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Resumo

Descrevemos um método de indução de raízes peludas pela transformação mediada pelo Agrobacterium rhizogenesno trigo-sarraceno tartary(Fagopyrum tataricum). Isso pode ser usado para investigar funções genéticas e produção de metabólitos secundários em trigo sarraceno tartary, ser adotado para qualquer transformação genética, ou usado para outras plantas medicinais após a melhoria.

Resumo

O trigo-sarraceno tartary (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] possui várias atividades biológicas e farmacológicas porque contém metabólitos secundários abundantes, como flavonoides, especialmente rutina. Os rizógeness agrobacterium têm sido gradualmente usados em todo o mundo para induzir raízes peludas em plantas medicinais para investigar funções genéticas e aumentar o rendimento de metabólitos secundários. Neste estudo, descrevemos um método detalhado para gerar raízes peludas mediadas por A. Rhizogenesna TB. Cotyledons e eixo hipocotyledonary em 7-10 dias foram selecionados como explants e infectados com A. rizogenes carregando um vetor binário, que induziu raízes peludas aveniosas que apareceram após 1 semana. A transformação da raiz peluda gerada foi identificada com base na morfologia, seleção de resistência (kanamicina) e expressão genética de repórter (proteína fluorescente verde). Posteriormente, as raízes peludas transformadas foram auto-propagadas conforme necessário. Enquanto isso, um fator de transcrição da mieloblastose (MYB), FtMYB116, foi transformado no genoma da TB usando as raízes peludas mediadas por A. rhizogenespara verificar o papel do FtMYB116 na sintetização dos flavonoides. Os resultados mostraram que a expressão de genes flavonoides e o rendimento de compostos flavonoides (rutina e quercetina) foram significativamente (p < 0,01) promovidos por FtMYB116, indicando que as raízes peludas mediadas por A. rhizogenespodem ser usadas como uma ferramenta alternativa eficaz para investigar as funções genéticas e a produção de metabólitos secundários. O protocolo detalhado passo a passo descrito neste estudo para a geração de raízes peludas pode ser adotado para qualquer transformação genética ou outras plantas medicinais após o ajuste.

Introdução

O trigo-sarraceno tartary (TB)(L.) Gaertn é um tipo de dicotyledon pertencente ao gênero Fagopyrum e à família Polygonaceae1. Como um tipo de alimento homólogo da medicina chinesa, a TB vem recebendo considerável interesse devido à sua composição química distinta e às diversas bioatividades contra doenças. A TB é principalmente rica em carboidratos, proteínas, vitaminas e carotenóides, bem como em polifenóis como ácidos fenólicos e flavonoides1. Várias atividades biológicas e farmacológicas de flavonoides, incluindo antioxidativo, anti-hipertensivo2, e anti-inflamatório, bem como propriedades anticancerígenas e antidiabéticas, foram demonstradas3.

Agrobacterium rhizogenes é uma bactéria do solo que contribui para o desenvolvimento de doenças radiculares peludas em várias plantas superiores, especialmente dicotyledons, infectando locais de feridas4,5. Este processo é iniciado pela transferência do T-DNA no plasmídeo 55,6 e é comumente acompanhado pela integração e expressão de um gene exógeno do plasmídeo Ri e os passos subsequentes de geração do fenótipo da raiz peluda7. A. rhizogenes-mediadas raízes transgênicas peludas, como uma poderosa ferramenta no campo da biotecnologia vegetal, têm sido mais amplamente utilizadas devido à sua estabilidade e alta produtividade e fácil obtenção em um curto período de tempo. Além disso, as raízes peludas induzidas por A. rizógenes são eficientemente distinguidas pelo seu desenvolvimento de raiz plagiota e crescimento altamente ramificado em um meio livre dehormônios 8. Eles podem ser usados em diversos campos de pesquisa, incluindo produção de sementes artificiais, pesquisa de nódulos radiculares e no estudo das interações com outros organismos, como fungos micorrízicos, nematóides e patógenos radiculares7,9. Além disso, culturas de transformação de raízes peludas têm sido amplamente utilizadas como um sistema experimental para investigar as vias bioquímicas e a sinalização química e produzir metabólitos secundários vegetais que são usados como fármacos, cosméticos e aditivos alimentares8,10. Os valiosos metabólitos secundários, incluindo alcalóides indobes, aconitos, alcalóides tropanos, terpenóides e flavonoides, sintetizados em raízes peludas do tipo selvagem têm sido investigados por várias décadas em inúmeras espécies, como ginsenoside em Panax ginseng11, coumarine em Ammi majus12, e compostos fenólicos na TB2,13.

