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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Descriviamo un metodo per indurre radici pelose da Agrobacterium rhizogenes- trasformazione mediata in grano saraceno tartario (Fagopyrum tataricum). Questo può essere utilizzato per studiare le funzioni geniche e la produzione di metaboliti secondari nel grano saraceno tartario, essere adottato per qualsiasi trasformazione genetica, o utilizzato per altre piante medicinali dopo il miglioramento.

Abstract

Il grano saraceno tartario (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] possiede varie attività biologiche e farmacologiche perché contiene abbondanti metaboliti secondari come i flavonoidi, in particolare la rutina. Agrobacterium rhizogenes sono stati gradualmente utilizzati in tutto il mondo per indurre le radici pelose nelle piante medicinali per studiare le funzioni geniche e aumentare la resa dei metaboliti secondari. In questo studio, abbiamo descritto un metodo dettagliato per generare A. rhizogenes-mediato radici pelose nella TB. I cotiledonti e l'asse ipocotiledonario a 7-10 giorni furono selezionati come espianti e infettati da A. rhizogenes con un vettore binario, che indusse radici pelose avventurose che apparivano dopo 1 settimana. La trasformazione della radice pelosa generata è stata identificata sulla base della morfologia, della selezione della resistenza (kanamycin) e dell'espressione genica del reporter (proteina fluorescente verde). Successivamente, le radici pelose trasformate si sono propagate come richiesto. Nel frattempo, un fattore di trascrizione della mieloblastosi (MYB), FtMYB116, è stato trasformato nel genoma della TB utilizzando le radici pelose mediate da A. rhizogenesper verificare il ruolo del FtMYB116 nel sintetizzare i flavonoidi. I risultati hanno mostrato che l'espressione dei geni correlati ai flavonoidi e la resa di composti pelosi (rutina e quercetina) sono stati significativamente (p < 0,01) promossi da FtMYB116, indicando che le radici pelose mediate da A. rhizogenespossono essere utilizzate come strumento alternativo efficace per studiare le funzioni genetiche e la produzione di metaboliti secondari. Il protocollo dettagliato passo-passo descritto in questo studio per la generazione di radici pelose può essere adottato per qualsiasi trasformazione genetica o altre piante medicinali dopo l'adattamento.

Introduzione

Il grano saraceno tartario (TB)(Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn) è un tipo di dicoledone appartenente al genere Fagopyrum e alla famiglia Polygonaceae1. Come tipo di cibo omologato medicina levato, la TB ha ricevuto un notevole interesse a causa della sua composizione chimica distintiva e delle diverse bioattività contro le malattie. La tubercolosi è principalmente ricca di carboidrati, proteine, vitamine e carotenoidi, nonché in polifenoli come fenolici e flavonoidi1. Varie attività biologiche e farmacologiche dei flavonoidi, tra cui antiossidanti, antiipertensive2e anti-infiammatori e proprietà antitumorali e antidiabetici, sono state dimostrate3.

Agrobacterium rhizogenes è un batterio del suolo che contribuisce allo sviluppo di malattie delle radici pelose in diverse piante superiori, in particolare dicotiledoni, infettando i siti delle ferite4,5. Questo processo è iniziato dal trasferimento del DNA T nel plasmide che induce la radice (Ri)5,6 ed è comunemente accompagnato dall'integrazione e dall'espressione di un gene esogeno dal Ri plasmide e dalle successive fasi di generazione del fenotipo della radice pelosa7. A. le radici pelose transgeniche mediate da rizogeni,come potente strumento nel campo della biotecnologia vegetale, sono state ampiamente utilizzate a causa della loro produttività stabile e elevata e del facile ottenimento in un breve periodo. Inoltre, le radici pelose indotte da A. rhizogenes si distinguono in modo efficiente per il loro sviluppo di radici plagiotropiche e la crescita altamente ramificata in un mezzo privo di ormoni8. Possono essere utilizzati in diversi campi di ricerca, tra cui la produzione di semi artificiali, la ricerca sul nodulo delle radici, e nello studio delle interazioni con altri organismi come i funghi micorrizaci, i nematodi e i patogeni delle radici7,9. Inoltre, le colture di trasformazione delle radici pelose sono state ampiamente utilizzate come sistema sperimentale per studiare i percorsi biochimici e la segnalazione chimica e per produrre metaboliti secondari vegetali che vengono utilizzati come prodotti farmaceutici, cosmetici e additivi alimentari8,10. I preziosi metaboliti secondari, tra cui alcaloidi indole, aconiti, alcaloidi del tropane, terpenoidi e flavonoidi, sintetizzati in radici pelose di tipo selvatico sono stati studiati per diversi decenni in numerose specie, come il ginsenoside,in Panax ginseng11, coumarine in Ammi majus12, e i composti fenolici in23.13

