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Resumen

Aquí, presentamos un método para visualizar la toma de 3 kDa Texas Red-labeled dextran en células vellosas auditivas con canales funcionales de mechanotransducción. Además, dextrans de 3-10 kDa se puede utilizar para estudiar la endococitosis en el cabello y las células de soporte del órgano de Corti.

Resumen

El canal de mecanotransducción de células pilosas (MET) desempeña un papel importante en la audición. Sin embargo, la identidad molecular y la información estructural del Met siguen siendo desconocidas. Los estudios electrofisiológicos de las células pilosas revelaron que el canal MET tiene una gran conductividad y es permeable a moléculas catiónicas fluorescentes relativamente grandes, incluyendo algunos tintes de estilo y antibióticos aminoglucósidos etiquetados en rojo de Texas. En este protocolo, describimos un método para visualizar y evaluar la absorción de dextrans fluorescente en células pilosas del órgano de explantas Corti que se puede utilizar para realizar ensayos para canales MET funcionales. Encontramos que 3 kDa Texas Red-labeled dextran específicamente etiqueta células capilares auditivos funcionales después de 1–2 h de incubación. En particular, 3 kDa dextran etiqueta las dos filas de estereocilia más cortas y se acumula en el cuerpo celular en un patrón difuso cuando los canales MET funcionales están presentes. Se observó un patrón adicional similar a la vesícula de etiquetado en el cuerpo celular de las células pilosas y las células de soporte circundantes. Nuestros datos sugieren que 3 kDa Texas-Red dextran se puede utilizar para visualizar y estudiar dos vías para la aceptación del tinte celular; una ruta de entrada específica de células capilares a través de canales MET funcionales y endocitosis, un patrón también disponible para mayor demás.

Introducción

Las células pilosas del oído interno son las células sensoriales que detectan el sonido y encubren los estímulos mecánicos en las señales eléctricas, que en última instancia son interpretadas por nuestro cerebro. Estas células tienen un haz en forma de escalera de tres filas de filamentos a base de actina, conocidos como estereocilia, que sobresalen de su región apical1,2. Los estímulos mecánicos desvían los filamentos estereocilia hacia la fila más larga y activan la apertura de los canales3de mechanotransducción (MET). La apertura de los canales MET conduce a una afluencia de cationes que despolariza la célula y, en consecuencia, señala la liberación de vesículas de sinapsis en la región basal de la célula pilosa.

Las propiedades biofísicas del canal MET esenciales para la audición se han caracterizado ampliamente. Entre otras propiedades, estos canales son selectivos catiónicos y tienen una conductancia relativamente grande (150–300 pS en Ca2+bajo)4,5,6,7,8,9,10. Sorprendentemente, grandes moléculas fluorescentes como FM1-43 y aminoglucósidos etiquetados con Texas Red son bloqueadores permeantes del canal MET, lo que resulta en su acumulación en el cuerpo de la célula pilosa que se puede visualizar mediante microscopía de fluorescencia11,12,13,14. Por el contrario, la identidad molecular y la estructura del canal MET y su vía de permeación han permanecido esquivas. El aumento de la evidencia experimental indica que la proteína canal transmembrana 1 (TMC1) es un componente del canal MET en células pilosas maduras15,16,17,18,19. Las mutaciones en el canal transmembrana 1 (TMC1) alteran las propiedades del canal MET19,20,21,22 y causan sordera. Además, TMC1 localiza el sitio del canal MET18,23 e interactúa con el enlace de punta responsable de transmitir la fuerza mecánica al canal MET24,25. Además, el reciente análisis bioinformático ha identificado las proteínas TMC como evolutivas relacionadas con los canales mecanosensibles TMEM63/OSCA y las proteínas TMEM16, una familia de canales de cloruro activados por calcio y escramblas de lípidos26,27,28. Un modelo estructural de TMC1 basado en la relación entre estas proteínas reveló la presencia de una gran cavidad en la interfaz proteína-lípido27. Esta cavidad alberga las dos mutaciones TMC1 que causan pérdida auditiva autosómica dominante (DFNA36)27,29,30,31,32, y la modificación selectiva de mutantes de cisteína para residuos en la cavidad alteran las propiedades del canal MET28, lo que indica que podría funcionar como la vía de permeación del canal MET. El gran tamaño de esta cavidad pronosticada en proteínas TMC podría explicar la capacidad de las moléculas grandes para impregnar el canal MET. Para probar la predicción de que el canal MET contiene una vía de permeación inusualmente grande y para empujar los límites del tamaño de la cavidad observado en TMC1, desarrollamos un protocolo para realizar experimentos de absorción en el órgano de Corti explantes con una molécula más grande, 3 kDa dextran fluorescente etiquetado con Texas Red.