Raízes peludas foram produzidas usando A. rizogenes em 79 espécies de plantas de 27 famílias14. Por exemplo, a transformação da raiz peluda mediada por A. rhizogenesfoi relatada na soja15,16, Salvia17, Plumbago indica18, Lotus japonicus19, e chicória(Cichorium intybus L.) 20. A transformação das raízes peludas da TB também foi investigada2. Poucos protocolos detalhados estão disponíveis em relação ao desenvolvimento de raízes peludas mediadas por A. rhizogenes ou carregando um vetor binário ou não. Por exemplo, Sandra et al.21 introduziram um método de produção de raízes transgênicas de batata peluda sustentadas em brotos do tipo selvagem. As raízes peludas totalmente desenvolvidas poderiam ser visualizadas 5-6 semanas após a injeção de A. rhizogenes carregando o gene gus reporter para o caule internode plantas de batata. Outro estudo também havia relatado um sistema de raiz peluda transgênica induzido por A. rhizogenes que abrigava o gene do repórter gusA na juta(Corchorus capsularis L.) 22. Além disso, Supaart et al.23 obtiveram raízes transgênicas de tabaco peludo usando A. rhizogenes transformados com a expressão vetorial pBI121 carregando o gene de Δ1-tetrahidrocanabinolic acid (THCA) para produzir THCA.

No entanto, um processo passo a passo para uma geração eficaz de transformação de raízes peludas, especialmente na TB, tem sido relativamente menos demonstrado. Neste estudo, descrevemos um protocolo detalhado usando A. rhizogenes carregando o gene do repórter(GFP),um marcador seletivo(Kan),e um gene de interesse(b4,um gene identificado do nosso grupo, mas um gene inédito da família hélice-loop-hélice básica (bHLH)para gerar transformação genética de raiz peluda na TB. O experimento durou de 5 a 6 semanas, desde a inoculação das sementes até a geração de raízes peludas, envolvendo a preparação explante, infecção, coculturing, subcultura e posterior propagação. Além disso, A. rizogenes contendo um plasmídeo binário que transporta o transgene de TB do fator de transcrição da mieloblastose 116 (FtMYB116) foi usado para determinar se ftMYB116 pode promover o acúmulo de flavonoides, particularmente rutina, em TB no nível genético e metabólico através da transformação da raiz peluda da TB. FtMYB116, que é um fator transcricional induzido pela luz, regula a síntese de rutin em diferentes condições de luz5. Calcone synthase(CHS),flavanone-3-hydroxylase(F3H),flavonoide-3'-hydroxylase(F3'H),e flavonol synthase(FLS)24 são enzimas-chave envolvidas na via metabólica da biossíntese rutina. Portanto, este estudo demonstra a superexpressão de FtMYB116 em raízes peludas da TB e a expressão de genes enzimáticos chave, bem como o conteúdo de rutin e outros flavonoides como a quercetina.

Protocolo

A TB utilizada neste estudo foi nomeada como BT18, que se originou da raça "JinQiao No.2" cultivada pelo Centro de Pesquisa de Pequenos Grãos Diversos da Academia shanxi de Ciências Agrícolas. Os passos primários deste protocolo são ilustrados na Figura 1.

NOTA: Opere rapidamente a manipulação relacionada às plantas e, quando possível, mantenha as placas de Petri fechadas para evitar murchas e contaminação. Salvo disposição em contrário, todas as incubações de explante foram conduzidas a condição de uma luz de 14 horas e um período de fotoperíodo escuro de 10 horas a 25 °C. Salvo indicação em contrário, todas as operações relacionadas com explantas ou bactérias foram realizadas condições assépticas em uma capa de fluxo laminar. Todos os ingredientes de mídia para A. rhizogenes e culturas de plantas in vitro são fornecidos na Tabela 1. Após o ajuste do pH, todas as mídias foram autoclaved a 120 °C por 20 min. As mídias solidificadas foram preparadas preenchendo 25 mL de meio em uma placa de Petri de 9 cm de diâmetro e permitindo que ela se solidifique.

ATENÇÃO: Deposite todas as bactérias e plantas geneticamente modificadas no recipiente de resíduos apropriado. Opere todos os produtos químicos perigosos em um armário de fumaça e deposite-os no recipiente de resíduos perigosos.

1. Preparação de explantas de TB

  1. Preparação de sementes de TB
    1. Selecione sementes de TB gordurosas e não danificadas(Figura 1A1)que tenham sido preservadas a uma temperatura inferior a 20 °C por no mais de 2 anos.
    2. Mergulhe as sementes em água a 28 °C por aproximadamente 20 min para que a camada de sementes possa ser facilmente descascada(Figura 1A2). Se necessário, use uma tesoura para cortar uma ranhura nas sementes para facilitar o peeling.
  2. Esterilização de sementes de TB
    1. Coloque 100-200 sementes descascadas em um frasco cônico esterilizado de 100 mL.
    2. Desinfete as sementes usando 75% de etanol para 30 s.
    3. Substitua o etanol por 5% de hipoclorito de sódio e desinfete por 15 min.
      NOTA: A desinfecção utilizando bicloreto de mercúrio a uma concentração de 1 g/L por 8 min pode ser usada como esterilizador alternativo para substituir o hipoclorito de sódio em qualquer caso de esterilização inadequada.
      ATENÇÃO: O bicloreto de mercúrio é perigoso e não é um material favorável ao meio ambiente. Opere-o no armário de fuming e deposite-o no recipiente de resíduos perigosos, se o bicloreto de mercúrio for usado em qualquer caso.
    4. Despeje o hipoclorito de sódio.
    5. Lave as sementes com água desionizada estéril 5 vezes.
    6. Borreve as sementes com um papel bibuloso estéril.
  3. Preparação de mudas de TB
    1. Prepare 50 mL Murashige e Skoog (MS) meio basal (1962) complementado com 30 g/L de sacarose e 7 g/L em pó de ágar (MSSA) (Tabela 1) em uma garrafa de cultura de tecido vegetal de 300 mL.
    2. Ajuste o pH para 5,8 antes de autoclaving.
    3. Distribua 10 sementes uniformemente por garrafa de meio MSSA.
    4. Germinar as sementes em uma sala de cultura a 25 °C ± 1 °C a condição de luz por 7-10 dias.
  4. Preparação de explantas estéreis
    1. Selecione mudas robustas de TB(Figura 1C),quando as 2 peças de cotiledons forem desdobradas.
    2. Corte as mudas das raízes(Figura 1C pontas de flecha vermelhas),evitando o contato com o meio.
    3. Coloque-os em uma placa de Petri estéril.
    4. Corte os hipocotyls em segmentos de 0,8 a 1 cm e corte os cotiledons em aproximadamente 0,5 cm de pedaços.
    5. Pré-cultura estas explantes no meio MSSA a condição de luz por 24 horas.
    6. Transfira-os para um frasco cônico esterilizado de 100 mL, que agora está pronto para infecção.

2. Preparação de A. rhizogenes para transformação

NOTA: A cepa A. rhizogenes ACCC10060 foi gentilmente fornecida pelo Instituto de Desenvolvimento de Plantas Medicinais e preservada a -80 °C. A. rhizogenes foi transformado com o vetor binário pK7GWIWG2D (II) que abriga um T-DNA carregando o gene b4 acompanhando um GFP como gene indicador e o gene de resistência Kan como um marcador selecionável. O gene b4 é um membro da família bHLH fator de transcrição, que ainda não foi publicado. Para avaliar o potencial das raízes peludas da TB, A. rizogenes foi transformado com o vetor binário pK7WG2D contendo o gene MYB116 para investigar seu efeito na produção de metabólitos secundários, como flavonoides no nível de expressão genética e por análises metabólicas. Ativado A. rhizogenes deve estar bem preparado ao mesmo tempo com as explantas.

  1. Ativação de A. rhizogenes
    1. Descongele A. rhizogenes no gelo
    2. Mergulhe as bactérias e forre-as uniformemente no meio manitol de levedura (YEB) suplementado com pó de ágar de 15 g/L, 50 mg/L de rifampicina e 50 mg/L de espectinomicina (YEBARS, pH 7.0).
    3. Incubar a bactéria a 28 °C por 12-16 horas.
    4. Escolha uma colônia monoclonal e a cultigue em outra placa de Petri da mesma maneira descrita acima.
    5. Selecione colônias monoclonais e as cultura em um frasco cônico esterilizado de 100 mL contendo 20 mL de meio YEB suplementado com rifampicina de 50 mg/L e 50 mg/L de espectinomicina (YEBRS, pH 7.0) a 28 °C e 200 rpm por 16-18 h até que o valor deOD 600 atinja 2.0.
    6. Incubar 2%-4% da cultura acima mencionada em outro frasco cônico de 100 mL contendo 20 mL de meio YEBRS a 28 °C e 200 rpm por 4-5 h até que o valor deOD 600 atinja aproximadamente 0,5(Figura 1D).

3. Infecção e triagem de explantas de TB

NOTA: O objetivo deste protocolo é obter raízes peludas geneticamente transformadas. As raízes do tipo selvagem foram utilizadas como controle negativo para avaliar a expressão transgênica. Neste protocolo, A. rhizogenes foi transformado com vetor binário pK7WG2D carregando o gene de FtMYB116 ou pK7GWIWG2D (II) carregando o gene de b4 com antecedência.

  1. Resuspensão de A. rhizogenes
    1. Transfira a cultura obtida na etapa 2.1.6 para um tubo centrífugo esterilizado de 50 mL.
    2. Gire a 4.000 x g por 10 min a 20 °C.
    3. Remova o sobrenadante e resuspenda a pelota bacteriana com meio ms suplementado com sacarose de 30 g/L e acetosiringone de 300 μM (AS) (MSSAS, pH 5.8) a OD600 ◗ 0,2.
  2. Infecção de explantas
    1. Infundir a suspensão bacteriana obtida na etapa 3.1.3 em um frasco cônico contendo as explantas preparadas na etapa 1.4.6 por 10 min(Figura 1E).
    2. Tire as explantas e seque-as usando um papel bibuloso estéril.

4. Cocultura de explants com A. rhizogenes

  1. Coloque um papel filtro estéril de 9 cm de diâmetro no meio MS, que é solidificado utilizando pó de ágar de 7 g/L suplementado com 30 g/L de sacarose e 100 μM AS (meio MSSAAS, pH 5.2).
  2. Sobreponha as plantas no papel filtro a 25 °C por 3 dias no escuro (Figura 1F).

5. Indução e cultura seletiva

  1. Coloque aproximadamente 20 explantas infectadas no meio MSSA suplementado com 500 mg/L cefotaxime e 50 mg/L de kanamicina (Kan) (MSSACK, pH 5.8) (Figura 1G).
  2. Incuba-los verticalmente a condição de luz a 25 °C ± 1 °C. As raízes peludas ocorrem aproximadamente 1 semana após a incubação(Figura 1H pontas de flecha sinuosa de traço preto indicam ocorrência de raízes peludas).
    NOTA: Substitua o meio MSSACK a cada 15 dias, se necessário.

6. Subculturing TB raízes peludas

NOTA: Este procedimento visa colher raízes peludas vigorosas. Observe regularmente o crescimento de raízes peludas durante a propagação, e remova as contaminadas e inativadas em tempo hábil. Se necessário, repita os seguintes passos para propagar raízes mais peludas. Leva aproximadamente 10 a 14 dias desde a subculação até a colheita.

  1. Selecione as raízes peludas que mostram aparência branca e rápido crescimento.
  2. Corte-os em pedaços de 2-3 cm.
  3. É óbvio que estão em um banco limpo.
  4. Subcultura-los em um frasco cônico esterilizado de 100 mL contendo 5 mL de mS médio suplementado com 30 g/L de sacarose e 50 mg/L Kan (MSSK, pH 5.8) a uma velocidade rotativa de 80 rpm a 25 °C no escuro até que se espalhem para o fundo do frasco(Figura 1I).

7. Identificação de raízes peludas transformadas e conservação

NOTA: Raízes peludas transformadas podem ser identificadas com base nos aspectos da morfologia e nível genético. A identificação também pode ser realizada de acordo com o genoma da raiz peluda e resistência, que não estão cobertos neste protocolo. Este procedimento se concentra principalmente no gene do repórter e na identificação genética do alvo.

  1. Remova as raízes peludas e contaminadas e selecione aquelas com aparência branca.
  2. Avalie se há fluorescência verde um transiluminador ultravioleta duplo azul/leve.
  3. Selecione as raízes peludas que exibem um forte sinal de fluorescência nos tubos numerados ou embrulhadas usando um papel alumínio marcado depois de secá-las com um papel absorvente.
  4. Liofiliste-os em nitrogênio líquido, seguido de armazenar toda a colheita a −80 °C para investigação posterior.
  5. Identificação genética
    1. Triturar 0,1 g das raízes peludas em pó fino em nitrogênio líquido.
    2. Prepare o DNA genômico de linhas transgênicas independentes de TB usando o método de brometo de cetiltilamônio modificado (CTAB)25 de acordo com a instrução do fabricante do kit de DNA genômico da planta.
    3. Realize a reação em cadeia de polimerase (PCR) usando 100 ng de modelo de DNA genômico e primers listados na Tabela 2.
    4. Realize o ciclo de amplificação da seguinte forma: predenaturação a 94 °C por 5 min, desnaturação a 94 °C para 30 s, recozimento do primer a 55 °C para 30 s e extensão de primer a 72 °C para 30 s. Após 36 ciclos e uma etapa final de extensão a 72 °C por 10 min, analise os produtos de amplificação em géis de agarose de 1%.
    5. Manche os géis com coloração de ácido nucleico e visualize-os luz UV.

Resultados

Agrobacterium rhizogenes-transformação de raiz peluda da TB mediada
Este estudo descreve o protocolo passo-a-passo que foi estabelecido para obter raízes peludas geneticamente transformadas usando A. rhizogenes. Levou aproximadamente 5-6 semanas desde a inoculação das sementes de TB até a colheita das raízes peludas identificadas, e alguns passos-chave são retratados na Figura 1 (A-H). Resumidamente, as sementes com casca esteril...

Discussão

A TB tem sido utilizada em diversos estudos relacionados a metabólitos secundários em níveis genéticos e metabólicos1,2,5,27,28. A cultura raiz peluda, como fonte única de produção metabólica, desempenha um papel fundamental na engenharia metabólica29 e pode ser usada para alterar vias metabólicas inserindo os genes relaciona...

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelos Fundos de Pesquisa Fundamentais para os institutos centrais de pesquisa de bem-estar público ZXKT17002.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
2*Taq PCR MasterMixAidlab, ChinaPC0901
Agar powderSolarbio Life Science, Beijing, ChinaA8190
Applied Biosystems 2720 thermo cyclerThermoFisher Scientific, USA37834
ASSolarbio Life Science, Beijing, ChinaA8110Diluted in DMSO, 100 mM
binary vectorsThermoFisher Scientific (invitrogen), US/pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II)
Cefotaxime,sodiumSolarbio Life Science, Beijing, ChinaC8240Diluted in Water, 200 mg/mL
CF15RXII high-speed microHitachi, JapanNo. 90560201
Diposable Petri-dishGuanghua medical instrument factory, Yangzhou, China/
DYY-6C electrophoresis apparatusBjliuyi, Beijing ChinaECS002301
EASYspin Plus Plant RNA KitAidlab, ChinaRN38
ELGA purelab untra bioscienceELGA LabWater, UK82665JK1819
Epoch Microplate Spectrophotometerbiotek, US/
Gateway BP/LR reaction enzymeThermoFisher Scientific (invitrogen), US11789100/11791110
HYG-C multiple-function shakerSuzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China/
KanSolarbio Life Science, Beijing, ChinaK8020Diluted in Water, 100 mg/mL
MLS-3750 Autoclave sterilizerSanyo, Japan/
MS salts with vitaminsSolarbio Life Science, Beijing, ChinaM8521
NaClSolarbio Life Science, Beijing, ChinaS8210
Other chemicals unstatedBeijing Chemical Works, Chinaethanol, mercury bichloride, etc.
PHS-3C pH meterShanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, Chinaa008
Plant Genomic DNA KitTIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTDDP305
RifampinSolarbio Life Science, Beijing, ChinaR8010Diluted in DMSO, 50 mg/mL
SpectinomycinSolarbio Life Science, Beijing, ChinaS8040Diluted in Water, 100 mg/mL
SucroseSolarbio Life Science, Beijing, ChinaS8270
Trans2K DNA MarkerTransGen Biotech, Beijing, ChinaBM101-01
TryptoneSolarbio Life Science, Beijing, ChinaLP0042
Whatman diameter 9 cm Filter paperHangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd/
Yeast Extract powderSolarbio Life Science, Beijing, ChinaLP0021

Referências

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