Le radici pelose sono state prodotte utilizzando A. rhizogenes in 79 specie vegetali di 27 famiglie14. Per esempio, A. rizogenes-mediato trasformazione della radice pelosa mediata è stato segnalato nella soia15,16, Salvia17, Plumbago indica18, Lotus japonicus19, e cicoria (Cichorium intybus L.) 20. Tb trasformazione della radice pelosa è stato studiato anche2. Sono disponibili pochi protocolli dettagliati per quanto riguarda lo sviluppo di radici pelose mediate da A. rhizogenes che trasportano o meno un vettore binario. Per esempio, Sandra et al.21 ha introdotto un metodo per produrre radici pelose di patate transgeniche sostenute nei germogli di tipo selvatico. Le radici pelose completamente sviluppate potrebbero essere visualizzate 5-6 settimane dopo l'iniezione di A. rizogeni che trasportavano il gene del gus reporter negli internodi delle piante di patate. Un altro studio aveva anche riportato un sistema di radici pelose transgeniche indotto da A. rhizogenes che ospita il gene di reporter gusA in iuta (Corchorus capsularis L.) 22. Inoltre, Supaart et al.23 ha ottenuto radici pelose di tabacco transgenico utilizzando A. rhizogenes trasformati con il vettore di espressione pBI121 portando il gene di sintetizzatori di acido1-tetraidrocancandeinolicosco (THCA) per produrre THCA.

Tuttavia, un processo passo-passo per una generazione efficace di trasformazione della radice pelosa, soprattutto nella TB, è stato relativamente meno dimostrato. In questo studio, abbiamo descritto un protocollo dettagliato utilizzando A. rhizogenes che trasporta il gene reporter (GFP), un marcatore selettivo (Kan) e un gene di interesse (b4, un gene identificato dal nostro gruppo ma inedito dalla famiglia di base elicoidale-loop-elica(bHLH) per generare la trasformazione genetica della radice pelosa nella TB. L'esperimento durò 5-6 settimane, dall'inoculazione dei semi alla generazione di radici pelose, coinvolgendo la preparazione dell'espianto, l'infezione, la cocultura, la subcultura e la successiva propagazione. Inoltre, A. rhizogenes contenente un plasmid binario che trasporta la transgene TB del fattore di trascrizione della mieloblastosi 116 (FtMYB116) è stato utilizzato per determinare se il FtMYB116 può promuovere l'accumulo di flavonoidi, in particolare rutina, nella TB a livello genico e metabolico attraverso la trasformazione della radice pelosa della TB. FtMYB116, che è un fattore trascrizionale indotta dalla luce, regola la sintesi della rutina in diverse condizioni di luce5. Chalcone synthase (CHS), flavanone-3-idxylase (F3H), flavonoide-3'-hydroxylase (F3'H), e flavonol synthase (FLS)24 sono enzimi chiave coinvolti nel percorso metabolico della biosintesi della rutina. Pertanto, questo studio dimostra la sovraespressione di FtMYB116 nelle radici pelose della TB e l'espressione dei geni enzimatici chiave, nonché il contenuto di rutina e altri flavonoidi come la quercetina.

Protocollo

La TB utilizzata in questo studio è stata chiamata BT18, che ha avuto origine dalla razza di "JinQiao No.2" coltivata dal Centro di ricerca di piccolo grano varie della Shanxi Academy of Agricultural Science. I passaggi principali di questo protocollo sono illustrati nella Figura 1.

NOTA: Utilizzare rapidamente la manipolazione relativa agli espianti e, quando possibile, tenere i piatti Petri chiusi per evitare appassimento e contaminazione. Se non diversamente specificato, tutte le incubazioni di espiantazioni sono state condotte sotto la condizione di una luce di 14 ore e di un fotoperiodo scuro di 10-h a 25 gradi centigradi. Se non diversamente specificato, tutte le operazioni relative agli espiatori o ai batteri sono state eseguite in condizioni asettiche in una cappa a flusso laminare. Tutti gli ingredienti dei media per A. rhizogenes e colture vegetali in vitro sono forniti nella tabella 1. Dopo aver regolato il pH, tutti i supporti sono stati autoclaventi a 120 gradi centigradi per 20 min.

AVVISO: Depositare tutti i batteri e le piante geneticamente modificati nel contenitore dei rifiuti appropriato. Azionare tutte le sostanze chimiche pericolose in un armadio dei fumi e depositarle nel contenitore dei rifiuti pericolosi.

1. Preparazione di espianti TB

  1. Preparazione di semi di TB
    1. Selezionare i semi di TB paffuti e non danneggiati (Figura 1A1) che sono stati conservati ad una temperatura inferiore a 20 gradi centigradi per non più di 2 anni.
    2. Immergere i semi in acqua a 28 gradi centigradi per circa 20 min in modo che il mantello del seme possa essere facilmente staccato (Figura 1A2). Se necessario, utilizzare le forbici per tagliare una fessura sui semi per facilitare il peeling.
  2. Sterilizzazione dei semi di TB
    1. Mettere 100-200 semi sbucciati in un fiascheta conico sterilizzato da 100 mL.
    2. Disinfettare i semi utilizzando 75% etanolo per 30 s.
    3. Sostituire l'etanolo con 5% di ipocloreto e disinfettare per 15 min.
      NOTA: La disinfezione con bicloruro di mercurio ad una concentrazione di 1 g/L per 8 min può essere utilizzata come sterilizzatore alternativo per sostituire l'ipoclorito di sodio in caso di sterilizzazione inadeguata.
      AVVISO: il bicloruro di mercurio è pericoloso e non è un materiale rispettoso dell'ambiente. Azionarlo nell'armadio fumante e depositarlo nel contenitore dei rifiuti pericolosi, se in ogni caso viene utilizzato il bicloruro di mercurio.
    4. Versare l'ipoclorite di sodio.
    5. Lavare i semi con acqua sterile deionizzata 5 volte.
    6. Asciugare i semi con una carta bibulosa sterile.
  3. Preparazione delle piantine della TB
    1. Preparare 50 mL Murashige e Skoog (MS) basale medium (1962) integrato con 30 g/L di saccarosio e 7 g/L di polvere di agar (MSSA) (Tabella 1) in una bottiglia di coltura di tessuto vegetale da 300 mL.
    2. Regolare il pH a 5.8 prima di autoclaving.
    3. Distribuire 10 semi in modo uniforme per bottiglia di mezzo MSSA.
    4. Germinai i semi in una sala di coltura a 25 gradi centigradi e 1oC alle condizioni di luce per 7-10 giorni.
  4. Preparazione di espianti sterili
    1. Selezionare piantine robuste di TB (Figura 1C), quando i 2 pezzi di cotiledoni sono spiegati.
    2. Tagliare le piantine dalle radici (Figura 1Cfrecce tratteggiate rosse), evitando il contatto con il mezzo.
    3. Mettetele in una sterile piastra Petri.
    4. Tagliare gli ipocotilli in segmenti di 0,8-1 cm e tagliare i cotiledoni in pezzi di circa 0,5 cm.
    5. Precoltura questi esplants su MSSA media sotto la condizione di luce per 24 h.
    6. Trasferirli in un flacone conico sterilizzato da 100 mL, che ora sono pronti per l'infezione.

2. Preparazione di A. rhizogenes per la trasformazione

NOTA: Il ceppo A. rhizogenes ACCC10060 è stato gentilmente fornito dall'Istituto di sviluppo vegetale medicinale e conservato a 80 gradi centigradi. A. rhizogenes è stato trasformato con il vettore binario pK7GWIWG2D (II) che ospita un DNA T che trasporta il gene b4 che accompagna un GFP come gene indicatore e il gene di resistenza Kan come marcatore selezionabile. Il gene b4 è un membro della famiglia bHLH del fattore di trascrizione, che non è ancora stata pubblicata. Per valutare il potenziale delle radici pelose della TB, A. rhizogenes è stato trasformato con il vettore binario pK7WG2D contenente il gene MYB116 per studiarne l'effetto sulla produzione di metaboliti secondari come i flavonoidi a livello di espressione genica e mediante analisi metaboliche. Attivati A. rizogeni devono essere ben preparati allo stesso tempo con gli espianti.

  1. Attivazione di A. rizogeni
    1. Scongelo A. rhizogenes sul ghiaccio
    2. Immergere i batteri e allinearli uniformemente su lievito mannitolo medio (YEB) integrato con 15 g/L polvere di agar, 50 mg/L rifampicina, e 50 mg/L spettronomina (YEBARS, pH 7.0).
    3. Incubare i batteri a 28 gradi centigradi per 12-16 h.
    4. Scegli una colonia monoclonale e coltiva in un altro piatto Petri nello stesso modo sopra descritto.
    5. Selezionare colonie monoclonali e colture in un fiaschetta conica sterilizzata 100 mL contenente 20 mL di YEB medio integrato con 50 mg/L rifampicina e 50 mg/L spettronomina (YEBRS, pH 7.0) a 28 gradi C e 200 rpm per 16-18 h fino a quando i valori OD600 raggiunge 2,0.
    6. Incubare il 2%-4% della coltura di cui sopra in un altro flacone conico da 100 mL contenente 20 mL di yEBRS medio a 28 e 200 rpm per 4-5 h fino a quando il valore di OD600 non raggiunge circa 0,5 (Figura 1D).

3. Infezione e screening degli esoti della TB

NOTA: L'obiettivo di questo protocollo è quello di ottenere radici pelose geneticamente trasformate. Le radici di tipo selvaggio sono state usate come controllo negativo per valutare l'espressione transgenica. In questo protocollo, A. rhizogenes è stato trasformato con il vettore binario o pK7WG2D che trasporta il gene di FtMYB116 o pK7GWIWG2D (II) portando il gene di b4 in anticipo.

  1. Sospensione di A. rhizogenes
    1. Trasferire la coltura ottenuta al punto 2.1.6 in un tubo centrifugo sterilizzato da 50 mL.
    2. Girare a 4.000 x g per 10 min a 20 gradi centigradi.
    3. Togliere il supernatante e risospendere il pellet batterico con mezzo MS integrato con 30 g di saccrosio e 300 acetosyringone (AS) (MSSAS, pH 5,8) a OD600 x 0,2.
  2. Infezione degli espianti
    1. Infondere la sospensione batterica ottenuta nel passaggio 3.1.3 in un flacone conico contenente gli espianti preparati nel passaggio 1.4.6 per 10 min (Figura 1E).
    2. Togliere gli espianti e asciugarli con una carta bibulosa sterile.

4. Cocultura di espiante con A. rhizogenes

  1. Posizionare una carta filtrante sterile di 9 cm di diametro sul mezzo MS, che viene solidificata utilizzando polvere di agar 7 g/L integrata con 30 g/L di saccarosio e 100 - M AS (medium MSSAAS, pH 5.2).
  2. Sovrapporre gli espianti sulla carta da filtro a 25 gradi centigradi per 3 giorni al buio (Figura 1F).

5. Induzione e cultura selettiva

  1. Posizionare circa 20 espianti infetti sul mezzo MSSA integrati con 500 mg/L cefotaxime e 50 mg/L kanamycin (Kan) (MSSACK, pH 5.8) (Figura 1G).
  2. Incubarli verticalmente a 25 gradi centigradi e 1 gradi centigradi. Le radici pelose si verificano circa 1 settimana dopo l'incubazione(Figura 1H punta di freccia black-dash indicano presenza di radici pelose).
    NOTA: Se necessario, sostituire il supporto MSSACK ogni 15 giorni.

6. Subculturing TB radici pelose

NOTA: Questa procedura mira a raccogliere le radici pelose vigorose. Osservare regolarmente la crescita delle radici pelose durante la propagazione e rimuovere quelle contaminate e inattivate in modo tempestivo. Se necessario, ripetere i passaggi seguenti per propagare più radici pelose. Ci vogliono circa 10-14 giorni dalla subcultura alla raccolta.

  1. Selezionare le radici pelose mostrando l'aspetto bianco e la rapida crescita.
  2. Tagliarli a pezzi di 2-3 cm.
  3. Chiaramente numerati su una panchina pulita.
  4. Sottocolturali in un pasciolo conico sterilizzato da 100 mL contenente 5 mL di mezzo MS integrati con 30 g/L di saccarosio e 50 mg/L Kan (MSSK, pH 5.8) ad una velocità rotativa di 80 giri a 25 gradi centigradi al buio fino a quando non si diffondono sul fondo del pallone (Figura 1I).

7. Identificazione delle radici pelose trasformate e conservazione

NOTA: Le radici pelose trasformate possono essere identificate in base agli aspetti della morfologia e del livello genico. L'identificazione può anche essere condotta in base al genoma della radice pelosa e alla resistenza, che non sono coperti in questo protocollo. Questa procedura si concentra principalmente sull'identificazione genica e del gene bersaglio dei reporter.

  1. Rimuovere le radici pelose e contaminate e selezionare quelle con aspetto bianco.
  2. Valutare se c'è fluorescenza verde sotto un transilluminatore ultravioletto doppio blu/leggero.
  3. Selezionare le radici pelose che presentano un forte segnale di fluorescenza nei tubi numerati o avvolte con una tinfoil marcata dopo averle asciugate con una carta assorbente.
  4. Liofiloli in azoto liquido, seguito dalla conservazione di tutto il raccolto a 80 gradi centigradi per ulteriori indagini.
  5. Identificazione genica
    1. Triturare 0,1 g di radici pelose in polvere fine in azoto liquido.
    2. Preparare il DNA genomico delle linee transgeniche indipendenti della TB utilizzando il metodo modificato del bromuro di cetyltrimethylammonium (CTAB)25 secondo l'istruzione del produttore del kit di DNA genomico vegetale.
    3. Eseguire la reazione a catena della polimerasi (PCR) utilizzando 100 ng di modello di DNA genomico e primer elencati nella tabella 2.
    4. Eseguire il ciclo di amplificazione come segue: prenaturazione a 94 gradi centigradi per 5 min, denaturazione a 94 gradi centigradi per 30 s, primer annealing a 55 gradi centigradi per 30 s e estensione primer a 72 s per 30 s. Dopo 36 cicli e un passo di estensione finale a 72 gradi centigradi per 10 min, analizzare i prodotti di amplificazione su gel agarose 1%.
    5. Macchiare i gel con colorazione dell'acido nucleico e visualizzarli sotto la luce UV.

Risultati

Agrobacterium rhizogenes-mediato TB trasformazione della radice pelosa
Questo studio descrive il protocollo passo-passo che è stato stabilito per ottenere radici pelose geneticamente trasformate utilizzando A. rhizogenes. Ci sono volute circa 5-6 settimane dall'inoculazione dei semi di TB alla raccolta delle radici pelose identificate, e alcuni passaggi chiave sono raffigurati nella Figura 1 (A-H). In breve, i semi sgusciati sterilizzat...

Discussione

La TB è stata utilizzata in diversi studi relativi ai metaboliti secondari a livelli genetici e metabolici1,2,5,27,28. La coltura delle radici hairy, come fonte unica per la produzione di metaboliti, svolge un ruolo fondamentale nell'ingegneria metabolica29 e può essere utilizzata per alterare le vie metaboliche inserendo i geni corre...

Divulgazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto dai Fondi fondamentali di ricerca per gli istituti centrali di ricerca sul welfare pubblico, XKT17002.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
2*Taq PCR MasterMixAidlab, ChinaPC0901
Agar powderSolarbio Life Science, Beijing, ChinaA8190
Applied Biosystems 2720 thermo cyclerThermoFisher Scientific, USA37834
ASSolarbio Life Science, Beijing, ChinaA8110Diluted in DMSO, 100 mM
binary vectorsThermoFisher Scientific (invitrogen), US/pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II)
Cefotaxime,sodiumSolarbio Life Science, Beijing, ChinaC8240Diluted in Water, 200 mg/mL
CF15RXII high-speed microHitachi, JapanNo. 90560201
Diposable Petri-dishGuanghua medical instrument factory, Yangzhou, China/
DYY-6C electrophoresis apparatusBjliuyi, Beijing ChinaECS002301
EASYspin Plus Plant RNA KitAidlab, ChinaRN38
ELGA purelab untra bioscienceELGA LabWater, UK82665JK1819
Epoch Microplate Spectrophotometerbiotek, US/
Gateway BP/LR reaction enzymeThermoFisher Scientific (invitrogen), US11789100/11791110
HYG-C multiple-function shakerSuzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China/
KanSolarbio Life Science, Beijing, ChinaK8020Diluted in Water, 100 mg/mL
MLS-3750 Autoclave sterilizerSanyo, Japan/
MS salts with vitaminsSolarbio Life Science, Beijing, ChinaM8521
NaClSolarbio Life Science, Beijing, ChinaS8210
Other chemicals unstatedBeijing Chemical Works, Chinaethanol, mercury bichloride, etc.
PHS-3C pH meterShanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, Chinaa008
Plant Genomic DNA KitTIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTDDP305
RifampinSolarbio Life Science, Beijing, ChinaR8010Diluted in DMSO, 50 mg/mL
SpectinomycinSolarbio Life Science, Beijing, ChinaS8040Diluted in Water, 100 mg/mL
SucroseSolarbio Life Science, Beijing, ChinaS8270
Trans2K DNA MarkerTransGen Biotech, Beijing, ChinaBM101-01
TryptoneSolarbio Life Science, Beijing, ChinaLP0042
Whatman diameter 9 cm Filter paperHangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd/
Yeast Extract powderSolarbio Life Science, Beijing, ChinaLP0021

Riferimenti

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