Dextran es un polisacárido ramificado complejo compuesto por muchas moléculas de D-glucosa unidas por enlaces glucosídicos alfa-1,6. Su alta solubilidad en agua, baja toxicidad celular y bioinertidad lo convierten en una herramienta versátil para estudiar varios procesos celulares. Además, dextran está disponible en una amplia gama de tamaños y etiquetado fluorescentemente con fluoróforos de varios colores. El dextrans etiquetado fluorescentemente se utiliza comúnmente en la investigación de permeabilidad celular y tisular33,34, para estudiar la endoctitosis en múltiples sistemas celulares35,36, y para el rastreo neural37,38. En el campo auditivo, las moléculas de desnción también se han utilizado para evaluar la interrupción de la unión celular-célula y la pérdida de la integridad del epitelio sensorial auditivo después de la exposición al ruido intenso en el órgano chinchilla de Corti39,40.

En este trabajo, aprovechamos las propiedades de algunos de los dextrans fluorescentes más pequeños (3 y 10 kDa) para realizar experimentos de absorción en células pilosas del oído interno murina y explorar el tamaño de la vía de permeación del canal MET de la célula del cabello del oído interno. Además, utilizamos un microscopio confocal de escaneo láser (LSM) 880 equipado con un detector Airyscan para visualizar y localizar el deextrano fluorescente en la estereocilia y el cuerpo celular de las células vellosas auditivas.

Protocolo

El cuidado de los animales y los procedimientos experimentales se realizaron siguiendo las directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio, que fueron aprobadas por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (Protocolo Animal #1336 a KJS).

1. Ratones

  1. Establecer un par de parejas reproductoras de tipo salvaje C57BL/6J para reproduciren en las instalaciones de animales para controlar la fecha de nacimiento de las camadas y realizar un seguimiento de la edad de los cachorros.

2. Disección de Cochleae

  1. Establezca un espacio limpio cerca de un estereomicroscopio para realizar las disecciones(Figura 1A). Utilice 70% de etanol para limpiar el espacio y los alrededores y colocar una almohadilla de banco limpia. Se necesitaría una bolsa de plástico de desechos patológicos médicos (MPW) para desechar las canales de los animales.
  2. Prepare varios platos de 35 mm con algunos medios L15 de Leibovitz.
    NOTA: El medio celular L-15 de Leibovitz contiene 1–2 mM Ca2+, que se requiere para mantener la integridad de los enlaces de punta, y contiene aminoácidos esenciales, vitaminas y piruvato de sodio para mejorar la salud y la supervivencia celular. El suero fue excluido para evitar la variabilidad experimental debido a su composición mal definida y a la interferencia potencial con el dextran.
  3. Eutanasia ratones postnatal-día-6 (P6) por decapitación.
    NOTA: Los ratones de 6 días de edad son algo resistentes a los anestésicos inhalantes. Aunque se pueden utilizar exposiciones prolongadas de CO2 o isoflurano (hasta 50 min) para la eutanasia, se recomienda un método físico secundario para garantizar la muerte.
  4. Utilice tijeras quirúrgicas para extraer la piel del cráneo haciendo un corte superficial desde el extremo anterior al posterior y a través de los canales auditivos externos.
  5. Doblar la piel hacia la nariz para exponer el cráneo(Figura 2B).
  6. Haga una incisión desde la parte posterior hasta la parte frontal del cráneo y a través de la línea del ojo(Figura 2B-C).
  7. Separar el cráneo en dos mitades y eliminar el cerebro con el uso de una pequeña espátula para exponer los huesos temporales(Figura 2C-D).
  8. Con tijeras pequeñas, cortar alrededor de los huesos temporales, e extirpar el tejido.
  9. Coloque ambos huesos temporales en un plato de 35 mm y asegúrese de que estén cubiertos con medios L15(Figura 2E).
    NOTA: Los siguientes pasos se realizan bajo el estereomicroscopio. Un fondo negro generalmente ayuda a visualizar el tejido durante los pasos de disección fina.
  10. Bajo un estereomicroscopio equipado con un ocular de campo ancho (una potencia de aumento de 10X (WF10X) y una fuente de luz halógena de corriente alterna externa (AC), retire el tejido de las cocleares circundantes, los canales semicirculares y los órganos vestibulares con fórceps quirúrgicos(Figura 2F).
  11. Para permitir que el dextran y los medios L15 entren en el conducto coclear, realice dos límites de punción en las cóclearas diseccionadas, una en la ventana redonda y otra en la región coclear apical.
  12. Añadir 300 ml de medios L15 de Leibovitz en cada pozo de una placa de depresión de vidrio de 9 pocillos.
  13. Coloque al menos tres cocleares diseccionados en cada pocil.

3. Etiquetado de Dextran

  1. Reconstituir el dextran en la solución salina equilibrada de Hanks sin Ca2+ y Mg2+ (HBSS-CFM) a una concentración final de 10 mg/ml. Esta solución en stock debe estar alícuota en tubos negros opacos (protegidos de la luz) y almacenarse a -30 oC hasta su uso.
    NOTA: El uso de dextran fijable en lisina es fundamental para un resultado exitoso de este protocolo.
  2. Preparar cada desntígeno a una concentración final de 2 mg/ml en 500 ml de los medios L15 de Leibovitz.
  3. Retire el medio de la cócleara y agregue los medios L15 de Leibovitz que contengan la desviación de interés a una concentración final de 2 mg/ml.
    NOTA: Aunque una proporción de los canales MET están abiertos en reposo41,42, la incubación de desmedida se realizó con un suave temblor de los explantes para aumentar la probabilidad de apertura del canal MET.
  4. Incubar a temperatura ambiente durante 2 h con un suave temblor (25 rpm) utilizando un agitador tridimensional con un ángulo inclinado de 25o.
    NOTA: La desnreza con etiqueta fluorescente debe estar protegida de la luz siempre que sea posible. Para proteger el deextrarín durante la incubación de 2 h, coloque la placa de vidrio de 9 pocillos dentro de un plato P150 de cultivo celular envuelto en papel de aluminio.

4. Preparación de muestras para imágenes

  1. Después de la incubación con el deextrarín, lave el tejido durante 2 minutos dos veces con medios y una vez con HBSS.
  2. Incubar el tejido a temperatura ambiente durante 30 min con un 4% de paraformaldehído en la solución salina equilibrada (HBSS) de Hanks.
    ADVERTENCIA: La exposición al formaldehído puede ser irritante para los ojos, la nariz y las vías respiratorias superiores. En ciertos individuos, la exposición repetida de la piel al formaldehído puede causar sensibilización que puede provocar dermatitis alérgica. El formaldehído es un carcinógeno humano conocido y un presunto riesgo reproductivo.
  3. Lave rápida y suavemente el tejido fijo dos veces con HBSS para eliminar el paraformaldehído.
    NOTA: La descalcificación de los huesos temporales no es necesaria en esta etapa de desarrollo de la cócleara.
  4. Retire el ligamento espiral y la membrana tectorial con fórceps de punta fina para diseccionar el órgano de Corti(Figura 2G).
  5. Retire todos los trozos pequeños de tejido y lave el tejido con HBSS.
  6. Permeabilizar el tejido en 0.5% Triton X-100 en PBS que contiene faloidina etiquetada fluorescentemente (conjugada a verde o roja al probar la absorción de dextran con etiqueta TR- o FITC, respectivamente) a una dilución de 1:200 durante 30 minutos para etiquetar F-actin y visualizar estereocilia a base de actina.
  7. Lavar el tejido de 2 a 3 veces durante 2 minutos cada vez con el tampón HBSS para eliminar el exceso de tritón y faloidina, y una vez con PBS para eliminar las sales.
  8. Monte el órgano de los tejidos corti en una diapositiva del microscopio y cúbralo con medios de montaje.
    NOTA: Al montar el tejido, asegúrese de que el lado del tejido que contiene la estereocilia de la célula pilosa esté orientado hacia la cubierta.
  9. Retire las posibles burbujas generadas durante la adición del soporte de montaje y evite la generación de nuevas burbujas durante la colocación de la cubierta.
    NOTA: Aspirar con una pipeta cualquier burbuja generada durante la adición del soporte de montaje. Para evitar que las burbujas de aire queden atrapadas debajo de la cubierta, coloque un borde de la cubierta cerca de la muestra y baje cuidadosamente y lentamente el cubreobjetos sobre el tejido usando fórceps o una punta de pipeta.
  10. Cubra el tejido en el soporte de montaje con un cubreobjetos de vidrio (Figura 2H).
    NOTA: Los objetivos con una apertura numérica superior a 0,4 están diseñados para utilizar #1,5 cubre (0,17 mm de espesor). El uso de la cubierta incorrecta puede tener graves implicaciones para la intensidad y la calidad de las imágenes.
  11. Incubar el tejido montado durante la noche a temperatura ambiente para dejar secar el medio de montaje y almacenar los portaobjetos a 4 oC hasta la toma de imágenes.

5. Adquisición de imágenes y procesamiento de imágenes

NOTA: Las imágenes confocales se tomaron con un microscopio confocal LSM 880 equipado con un detector Airyscan de 32 canales en el modo de superresolución (SR)43 y un objetivo de 63x.

  1. Añadir una pequeña gota de aceite de inmersión en el objetivo.
  2. Coloque la diapositiva del microscopio que contiene la muestra de tejido montado en la etapa del microscopio con la cubierta de vidrio frente al aceite de inmersión.
  3. Concéntrese en la muestra y establezca los parámetros de imagen utilizando el software de adquisición de imágenes.
  4. Utilice ajustes de adquisición de imágenes idénticos y parámetros óptimos para la resolución x, y y z para cada experimento independiente. Se requiere un sistema de enfoque impulsado por piezoeléctricas para mover el objetivo de forma rápida y precisa al adquirir la pila z de imágenes.
    NOTA: Para crear una imagen de toda la región apical de las células pilosas, recopile una pila z de imágenes desde la estereocilia hasta la mitad apical del cuerpo de la célula pilosa utilizando los ajustes óptimos. Es crucial recoger una gran pila z a lo largo de la célula pilosa para asegurar la imagen de las partículas similares a la vesícula.
  5. Utilice el software de adquisición de imágenes para procesar las imágenes confocales sin procesar utilizando el algoritmo de reconstrucción 3D de Airyscan con la configuración predeterminada predeterminada del filtro de desconvolución.
  6. Abra las imágenes confocales en un software de procesamiento de imágenes para ajustar el brillo y el contraste, añadir la barra de escala y exportar las imágenes para las figuras finales.

Resultados

Observamos etiquetado robusto y específico de las células pilosas después de 2h incubación de órgano de explantes de Corti de tipo salvaje postnatal-día-6 (P6) con 3 kDa dextran fluorescentemente etiquetado con Texas Red (dextran-TR) (Figura 2A-B). Se observó etiquetado Deextran tanto en células capilares internas como externas (IHC y OHC) en las regiones basal, media y apical del órgano de Corti(Figura 2B).

Discusión

Este protocolo describe cómo realizar experimentos de admisión en órgano murino de los explantes de Corti con 3 kDa dextran Texas Red. El objetivo de este método es probar si las moléculas más grandes que otras previamente probadas también fueron capaces de etiquetar específicamente las células vellosas auditivas y permear a través del canal MET. Protocolos experimentales similares se han utilizado previamente para evaluar la permeabilidad de las células pilosas a otros tintes fluorescentes como FM1-43 (0.56 k...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a Vincent Schram del núcleo de microscopía e imágenes NICHD por ayudar en la adquisición de imágenes confocales, y a Tsg-Hui Chang por obtener una ayuda inestimable en la gestión de colonias y el cuidado de ratones. Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramuros de la NINDS, NIH, Bethesda, MD, a K.J.S.A.B. fue apoyada por el Programa de Investigación Intramuros de la NINDS, NIH, y por una beca postdoctoral Robert Wenthold del programa de investigación intramuros del NIDCD.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
#1.5 glass coverslips 18mmWarner Instruments64-0714
Alexa Fluor 488 PhalloidinThermoFisherA12379
Alexa Fluor 594 PhalloidinThermoFisherA12381
alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objectiveCarl Zeiss420780-9970-000
Amiloride hydrochlorideEMD MILLIPORE129876
Benchwaver 3-dimensional RockerBenchmarks scientificB3D5000
C57BL/6J wild-type micestrain 000664The Jackson Laboratory
Cell impermeant BAPTA tetrapotassium saltThermoFisherB1204
Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine FixableThermoFisherD1820
Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine FixableThermoFisherD1863
Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine FixableThermoFisherD3328
Formaldehyde Aqueous Solution EM GradeElectron microscopy science15710
HBSS, calcium, magnesium, no phenol redThermoFisher14025
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol redThermoFisher14170
Image J or FIJINIHhttp://fiji.sc/
Immersol 518F oil immersion mediaCarl Zeiss444970-9000-000
Leibovitz's L-15 Medium, GlutaMAX SupplementThermoFisher31415029
neomycin trisulfate salt hydrateSigmaN6386
PBS (10X), pH 7.4ThermoFisher70011069
Phalloidin-CF405MBiotium00034
ProLong Diamond antifade mounting mediaThermoFisherP36970
superfrost plus microscope slideFisherbrand22-037-246
Triton X-100SigmaT8787
Zen Black 2.3 SP1 softwareCarl Zeisshttps://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html

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