells. The Journal of General Physiology. 146 (3), 233-243 (2015).
  22. Corns, L. F., Johnson, S. L., Kros, C. J., Marcotti, W. Tmc1 Point Mutation Affects Ca2+ Sensitivity and Block by Dihydrostreptomycin of the Mechanoelectrical Transducer Current of Mouse Outer Hair Cells. The Journal of Neuroscience. 36 (2), 336-349 (2016).
  23. Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging. Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).
  24. Maeda, R., et al. Tip-link protein protocadherin 15 interacts with transmembrane channel-like proteins TMC1 and TMC2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (35), 12907-12912 (2014).
  25. Assad, J. A., Shepherd, G. M., Corey, D. P. Tip-link integrity and mechanical transduction in vertebrate hair cells. Neuron. 7 (6), 985-994 (1991).
  26. Medrano-Soto, A., et al. Bioinformatic characterization of the Anoctamin Superfamily of Ca2+-activated ion channels and lipid scramblases. PLoS One. 13 (3), 0192851 (2018).
  27. Ballesteros, A., Fenollar-Ferrer, C., Swartz, K. J. Structural relationship between the putative hair cell mechanotransduction channel TMC1 and TMEM16 proteins. Elife. 7, (2018).
  28. Pan, B., et al. TMC1 Forms the Pore of Mechanosensory Transduction Channels in Vertebrate Inner Ear Hair Cells. Neuron. 99 (4), 736-753 (2018).
  29. Kitajiri, S., Makishima, T., Friedman, T. B., Griffith, A. J. A novel mutation at the DFNA36 hearing loss locus reveals a critical function and potential genotype-phenotype correlation for amino acid-572 of TMC1. Clinical Genetics. 71 (2), 148-152 (2007).
  30. Makishima, T., Kurima, K., Brewer, C. C., Griffith, A. J. Early onset and rapid progression of dominant nonsyndromic DFNA36 hearing loss. Otology & Neurotology. 25 (5), 714-719 (2004).
  31. Noguchi, Y., et al. Multiple quantitative trait loci modify cochlear hair cell degeneration in the Beethoven (Tmc1Bth) mouse model of progressive hearing loss DFNA36. Genetics. 173 (4), 2111-2119 (2006).
  32. Vreugde, S., et al. Beethoven, a mouse model for dominant, progressive hearing loss DFNA36. Nature Genetics. 30 (3), 257-258 (2002).
  33. Hulstrom, D., Svensjo, E. Intravital and electron microscopic study of bradykinin-induced vascular permeability changes using FITC-dextran as a tracer. The Journal of Pathology. 129 (3), 125-133 (1979).
  34. Mayhan, W. G., Heistad, D. D. Permeability of blood-brain barrier to various sized molecules. American Journal of Physiology. 248 (5), 712-718 (1985).
  35. Makarow, M. Endocytosis in Saccharomyces cerevisiae: internalization of alpha-amylase and fluorescent dextran into cells. The EMBO Journal. 4 (7), 1861-1866 (1985).
  36. Clayton, E. L., Cousin, M. A. Quantitative monitoring of activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicle membrane by fluorescent dextran imaging. Journal of Neuroscience Methods. 185 (1), 76-81 (2009).
  37. Allman, B. L., Keniston, L. P., Meredith, M. A. Adult deafness induces somatosensory conversion of ferret auditory cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (14), 5925-5930 (2009).
  38. Warr, W. B., Boche, J. B., Neely, S. T. Efferent innervation of the inner hair cell region: origins and terminations of two lateral olivocochlear systems. Hearing Research. 108 (1-2), 89-111 (1997).
  39. Hu, B. H., Zheng, G. L. Membrane disruption: an early event of hair cell apoptosis induced by exposure to intense noise. Brain Research. 1239, 107-118 (2008).
  40. Zheng, G., Hu, B. H. Cell-cell junctions: a target of acoustic overstimulation in the sensory epithelium of the cochlea. BMC Neuroscience. 13, 71 (2012).
  41. Beurg, M., Nam, J. H., Chen, Q., Fettiplace, R. Calcium balance and mechanotransduction in rat cochlear hair cells. Journal of Neurophysiology. 104 (1), 18-34 (2010).
  42. Johnson, S. L., Beurg, M., Marcotti, W., Fettiplace, R. Prestin-driven cochlear amplification is not limited by the outer hair cell membrane time constant. Neuron. 70 (6), 1143-1154 (2011).
  43. Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), (2017).
  44. Gil-Loyzaga, P., Brownell, W. E. Wheat germ agglutinin and Helix pomatia agglutinin lectin binding on cochlear hair cells. Hearing Research. 34 (2), 149-155 (1988).
  45. Santi, P. A., Anderson, C. B. Alcian blue staining of cochlear hair cell stereocilia and other cochlear tissues. Hearing Research. 23 (2), 153-160 (1986).
  46. Slepecky, N., Chamberlain, S. C. The cell coat of inner ear sensory and supporting cells as demonstrated by ruthenium red. Hearing Research. 17 (3), 281-288 (1985).
  47. Rusch, A., Kros, C. J., Richardson, G. P. Block by amiloride and its derivatives of mechano-electrical transduction in outer hair cells of mouse cochlear cultures. The Journal of Physiology. 474 (1), 75-86 (1994).
  48. Zhao, Y., Yamoah, E. N., Gillespie, P. G. Regeneration of broken tip links and restoration of mechanical transduction in hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (26), 15469-15474 (1996).
  49. Indzhykulian, A. A., et al. Molecular remodeling of tip links underlies mechanosensory regeneration in auditory hair cells. PLoS Biol. 11 (6), 1001583 (2013).
  50. Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).
  51. West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109 (6), 2731-2739 (1989).
  52. Park, S., et al. tmie Is required for gentamicin uptake by the hair cells of mice. Comp Med. 63 (2), 136-142 (2013).
  53. Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. The Journal of Neuroscience. 23 (10), 4054-4065 (2003).
  54. Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells. The Journal of Neuroscience. 27 (50), 13890-13902 (2007).
  55. Beurg, M., et al. Variable number of TMC1-dependent mechanotransducer channels underlie tonotopic conductance gradients in the cochlea. Nature Communications. 9 (1), 2185 (2018).
  56. Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), e53561 (2016).
  57. Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research. Journal of Visualized Experiments. (124), e55704 (2017).
  58. May-Simera, H. Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (108), e53559 (2016).
  59. Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic Culture of Neonatal Murine Inner Ear Explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
  60. Granath, K. A. Solution properties of branched dextrans. Journal of Colloid Science. 13 (4), 20 (1958).
  61. Molecular Probes, I.D.T. . Product information on Dextran Conjugates. , (2006).
  62. Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), 41 (2017).

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Weitere Artikel entdecken

BioengineeringAusgabe 156DextranInnenohr HaarzellenMechanotransduktionskanalFarbstoffaufnahmeEndozytoseintrazellul re Vesikelkonfokale Mikroskopie

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Kontakt

BIBLIOTHEKS-EMPFEHLUNG

JoVE-Newsletter

Forschung

Lehre

Autoren

Bibliothekare

ÜBER JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten