JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים שיטה להמחיש את ספיגת 3 kda טקסס אדום התווית תוספי בתאי שיער שמיעתי עם ערוצי מכניזציה תפקודית. בנוסף, דקסטר של 3 – 10 kDa ניתן להשתמש כדי ללמוד endocyציטוזה בתוך השיער והתאים התומכים של האיבר של Corti.

Abstract

בערוץ המכונה (MET) מפעיל השער ממלא תפקיד חשוב בשמיעה. עם זאת, הזהות המולקולרית והמידע המבני של MET אינם ידועים. המחקרים האלקטרופיסיולוגיים של תאי השיער גילו שלערוץ MET יש היקף מוליכות גדול והוא חדיר למולקולות פלורסנט גדולות יחסית, כולל מספר צבעים בצבעי styryl ואנטיביוטיקה בצבע אדום עם התווית. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה להמחיש ולהעריך את ספיגת דטרנס פלורסנט בתאי השיער של האיבר של האקריות Corti שניתן להשתמש בו כדי לטפל עבור הערוצים הפונקציונליים MET. מצאנו כי 3 kda טקסס אדום תווית תוספי במיוחד תוויות שיער שמיעתי פונקציונלי לאחר 1 – 2 h הדגירה. בפרט, 3 kda תוספי תוויות שתי שורות stereocilia קצר מצטבר בגוף התא בתבנית מפוזר כאשר ערוצי MET פונקציונלי נוכחים. דפוס נוסף שלפוחית העין של תיוג נצפתה בגוף התא של תאי השיער והתאים התומכים המקיפים. הנתונים שלנו מראים כי 3 kda טקסס-אדום תוספי ניתן להשתמש כדי להמחיש וללמוד שני מסלולים עבור ספיגת צבע הסלולר; מסלול כניסה ספציפי לתא שיער באמצעות ערוצי MET פונקציונלי והאנדוציטוזה, דפוס זמין גם dextran גדול.

Introduction

תאי השיער של האוזן הפנימית הם תאי החישה המזהים קול וסמויה את הגירוי המוכני באותות חשמליים, אשר מפורשים בסופו של דבר על ידי המוח שלנו. תאים אלה יש צרור בצורת גרם מדרגות של שלוש שורות של filaments מבוססי חוטים, המכונה stereocilia, אשר בולטות מאזור פסגה שלהם1,2. הגירוי המכני מהסיט את החוטים הסטריאוציאניים לעבר השורה הארוכה ביותר ומפעיל את פתיחת ערוצי המכונה3. פתיחת ערוצי ה-MET מובילה לזרם של הקטיונים המפתלים את התא וכתוצאה מכך מאותת על שחרורו של סינפסה באזור הבסיס של תא השיער.

