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摘要

我们描述了一种通过农业细菌根诱导毛茸茸的根的方法 - 在塔特里麦（法戈皮鲁姆塔塔里库姆）中介导的转化。这可用于研究塔塔麦中继发代谢物的基因功能和产生，用于任何基因转化，或用于改良后的其他药用植物。

摘要

塔塔麦 （TB） -Fagopyrum 榻地（L.） Gaertn] 拥有各种生物和药理活性，因为它含有丰富的二次代谢物，如黄酮类化合物，特别是鲁氏素。全球逐渐利用植物原体诱导药用植物中的毛根，以研究基因功能，提高继发代谢物的产量。在这项研究中，我们描述了一种在结核病中产生由根介导的毛根的详细方法。在7-10天时选择科蒂莱顿和低血节轴作为外植体，并感染携带二进制载体的A.根茎，这诱发了1周后出现的令人毛骨悚然的毛根。根据形态、抗性选择（卡那霉素）和记者基因表达（绿色荧光蛋白）确定产生的毛根转化。随后，转换后的毛根根据需要自我传播。同时，骨髓性细胞病（MYB）转录因子FtMYB116，利用A.根细胞介导的毛根转化为结核病基因组，以验证FtMYB116在合成黄酮类化合物中的作用。结果表明，FtMYB116显著推广了黄酮类相关基因的表达和黄酮类化合物（鲁汀和奎西汀）的产生率（p < 0.01），表明A.rhizo基因介导的毛根可以作为研究基因功能和次生代谢物产生的有效替代工具。本研究中描述的生成毛根的详细分步协议可在调整后用于任何基因转化或其他药用植物。

引言

塔特里麦 （TB） （法戈皮鲁姆塔塔里库姆（L.） 盖尔滕） 是属于法戈皮鲁姆属和家族 Polygonaceae1的二恶二甲。结核病作为一种中药同源性食品，由于其独特的化学成分和多种生物活动，对疾病产生了浓厚的兴趣。结核病主要富含碳水化合物、蛋白质、维生素和类胡萝卜素，以及多酚，如酚酸和黄酮类化合物1。黄酮类化合物的各种生物和药理活性，包括抗氧化、抗高血压2、抗炎以及抗癌和抗糖尿病特性，已被证明有3种。

植物杆菌是一种土壤细菌，通过感染伤口部位44、5，5有助于几种高等植物，特别是二叶草病的发展。这个过程是由诱导（Ri）质粒55、66中的T-DNA转移开始的，通常伴随着来自Ri质粒的外源基因的整合和表达以及产生毛根表型7的后续步骤。A. 根茎 -介导的转基因毛根，作为植物生物技术领域的一种强大工具，由于其稳定和高生产率和容易在短时间内获得，得到了最广泛的应用。此外，由A.根茎诱导的毛根有效地区分其拉皮性根发育和高分枝生长在无激素介质8。它们可用于多个研究领域，包括人工种子生产、根结核研究，以及研究与其他生物（如霉菌、线虫和根病原体77、9）9的相互作用。此外，毛茸茸根转化培养物已被广泛用作研究生化途径和化学信号的实验系统，并生产用作药品、化妆品和食品添加剂的植物二次代谢物8,8，10。在野生型毛茸茸的根部合成的有价值的二次代谢物，包括多叶生物碱、异丙酮、龙烷生物碱、二烯醇和黄酮类化合物，在众多物种中已经研究了几十年，如Panax人参11中的人参、阿美马伊1212中的科马林和TB2中的酚类化合物。

毛根已经产生使用A.根基因在79种植物从27个家族14。例如，在大豆15，16，16萨尔维亚17，普伦巴戈印度18，莲花雅波尼库斯19，和菊花（Cichorium intybus L.）中报道了A.rhizo基因介导的毛根转化。1520.结核病毛根转化也已调查2.关于由A.根基因介导的毛状根的开发，很少详细的协议，要么携带二进制向量。例如，Sandra等人21日介绍了一种在野生型芽中维持的转基因马铃薯毛根生产方法。完全发育的毛根可以在将A.rhizo基因注射到马铃薯植物的茎间5-6周后可视化。另一项研究也报道了由A.根茎诱导的转基因毛根系统，该基因含有黄麻中的gusA报告基因（科丘齐斯帽状体L.）。22.此外，Supaart等人23利用表达载体pBI121转化的转基因烟草毛根获得，该基因携带β1-四氢大麻素酸（THCA）合成酶的基因，以产生THCA。

然而，有效生成毛茸茸的根部转化的分步过程，特别是在结核病中，其表现相对较少。在这项研究中，我们描述了一个详细的协议，使用携带报告基因（GFP），选择性标记（Kan）和感兴趣的基因（b4，从我们组识别，但未发表的基因从基本螺旋环螺旋（bHLH）家族）产生毛茸茸的根基因转化在结核病。实验持续了5-6周，从种子的接种到毛茸茸的根的生成，涉及外植制剂、感染、凝育、亚培养和随后的传播。此外，A. 根茎基因包含携带骨髓性细胞变核转录因子116（FtMYB116）的二FtMYB116元质粒，用于确定FtMYB116能否促进在结核病基因和代谢水平上通过TB毛根转化积累类黄酮，尤其是鲁氏素。FtMYB116是一种光诱导转录因子，调节不同光照条件下鲁因的合成。黄酮合成酶（CHS），黄酮-3-羟基酶 （F3H），黄酮-3'-羟基酶 （F3'H）和黄酮醇合成酶 （FLS）24是参与鲁金生物合成代谢途径的关键酶.因此，本研究证明了FtMYB116在TB毛根的过度表达，关键酶基因的表达，以及鲁汀和其他黄酮类化合物（如奎西汀）的含量。

研究方案

本研究中使用的结核病被命名为BT18，它起源于山西省农科院小杂粮研究中心培育的"金乔二号"品种。该协议的主要步骤如图1所示。

注:快速操作与植物相关的操作，并尽可能关闭培养皿，以避免枯萎和污染。除非另有说明，所有外植株孵育是在14小时光和10小时暗光期25°C下进行的。除非另有说明，否则所有与植物或细菌有关的操作都是在层压流量罩无菌条件下进行的。表1提供了A.根茎和体外植物培养物的所有介质成分。调整pH值后，所有介质在120°C下进行20分钟的自动固化。凝固介质通过将25 mL的介质填充到直径为9厘米的培养皿中，使其凝固。

注意:将所有转基因细菌和植物放入适当的废物容器中。将所有危险化学品放在烟盒中，并存放在危险废物容器中。

1. 结核病外泄制剂

  1. 结核病种子的制备
    1. 选择在温度低于+20°C下保存不超过2年的丰满和未损坏的结核病种子（图1A1）。
    2. 在28°C下将种子浸入水中约20分钟，以便种子涂层很容易被剥落（图1A2）。如有必要，使用剪刀在种子上切开一个槽，以方便剥皮。
  2. 结核病种子的灭菌
    1. 将 100~200 个去皮种子放入 100 mL 消毒锥形瓶中。
    2. 使用75%乙醇对种子进行30s消毒。
    3. 用5%次氯酸钠代替乙醇，消毒15分钟。
      注:在灭菌不足的情况下，使用浓度为1克/L的二氯化汞消毒可作为替代灭菌剂，以取代次氯酸钠。
      注意:二氯化汞是危险的，不是环境友好型材料。在熏蒸柜中操作，如果在任何情况下使用二氯化汞，则将其放入危险废物容器中。
    4. 倒出次氯酸钠。
    5. 使用无菌脱离子水清洗种子 5 次。
    6. 用无菌的纸把种子擦干。
  3. 结核幼苗的制备
    1. 在300mL植物组织培养瓶中制备50 mL Murashige和Skoog（MS）基底介质（1962年），辅以30克/升蔗糖和7克/升铝粉（MSSA）（表1）。
    2. 在高压灭菌前，将 pH 调整为 5.8。
    3. 每瓶MSSA介质均匀分配10个种子。
    4. 在光线条件下在25°C~1°C下在培养室中发芽种子7~10天。
  4. 无菌外植的准备
    1. 当展开2块结核时，选择结核的强健幼苗（图1C）。
    2. 切断树苗从根部（图1C红破头箭头），避免与介质接触。
    3. 把它们放在无菌的培养皿中。
    4. 将下科基切成 0.8⁄1 厘米段，并将小乳片剪切成约 0.5 厘米的碎片。
    5. 在24小时的光照条件下，在MSSA介质上预栽这些外植。
    6. 将它们转移到100mL消毒锥形瓶中，现在可以感染。

2. 制备A.根基因进行转化

注:A. 根基因菌株ACCC10060由药用植物开发研究所提供，并保存在+80°C。A. 根茎基因与二进制载体pK7GWIWG2D（II）进行转化，该载体含有T-DNA携带B4基因，附带GFP作为指标基因，Kan抗性基因作为可选择标记。该基因b4是转录因子bHLH家族的成员，尚未发表。为了评估结核病毛状根的潜力，A. 根茎基因与含有MYB116基因的二元载体pK7WG2D进行转化，以研究其在基因表达水平和代谢分析下对二次代谢物（如黄酮类物）产生的影响。活性A.根基因应做好充分准备，同时与外植。

  1. A. 根基因的激活
    1. 冰上解冻的根
    2. 浸入细菌，并均匀地将它们线到酵母曼尼醇介质 （YEB）， 辅以 15 g/L agar 粉末， 50 毫克/L 里法霉素， 和 50 毫克/L 异种霉素 （YEBARS， pH 7.0）.
    3. 在28°C下孵育细菌12~16小时。
    4. 选择单克隆殖民地，并在另一种培养皿中以上述相同的方式进行栽培。
    5. 选择单克隆菌落，并在含有20 mL YEB介质的100 mL消毒锥形瓶中培养它们，辅以50mg/L里福霉素和50mg/L异种霉素（YEBRS，pH 7.0），在28°C和200 rpm，16~18小时，直到OD600值达到2.0。
    6. 在28°C下与另一100 mL锥形瓶中孵育2%~4%的上述培养物，在28°C下含有20mL的YEBRS介质，在4-5小时内将200rpm孵育，直到OD600值达到约0.5（图1D）。

3. 结核病外植株的感染和筛查

注:该协议的目标是获得基因转化的毛茸茸的根。野生型根作为负对照来评估转基因表达。在此协议中，A. 根茎基因被转换与二进制载体pK7WG2D携带FtMYB116或pK7GWIWG2D（II）携带b4基因提前。

  1. A. 根基因的重新悬浮
    1. 将步骤 2.1.6 中获得的培养体转移到 50 mL 消毒离心管中。
    2. 在 4，000 x g下旋转 10 分钟，在 20 °C 下。
    3. 去除上清液，用MS介质重新悬浮细菌颗粒，辅以30克/升蔗糖和300μM醋酸酮（AS）（MSSAS，pH 5.8）至OD600 ± 0.2。
  2. 外植感染
    1. 将步骤 3.1.3 中获得的细菌悬浮液注入锥形瓶中，其中包含步骤 1.4.6 中制备的外植株 10 分钟（图 1E）。
    2. 拿出外植，用无菌的纸把它们晒干。

4. 与A. 根茎的外植共同培养

  1. 将无菌 9 厘米直径的过滤纸放在 MS 介质上，该滤纸使用 7 g/L agar 粉末进行凝固，并辅以 30 g/L 蔗糖和 100 μM AS（MSSAAS 介质，pH 5.2）。
  2. 在黑暗中将滤纸覆盖在25°C下3天（图1F）。

5. 归纳和选择性培养

  1. 在MSSA介质上放置约20种受感染的外植剂，辅以500毫克/升的锥形和50毫克/L卡那霉素（Kan）（MSSACK，pH 5.8）（图1G）。
  2. 在25°C~1°C的光照条件下垂直孵育它们。毛茸茸的根发生在孵育后大约1周（图1H黑破折号箭头指示毛茸茸的根发生）。
    注:如有必要，每 15 天更换一次 MSSACK 介质。

6. 培养结核病毛根

注:这个程序旨在收获充满活力的毛茸茸的根。定期观察繁殖过程中毛根的生长，并及时清除受污染和灭活的根。如有必要，重复以下步骤以传播更多毛茸茸的根。从亚耕到收获大约需要10-14天。

  1. 选择显示白色外观和快速生长的毛茸茸的根。
  2. 把它们切成2-3厘米的碎片。
  3. 清楚地将它们编号在干净的长凳上。
  4. 将它们培养在含有5 mL MS介质的100 mL消毒锥形瓶中，辅以30克/升蔗糖和50毫克/L Kan（MSSK，pH 5.8），在黑暗中25°C的旋转速度为80 rpm，直到它们扩散到烧瓶底部（图1I）。

7. 确定转化的毛根和保护

注:可根据形态和基因水平的方面来识别转化的毛根。识别也可以根据本协议未涵盖的毛根基因组和阻力进行。本程序主要侧重于报告基因和目标基因的鉴定。

  1. 去除黄褐色和受污染的毛根，选择白色外观的根。
  2. 评估蓝色/光双紫外线转光器下是否有绿色荧光。
  3. 选择在编号管中表现出强荧光信号的毛茸茸的根部，或使用标记的锡箔包裹后，用吸水纸将其晾干。
  4. 在液氮中对它们进行嗜血，然后将所有收获储存在+80°C，以便进一步调查。
  5. 基因鉴定
    1. 将0.1克毛根三化成液氮中的细粉。
    2. 根据植物基因组DNA试剂盒制造商的指示，使用经过修饰的溴二乙二甲苯（CTAB）方法制备结核病独立转基因系的基因组DNA。
    3. 使用表2所列的100纳克基因组DNA模板和引物执行聚合酶链反应（PCR）。
    4. 执行放大周期如下:在94°C下预化5分钟，在94°C下变性30秒，引底剂在55°C下退火30秒，引素在72°C延长30秒。经过36个周期，并在72°C下完成最后延长步骤10分钟，在1%的琼脂胶凝胶上分析扩增产物。
    5. 用核酸染色染色凝胶，并在紫外线下可视化。

结果

农业细菌根- 介导的结核毛根转化
这项研究描述了为利用A.根茎获得基因转化的毛根而建立的分步协议。从结核病种子的接种到已鉴定的毛根的收获，大约需要5-6周的时间，图1（A-H）描述了一些关键步骤。A-H简单地说，消毒的壳种子接种（图1B），以实现更快的无菌发芽。A. 根茎（

讨论

结核病已用于与遗传和代谢5,水平1，2，5，27，282,的继发代谢物有关的几项研究。,27128毛茸茸的根培养作为代谢物产生的独特来源，在代谢工程29中起着关键作用，并可用于通过插入相关基因来改变代谢途径。Kim等人2最初介绍建立结核毛根...

披露声明

提交人没有利益冲突可披露。

致谢

这项工作得到了中央公益性研究机构ZXKT17002基础研究基金的支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
2*Taq PCR MasterMixAidlab, ChinaPC0901
Agar powderSolarbio Life Science, Beijing, ChinaA8190
Applied Biosystems 2720 thermo cyclerThermoFisher Scientific, USA37834
ASSolarbio Life Science, Beijing, ChinaA8110Diluted in DMSO, 100 mM
binary vectorsThermoFisher Scientific (invitrogen), US/pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II)
Cefotaxime,sodiumSolarbio Life Science, Beijing, ChinaC8240Diluted in Water, 200 mg/mL
CF15RXII high-speed microHitachi, JapanNo. 90560201
Diposable Petri-dishGuanghua medical instrument factory, Yangzhou, China/
DYY-6C electrophoresis apparatusBjliuyi, Beijing ChinaECS002301
EASYspin Plus Plant RNA KitAidlab, ChinaRN38
ELGA purelab untra bioscienceELGA LabWater, UK82665JK1819
Epoch Microplate Spectrophotometerbiotek, US/
Gateway BP/LR reaction enzymeThermoFisher Scientific (invitrogen), US11789100/11791110
HYG-C multiple-function shakerSuzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China/
KanSolarbio Life Science, Beijing, ChinaK8020Diluted in Water, 100 mg/mL
MLS-3750 Autoclave sterilizerSanyo, Japan/
MS salts with vitaminsSolarbio Life Science, Beijing, ChinaM8521
NaClSolarbio Life Science, Beijing, ChinaS8210
Other chemicals unstatedBeijing Chemical Works, Chinaethanol, mercury bichloride, etc.
PHS-3C pH meterShanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, Chinaa008
Plant Genomic DNA KitTIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTDDP305
RifampinSolarbio Life Science, Beijing, ChinaR8010Diluted in DMSO, 50 mg/mL
SpectinomycinSolarbio Life Science, Beijing, ChinaS8040Diluted in Water, 100 mg/mL
SucroseSolarbio Life Science, Beijing, ChinaS8270
Trans2K DNA MarkerTransGen Biotech, Beijing, ChinaBM101-01
TryptoneSolarbio Life Science, Beijing, ChinaLP0042
Whatman diameter 9 cm Filter paperHangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd/
Yeast Extract powderSolarbio Life Science, Beijing, ChinaLP0021

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