המאפיינים הביופיזיים של ערוץ MET חיוני לשמיעה התאפיין בהרחבה. בין היתר, הערוצים הללו הם בררניים ובעלי מוליכות גדולה יחסית (150 – 300 pS ב-Ca+ 2 +)4,5,6,7,8,9,10. באופן מדהים, מולקולות פלורסנט גדול כגון FM1-43 ו-טקסס בעלת תווית של האדום מתויג של הערוץ ה, הנובע הצטברות שלהם בגוף תא השיער שניתן לדמיין באמצעות המיקרוסקופיה הפלואורסצנטית11,12,13,14. לעומת זאת, הזהות המולקולרית ומבנה ערוץ ה-MET ומסלול החדירות שלו נותרו חמקמקים. הגדלת הראיות הנסיוניות מצביעה על כך שחלבון הערוץ ה-transרפידה (TMC1) הוא רכיב של ערוץ ה-MET בתאי שיער בוגרים15,16,17,18,19. מוטציות בערוץ מדומה (TMC1) לשנות את מאפייני ערוץ MET19,20,21,22 ולגרום חירשות. בנוסף, TMC1 לאתר את ערוץ met18,23 ואינטראקציה עם הקישור טיפ אחראי על שידור הכוח המכני לערוץ MET24,25. יתר על כן, ניתוח ביואינפורמטיקה האחרונים זיהה את החלבונים tmc כמו האבולוציה הקשורים לערוצים מכנימתי TMEM63/osca חלבונים וחלבונים TMEM16, משפחה של ערוצי כלוריד סידן מופעל ו ליפידים26,27,28. מודל מבנית של TMC1 מבוסס על הקשר בין חלבונים אלה חשף נוכחות של חלל גדול בממשק חלבון-שומנים ממשק27. זה חלל הנמלים שתי מוטציות TMC1 שגורמות לאובדן שמיעה אוטוזומלית דומיננטי (DFNA36)27,29,30,31,32, ושינוי סלקטיבי של מוטציות ציסטאין עבור שאריות בחלל לשנות את המאפיינים של הערוץ28, המציין כי זה יכול לתפקד כנתיב חדירות של ערוץ MET. הגודל הגדול של חלל זה ניבא בחלבונים TMC יכול להסביר את היכולת של מולקולות גדולות לחלחל ערוץ MET. כדי לבדוק את החיזוי כי הערוץ MET מכיל מסלול חדירות גדול במיוחד כדי לדחוף את המגבלות של גודל החלל נצפתה ב TMC1, פיתחנו פרוטוקול לבצע ניסויים ספיגה באיבר של האקסון corti עם מולקולה גדולה יותר, 3 הודה תוספי באופן שכותרתו עם טקסס אדום.

Dextran הוא רב-סוכר מורכב בענף מורכב של מולקולות D-גלוקוז רבות כרוך על ידי alpha-1, 6 הקשרים הגליצידית. שלה מסיסות גבוהה במים, רעילות תא נמוכה, ו bioinertity להפוך אותו כלי רב-תכליתי ללמוד מספר תהליכים סלולריים. בנוסף, תוספי זמין במגוון רחב של גדלים ובעלי תווית fluorophores של מספר צבעים. בדרך כלל, משתמשים ב-dextrans באמצעות מחקר של תאים וחדירות רקמות33,34, כדי ללמוד אנדוקציטוזה במערכות סלולריות מרובות35,36, ועבור מעקב עצבי37,38. בשדה השמיעה, מולקולות תוספי גם נעשה שימוש כדי להעריך את ההפרעה של הצומת תא תא ואובדן של שלמות האפיתל חושי השמיעה לאחר החשיפה לרעש אינטנסיבי בעוגב צ'ינצ'ילה של corti39,40.

בעבודה זו, אנו לנצל את המאפיינים של חלק קטן (3 ו-10 kDa) הפלורסנט כדי לבצע ניסויים ספיגה בתאי שיער פנימי murine ולחקור את הגודל של הנתיב חדירות של תא האוזן הפנימית שיער פוגש ערוץ. בנוסף, השתמשנו מיקרוסקופ קונפוקלית וקד בדיקת לייזר (lsm) 880 מצויד בגלאי airyscan כדי להמחיש ולהתאים את תוספי פלורסנט ב stereocilia ואת גוף התא של תאים שיער שמיעתי.

Protocol

הטיפול בבעלי חיים והליכים ניסיוניים נערכו בעקבות ההנחיות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, אשר אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים השימוש של המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות שבץ (פרוטוקול בעלי חיים #1336 KJS).

1. עכברים

  1. הגדר כמה זוגות הרבייה של C57BL/6J פראי סוג להתרבות במתקן החי לשלוט על תאריך הלידה של הליטות ולעקוב אחר גיל של גורים.

2. ניתוח כנימת שבלול

  1. הגדר שטח נקי קרוב לstereomicroscope לביצוע הניתוח (איור 1א). השתמש 70% אתנול כדי לנקות את החלל והסביבה ולמקם פד ספסל נקי. שקית פלסטיק פתולוגית לפסולת רפואית (MPW) תידרש להשליך את הגוויות של בעלי החיים.
  2. הכינו מספר מנות 35 מ"מ עם מדיה L15 של ליבוביץ '.
    הערה: המדיה הסלולרית של ליבוביץ ' מכילה 1 – 2 מ"מ Ca2 +, אשר נדרש כדי לשמור על שלמות של קישורי הקצה, ומכיל חומצות אמינו חיוניות, ויטמינים, ו פירובט נתרן כדי לשפר את בריאות התאים וההישרדות. סרום לא נכלל כדי להימנע השתנות ניסיוני בשל הרכב מוגדר גרוע שלה הפרעה פוטנציאלית עם dextran.
  3. המתת החסד postnatal-יום 6 (P6) עכברים על ידי עריפת ראש.
    הערה: עכברים בני 6 ימים עמידים במידה מסוימת להרדמה ממסים נדיפים. למרות שניתן להשתמשבחשיפות ממושכות (עד 50 דקות), מומלץ לעשות שימוש בשיטה פיזית משנית כדי להבטיח את המוות.
  4. השתמש במספריים לניתוח כדי להסיר את העור של הגולגולת על ידי ביצוע חתך שטחי מן הקדמי אל הקצה האחורי ולרוחב תעלות השמיעה החיצונית.
  5. מקפלים את העור לכיוון האף כדי לחשוף את הגולגולת (איור 2ב).
  6. לעשות חתך מאחור לקדמת הגולגולת ולרוחב קו העין (איור 2ב-C).
  7. הפרידו את הגולגולת בשני חצאים והסירו את המוח בעזרת מרית קטנה לחשיפת עצמות הרקה (איור 2ג-ד).
  8. עם מספריים קטנים, חותכים מסביב לעצמות. הזמן, ובבלו את הרקמה
  9. מניחים את שתי עצמות הזמן בצלחת 35 מ"מ ולוודא שהם מכוסים L15 מדיה (איור 2E).
    הערה: השלבים הבאים מתבצעים תחת הstereomicroscope. רקע שחור מסייע בדרך כלל להמחיש את הרקמה במהלך צעדי החיתוך העדינים.
  10. תחת מstereomicroscope מצויד העין שדה (כוח ההגדלה 10X (WF10X) ומקור חיצוני זרם חילופין (AC) הלוגן), להסיר את הרקמה המקיפה שבלול, תעלות בחצי עיגול, ושיווי הבמה איברים עם מלקחיים כירורגי (איור 2F).
  11. כדי לאפשר את תוספי ו-L15 מדיה להיכנס צינור שבלול, לבצע שני הנקב הגבול על כנימת הפצע, אחד על החלון העגול ואחרים באזור השבלול האפובית פסגה.
  12. הוסף 300 mL של מדיה L15 של ליבוביץ בכל טוב מ 9-היטב משקע הזכוכית.
  13. מניחים לפחות שלושה שבלול בגזור על כל באר.

3. תיוג דקטרן

  1. מהווים מחדש את תוספי בפתרון מלח מאוזנת של הנקס ללא Ca2 + ו-Mg2 + (hbss-cfm) בריכוז הסופי של 10 מ"ג/mL. פתרון מניות זה חייב להיות מצוטט בצינורות שחורים אטומים (מוגן מפני אור) ומאוחסן ב-30 ° צ' עד השימוש.
    הערה: השימוש בקוד ליזין לתיקון הוא קריטי לתוצאה מוצלחת של פרוטוקול זה.
  2. הכינו כל תוספי בריכוז הסופי של 2 מ"ג/ml ב 500 מ ל של ליבוביץ ' s L15 מדיה.
  3. הסר את המדיה מתוך השבלול והוסף את המדיה הL15 של ליבוביץ ' המכילה דקטרן של עניין בריכוז הסופי של 2 מ"ג/mL.
    הערה: למרות שחלק מערוצי ה-MET פתוחים במנוחה41,42, הדגירה של תוספי בוצעה עם טלטול עדין של האקסוצמחים כדי להגדיל את ההסתברות הפתוחה של הערוץ MET.
  4. דגירה בטמפרטורת החדר עבור 2 h עם טלטול עדין (25 סל ד) באמצעות שייקר תלת מימדי עם זווית מוטה של 25 °.
    הערה: תוספי המסומן בתווית להיות מוגן מפני אור כאשר הדבר אפשרי. כדי להגן על תוספי במהלך הדגירה 2 h, למקם את 9-היטב צלחת זכוכית בתוך התרבות תא P150 תבשיל עטוף רדיד אלומיניום.

4. הכנה לדוגמא להדמיה

  1. לאחר הדגירה עם dextran, לשטוף את הרקמה עבור 2 דקות פעמיים עם מדיה ופעם עם HBSS.
  2. מודטת הרקמה בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות עם 4% פאראפורמלדהיד בתמיסה מאוזנת מלח הנקס (HBSS).
    התראה: חשיפה פורמלדהיד יכול להיות מרגיז את העיניים, האף, ואת מערכת הנשימה העליונה. אצל אנשים מסוימים, חשיפה לעור חוזר פורמלדהיד יכול לגרום לרגישות שעלולה לגרום לדלקת עור אלרגית. פורמלדהיד הוא מסרטן אנושי ידוע והוא חשוד בסכנת הרבייה.
  3. במהירות ובעדינות לשטוף את רקמת קבוע פעמיים עם HBSS כדי להסיר את הפאראמפורמלדהיד.
    הערה: הסרת העצמות הטמפורלית אינה נחוצה בשלב ההתפתחותי זה של שבלול.
  4. הסר את הרצועה ספירלה ואת קרום tectorial עם מלקחיים תשר עדין כדי לנתח את האיבר של Corti (איור 2G).
  5. להסיר את כל חתיכות קטנות של רקמות ולשטוף את הרקמה עם HBSS.
  6. המחלחל את הרקמה ב 0.5% טריטון X-100 ב PBS המכיל phalloidin התווית באופן מבוקר (מצומדת ירוק או אדום בעת בדיקת ספיגת של TR-או fitc התווית dextran, בהתאמה) ב 1:200 דילול עבור 30 דקות תווית F-actin ולדמיין את ה סטריאוציליה מבוססת-actin.
  7. לשטוף את הרקמה 2 – 3 פעמים עבור 2 דקות בכל פעם עם מאגר HBSS כדי להסיר את עודפי טריטון ו phalloidin, ופעם עם PBS כדי להסיר את המלחים.
  8. הר האיבר של רקמות Corti על שקופית מיקרוסקופ ולכסות אותו עם הרכבה מדיה.
    הערה: כאשר אתה מבצע את הרקמה, ודא שהצד של הרקמה המכילה את תא השיער סטריאוסיליה פונה לתוך הכיסויים.
  9. הסר כל בועות פוטנציאליות שנוצרו במהלך התוספת של המדיה ההרכבה ולמנוע את הדור של בועות חדשות במהלך הצבת שמיכות.
    הערה: מנושף בעזרת פיפטה כל בועה שנוצרת בתוספת המדיה הכוללת. כדי למנוע בועות אוויר מלהיות לכוד תחת coverslip, במקום קצה של coverslip קרוב למדגם בזהירות ובאיטיות להקטין את הכיסויים על הרקמה באמצעות מלקחיים או מפית.
  10. כסו את הרקמה במדיה הכוללת שמיכות זכוכית (איור 2H).
    הערה: יעדים עם צמצם מספרי מעל 0.4 מיועדים להשתמש #1 שמיכות 0.5 (עובי 0.17 מ"מ). שימוש בcoverslip לא נכון יכול להיות השלכות חמורות על העוצמה והאיכות של התמונות.
  11. מודטת את הרקמה הטעונה לילה בטמפרטורת החדר כדי לאפשר למדיה לעלות להתייבש ולאחסן את השקופיות ב -4 ° צ' עד להדמיה.

5. רכישת תמונה ועיבוד תמונה

הערה: התמונות קונפוקלית וקד נלקחו עם lsm 880 מיקרוסקופ קונפוקלית וקד מצויד בגלאי airyscan ערוץ 32 ברזולוציה סופר (SR) מצב43 ו-63 x המטרה.

  1. להוסיף טיפה קטנה של שמן טבילה על המטרה.
  2. הניחו את שקופית המיקרוסקופ המכילה את דגימת הרקמה שנטענה בשלב המיקרוסקופ עם שמיכות זכוכית מול שמן טבילה.
  3. התמקד במדגם והגדר את פרמטרי ההדמיה באמצעות תוכנת רכישת התמונות.
  4. השתמש בקביעות רכישה זהות ובפרמטרים אופטימליים עבור רזולוציית x, y ו-z עבור כל ניסוי עצמאי. מערכת המוקד piezo מונחה נדרש כדי במהירות ובדיוק להעביר את המטרה בעת רכישת z-ערימת תמונות.
    הערה: כדי לדמות את כל האזור הרשמי של תאי השיער, לאסוף z-מחסנית של תמונות מתוך stereocilia לחצי הרשמי של גוף השיער באמצעות ההגדרות האופטימליות. חשוב לאסוף z מחסנית גדולה לאורך התא השיער כדי להבטיח את ההדמיה של חלקיקים כמו שלפוחית התינוק.
  5. השתמש בתוכנה לרכישת תמונות כדי לעבד את תמונות מיקוד raw באמצעות האלגוריתם השחזור התלת-ממדי של Airyscan עם הגדרות ברירת המחדל של המסנן האוטומטי.
  6. פתחו את התמונות הקונמיות בתוכנה לעיבוד תמונות כדי לכוונן את הבהירות והניגודיות, הוסיפו את סרגל הקנה מידה ומייצאים את התמונות לדמויות הסופיות.

תוצאות

הבחנו חזק וספציפי תיוג של תאי שיער לאחר הדגירה של 2h של האיבר של corti explants מסוג פראי לנטאל-יום 6 (P6) עכברים עם 3התווית של שלושהכאשר מסומן בדגל עם טקסס אדום (תוספי-TR) (איור 2א-ב). תיוג dextran נצפתה הן בתאי השיער הפנימיים והחיצוניים (IHC ו-OHC) באזורים הבזליים, האמצעיים והאפותיים ש...

Discussion

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע ניסויים ספיגה באיבר murine של האקסוצמחים corti עם 3 kda תוספי טקסס אדום. המטרה של שיטה זו היא לבדוק אם מולקולות גדולות יותר מאשר אחרים שנבדקו בעבר היו גם מסוגלים לתייג במפורש תאים שיער שמיעתי והחדיר דרך ערוץ MET. פרוטוקולים ניסיוניים דומים שימשו בעבר כדי להעריך את החדירות...

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

אנו מודים לוינסנט Schram מתוך המיקרוסקופיה וליבת ההדמיה לסיוע ברכישת תמונה מרכזית, ו-Tsg-Hui Chang לעזרה לא יסולא בפז בניהול המושבה ובטיפול בעכברים. מחקר זה נתמך על ידי תוכנית מחקר הפנים של NINDS, NIH, בת, MD, כדי K.J.S. א יהושע נתמך על ידי תוכנית מחקר הפנים של NINDS, NIH, ועל ידי רוברט Wenthold מלגת השתלמות מתוכנית המחקר התוך-קיר של ה-נדבך.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
#1.5 glass coverslips 18mmWarner Instruments64-0714
Alexa Fluor 488 PhalloidinThermoFisherA12379
Alexa Fluor 594 PhalloidinThermoFisherA12381
alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objectiveCarl Zeiss420780-9970-000
Amiloride hydrochlorideEMD MILLIPORE129876
Benchwaver 3-dimensional RockerBenchmarks scientificB3D5000
C57BL/6J wild-type micestrain 000664The Jackson Laboratory
Cell impermeant BAPTA tetrapotassium saltThermoFisherB1204
Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine FixableThermoFisherD1820
Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine FixableThermoFisherD1863
Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine FixableThermoFisherD3328
Formaldehyde Aqueous Solution EM GradeElectron microscopy science15710
HBSS, calcium, magnesium, no phenol redThermoFisher14025
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol redThermoFisher14170
Image J or FIJINIHhttp://fiji.sc/
Immersol 518F oil immersion mediaCarl Zeiss444970-9000-000
Leibovitz's L-15 Medium, GlutaMAX SupplementThermoFisher31415029
neomycin trisulfate salt hydrateSigmaN6386
PBS (10X), pH 7.4ThermoFisher70011069
Phalloidin-CF405MBiotium00034
ProLong Diamond antifade mounting mediaThermoFisherP36970
superfrost plus microscope slideFisherbrand22-037-246
Triton X-100SigmaT8787
Zen Black 2.3 SP1 softwareCarl Zeisshttps://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html

References

  1. Furness, D. N., Hackney, C. M. . The Structure and Composition of the Stereociliary Bundle of Vertebrate Hair Cells. , (2006).
  2. Barr-Gillespie, P. G. Assembly of hair bundles, an amazing problem for cell biology. Molecular Biology of the Cell. 26 (15), 2727-2732 (2015).
  3. Shotwell, S. L., Jacobs, R., Hudspeth, A. J. Directional sensitivity of individual vertebrate hair cells to controlled deflection of their hair bundles. Annals of the New York Academy of Sciences. 374, 1-10 (1981).
  4. Fettiplace, R., Kim, K. X. The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing. Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).
  5. Fettiplace, R. Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).
  6. Corey, D. P., Hudspeth, A. J. Ionic basis of the receptor potential in a vertebrate hair cell. Nature. 281 (5733), 675-677 (1979).
  7. Beurg, M., Evans, M. G., Hackney, C. M., Fettiplace, R. A large-conductance calcium-selective mechanotransducer channel in mammalian cochlear hair cells. The Journal of Neuroscience. 26 (43), 10992-11000 (2006).
  8. Geleoc, G. S., Lennan, G. W., Richardson, G. P., Kros, C. J. A quantitative comparison of mechanoelectrical transduction in vestibular and auditory hair cells of neonatal mice. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 264 (1381), 611-621 (1997).
  9. Kros, C. J., Rusch, A., Richardson, G. P. Mechano-electrical transducer currents in hair cells of the cultured neonatal mouse cochlea. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 249 (1325), 185-193 (1992).
  10. Ohmori, H. Mechano-electrical transduction currents in isolated vestibular hair cells of the chick. The Journal of Physiology. 359, 189-217 (1985).
  11. Gale, J. E., Marcotti, W., Kennedy, H. J., Kros, C. J., Richardson, G. P. FM1-43 dye behaves as a permeant blocker of the hair-cell mechanotransducer channel. The Journal of Neuroscience. 21 (18), 7013-7025 (2001).
  12. Lelli, A., Asai, Y., Forge, A., Holt, J. R., Geleoc, G. S. Tonotopic gradient in the developmental acquisition of sensory transduction in outer hair cells of the mouse cochlea. Journal of Neurophysiology. 101 (6), 2961-2973 (2009).
  13. Alharazneh, A., et al. Functional hair cell mechanotransducer channels are required for aminoglycoside ototoxicity. PLoS One. 6 (7), 22347 (2011).
  14. Marcotti, W., van Netten, S. M., Kros, C. J. The aminoglycoside antibiotic dihydrostreptomycin rapidly enters mouse outer hair cells through the mechano-electrical transducer channels. The Journal of Physiology. 567, 505-521 (2005).
  15. Corns, L. F., Jeng, J. Y., Richardson, G. P., Kros, C. J., Marcotti, W. TMC2 Modifies Permeation Properties of the Mechanoelectrical Transducer Channel in Early Postnatal Mouse Cochlear Outer Hair Cells. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 326 (2017).
  16. Kawashima, Y., Kurima, K., Pan, B., Griffith, A. J., Holt, J. R. Transmembrane channel-like (TMC) genes are required for auditory and vestibular mechanosensation. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 467 (1), 85-94 (2015).
  17. Kim, K. X., Fettiplace, R. Developmental changes in the cochlear hair cell mechanotransducer channel and their regulation by transmembrane channel-like proteins. The Journal of General Physiology. 141 (1), 141-148 (2013).
  18. Kurima, K., et al. TMC1 and TMC2 Localize at the Site of Mechanotransduction in Mammalian Inner Ear Hair Cell Stereocilia. Cell Reports. 12 (10), 1606-1617 (2015).
  19. Pan, B., et al. TMC1 and TMC2 are components of the mechanotransduction channel in hair cells of the mammalian inner ear. Neuron. 79 (3), 504-515 (2013).
  20. Kawashima, Y., et al. Mechanotransduction in mouse inner ear hair cells requires transmembrane channel-like genes. Journal of Clinical Investigation. 121 (12), 4796-4809 (2011).
  21. Beurg, M., Goldring, A. C., Fettiplace, R. The effects of Tmc1 Beethoven mutation on mechanotransducer channel function in cochlear hair cells. The Journal of General Physiology. 146 (3), 233-243 (2015).
  22. Corns, L. F., Johnson, S. L., Kros, C. J., Marcotti, W. Tmc1 Point Mutation Affects Ca2+ Sensitivity and Block by Dihydrostreptomycin of the Mechanoelectrical Transducer Current of Mouse Outer Hair Cells. The Journal of Neuroscience. 36 (2), 336-349 (2016).
  23. Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging. Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).
  24. Maeda, R., et al. Tip-link protein protocadherin 15 interacts with transmembrane channel-like proteins TMC1 and TMC2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (35), 12907-12912 (2014).
  25. Assad, J. A., Shepherd, G. M., Corey, D. P. Tip-link integrity and mechanical transduction in vertebrate hair cells. Neuron. 7 (6), 985-994 (1991).
  26. Medrano-Soto, A., et al. Bioinformatic characterization of the Anoctamin Superfamily of Ca2+-activated ion channels and lipid scramblases. PLoS One. 13 (3), 0192851 (2018).
  27. Ballesteros, A., Fenollar-Ferrer, C., Swartz, K. J. Structural relationship between the putative hair cell mechanotransduction channel TMC1 and TMEM16 proteins. Elife. 7, (2018).
  28. Pan, B., et al. TMC1 Forms the Pore of Mechanosensory Transduction Channels in Vertebrate Inner Ear Hair Cells. Neuron. 99 (4), 736-753 (2018).
  29. Kitajiri, S., Makishima, T., Friedman, T. B., Griffith, A. J. A novel mutation at the DFNA36 hearing loss locus reveals a critical function and potential genotype-phenotype correlation for amino acid-572 of TMC1. Clinical Genetics. 71 (2), 148-152 (2007).
  30. Makishima, T., Kurima, K., Brewer, C. C., Griffith, A. J. Early onset and rapid progression of dominant nonsyndromic DFNA36 hearing loss. Otology & Neurotology. 25 (5), 714-719 (2004).
  31. Noguchi, Y., et al. Multiple quantitative trait loci modify cochlear hair cell degeneration in the Beethoven (Tmc1Bth) mouse model of progressive hearing loss DFNA36. Genetics. 173 (4), 2111-2119 (2006).
  32. Vreugde, S., et al. Beethoven, a mouse model for dominant, progressive hearing loss DFNA36. Nature Genetics. 30 (3), 257-258 (2002).
  33. Hulstrom, D., Svensjo, E. Intravital and electron microscopic study of bradykinin-induced vascular permeability changes using FITC-dextran as a tracer. The Journal of Pathology. 129 (3), 125-133 (1979).
  34. Mayhan, W. G., Heistad, D. D. Permeability of blood-brain barrier to various sized molecules. American Journal of Physiology. 248 (5), 712-718 (1985).
  35. Makarow, M. Endocytosis in Saccharomyces cerevisiae: internalization of alpha-amylase and fluorescent dextran into cells. The EMBO Journal. 4 (7), 1861-1866 (1985).
  36. Clayton, E. L., Cousin, M. A. Quantitative monitoring of activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicle membrane by fluorescent dextran imaging. Journal of Neuroscience Methods. 185 (1), 76-81 (2009).
  37. Allman, B. L., Keniston, L. P., Meredith, M. A. Adult deafness induces somatosensory conversion of ferret auditory cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (14), 5925-5930 (2009).
  38. Warr, W. B., Boche, J. B., Neely, S. T. Efferent innervation of the inner hair cell region: origins and terminations of two lateral olivocochlear systems. Hearing Research. 108 (1-2), 89-111 (1997).
  39. Hu, B. H., Zheng, G. L. Membrane disruption: an early event of hair cell apoptosis induced by exposure to intense noise. Brain Research. 1239, 107-118 (2008).
  40. Zheng, G., Hu, B. H. Cell-cell junctions: a target of acoustic overstimulation in the sensory epithelium of the cochlea. BMC Neuroscience. 13, 71 (2012).
  41. Beurg, M., Nam, J. H., Chen, Q., Fettiplace, R. Calcium balance and mechanotransduction in rat cochlear hair cells. Journal of Neurophysiology. 104 (1), 18-34 (2010).
  42. Johnson, S. L., Beurg, M., Marcotti, W., Fettiplace, R. Prestin-driven cochlear amplification is not limited by the outer hair cell membrane time constant. Neuron. 70 (6), 1143-1154 (2011).
  43. Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), (2017).
  44. Gil-Loyzaga, P., Brownell, W. E. Wheat germ agglutinin and Helix pomatia agglutinin lectin binding on cochlear hair cells. Hearing Research. 34 (2), 149-155 (1988).
  45. Santi, P. A., Anderson, C. B. Alcian blue staining of cochlear hair cell stereocilia and other cochlear tissues. Hearing Research. 23 (2), 153-160 (1986).
  46. Slepecky, N., Chamberlain, S. C. The cell coat of inner ear sensory and supporting cells as demonstrated by ruthenium red. Hearing Research. 17 (3), 281-288 (1985).
  47. Rusch, A., Kros, C. J., Richardson, G. P. Block by amiloride and its derivatives of mechano-electrical transduction in outer hair cells of mouse cochlear cultures. The Journal of Physiology. 474 (1), 75-86 (1994).
  48. Zhao, Y., Yamoah, E. N., Gillespie, P. G. Regeneration of broken tip links and restoration of mechanical transduction in hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (26), 15469-15474 (1996).
  49. Indzhykulian, A. A., et al. Molecular remodeling of tip links underlies mechanosensory regeneration in auditory hair cells. PLoS Biol. 11 (6), 1001583 (2013).
  50. Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).
  51. West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109 (6), 2731-2739 (1989).
  52. Park, S., et al. tmie Is required for gentamicin uptake by the hair cells of mice. Comp Med. 63 (2), 136-142 (2013).
  53. Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. The Journal of Neuroscience. 23 (10), 4054-4065 (2003).
  54. Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells. The Journal of Neuroscience. 27 (50), 13890-13902 (2007).
  55. Beurg, M., et al. Variable number of TMC1-dependent mechanotransducer channels underlie tonotopic conductance gradients in the cochlea. Nature Communications. 9 (1), 2185 (2018).
  56. Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), e53561 (2016).
  57. Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research. Journal of Visualized Experiments. (124), e55704 (2017).
  58. May-Simera, H. Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (108), e53559 (2016).
  59. Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic Culture of Neonatal Murine Inner Ear Explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
  60. Granath, K. A. Solution properties of branched dextrans. Journal of Colloid Science. 13 (4), 20 (1958).
  61. Molecular Probes, I.D.T. . Product information on Dextran Conjugates. , (2006).
  62. Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), 41 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

156

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved