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要約

我々は、アグロバクテリウム・リゾゲネスによって毛深い根を誘導する方法を記述する - 酒盤の媒介性形質転換(ファゴピラム・タタリカム)これは、タータリーそばにおける遺伝子機能および二次代謝産物の産生を調査するために使用され、任意の遺伝的形質転換に採用されるか、または改善後の他の薬用植物に使用することができる。

要約

酒類そば(TB)[ファゴピルラムタタサリカム(L.)ゲールトン]は、フラボノイド、特にルチンなどの二次代謝産物が豊富に含まれているため、様々な生物学的および薬理学的活性を有する。アグロバクテリウム・リゾゲネスは、徐々に遺伝子機能を調査し、二次代謝産物の収量を増加させるために薬用植物の毛深い根を誘導するために、世界的に使用されてきました。本研究では、結核におけるA.根茎遺伝子媒介性毛状根を生成する詳細な方法を説明した。7~10日のコチルドンと低コチルド軸を外植体として選び、バイナリベクターを持つA.根茎に感染し、1週間後に出現した出現性の毛状根を誘発した。生成された毛深い根形質転換は、形態、抵抗性選択(カナマイシン)、レポーター遺伝子発現(緑色蛍光タンパク質)に基づいて同定した。その後、変換された毛深い根は、必要に応じて自己増殖した。一方、骨髄芽細胞症(MYB)転写因子FtMYB116は、フラボノイドの合成におけるFtMYB116の役割を検証するために、A.根茎遺伝子媒介毛根を用いて結核ゲノムに変換された。その結果、フラボノイド関連遺伝子の発現とフラボノイド化合物(ルチンおよびケルセチン)の収量がFtMYB116によって有意に促進された(p<0.01)ことを示し、A.根茎介在毛根が遺伝子機能および二次代謝産物の産生を調査するための効果的な代替ツールとして使用できることを示した。毛深い根を生成するためのこの研究で説明されている詳細なステップバイステッププロトコルは、調整後に任意の遺伝的形質転換または他の薬用植物に採用することができる。

概要

酒類そば(TB)(ファゴピルム・タタリカム(L.)ゲールトン)は、ファゴピルム属及びファミリー・ポリゴンア科1に属するジコチルドンの一種である。中国医学の相同食品の一種として、結核は、その独特の化学組成と疾患に対する多様な生物活動のためにかなりの関心を受けています。TBは主に炭水化物、タンパク質、ビタミン、カロテノイド、フェノール酸およびフラボノイドなどのポリフェノール類に富んでいます1.抗酸化、抗高血圧2、および抗炎症ならびに抗癌および抗糖尿病特性を含むフラボノイドの様々な生物学的および薬理活性が実証されている3。

アグロバクテリウム・リゾゲネスは、創傷部位44,55に感染することにより、いくつかの高等植物、特にジコチルドンにおける毛深い根疾患の発症に寄与する土壌細菌である。このプロセスは、根誘起(Ri)プラスミド55、66におけるT-DNAの転写によって開始され、一般的には、Riプラスミドからの外因性遺伝子の統合および発現と毛深い根表現型7を生成するステップを伴う。A. 根茎遺伝子-媒介トランスジェニック毛根は、植物バイオテクノロジーの分野における強力なツールとして、短期間での安定した高い生産性と容易な入手のために最も広く使用されてきた。さらに、A.根茎遺伝子によって誘導される毛深い根は、その形成的な根の発達とホルモンフリー培地8における高度に分岐する成長によって効率的に区別される。それらは、人工種子生産、根結節研究、および菌根菌菌、線虫、および根病原体77、99などの他の生物との相互作用を研究する研究を含むいくつかの研究分野で使用することができる。また、毛深い根形転換培養は、生化学的経路や化学シグナル伝達を調査し、医薬品、化粧品、食品添加物88,1010として使用される植物二次代謝産物を製造するための実験システムとして広く使用されている。野生型の毛状根で合成されたインドールアルカロイド、アコナイト、トロパネアルカロイド、フラボノイドなどの貴重な二次代謝産物は、数十年にわたり、パナックス人参11のギンセノシド、アムミマジャス12、およびフェノリック化合物で数十年にわたって調査2,されてきた。

毛深い根は、27家族から79種の植物種でA.根茎遺伝子を用いて製造されている14.例えば、A.根茎-媒介毛根形変換は、大豆15、16、サルビア17、プラムバゴインディカ18、ロータスジャポニクス19、チコリ(チコリウムインティバスL.)で報告されています。,1620.TB毛深い根形変換も調査済み 2.バイナリベクターを運ぶかどうかにかかわらず、A.根遺伝子によって媒介される毛深い根の発達に関して利用可能な詳細なプロトコルはほとんどありません。例えば、Sandra et al.21は野生型の芽に持続するトランスジェニックポテト毛状根を作製する方法を導入した。完全に発達した毛深い根は、ジャガイモ植物の茎間節にガスレポーター遺伝子を運ぶA.根茎遺伝子の注入後5〜6週間後に視覚化することができた。別の研究はまた、ジュートでgusAレポーター遺伝子を収容するA.根茎遺伝子によって誘発されるトランスジェニック毛状根系を報告していた(コーコーラスカプクラリスL.22さらに、Supaartら23は、Δ1-テトラヒドロカンナビノール酸(THCA)合成酵素の遺伝子を担持する発現ベクター pBI121で形質転換したA.根生遺伝子を用いてトランスジェニックタバコ毛状根を得てTHCAを産生する。

しかし、特に結核において、毛深い根形変換の効果的な生成のためのステップバイステップのプロセスは比較的実証されていない。本研究では、レポーター遺伝子(GFP)、選択的マーカー(Kan)、および対象遺伝子(b4)を用いた詳細なプロトコル(我々の群から同定されたが、基本的ならせんループらせん(bHLH)ファミリー)を用いて、結核における毛深い根遺伝子変換を生成する詳細なプロトコルについて説明した。実験は、外植の準備、感染、コキュレーション、培養、その後の伝播を含む、種子の接種から毛深い根の生成まで、5〜6週間続いた。さらに、骨髄芽細胞症転写因子116の結核トランスジーンを運ぶバイナリプラスミドを含むA.リゾゲレンスは、FtMYB116がTB毛根形変換を介して遺伝子および代謝レベルにおけるフラボノイド、特にルチンの蓄積を促進できるかどうかを決定するために使用された。FtMYB116は、光誘発転写因子であり、異なる光条件5の下でルチンの合成を調節する。カルボンシンターゼ(CHS)、フラバノン-3-ヒドロキシラーゼ(F3H)、フラボノイド-3'ヒドロキシラーゼ(F3'H)およびフラボノールシンターゼ(FLS)24は、ルチン生合成の代謝経路に関与する主要な酵素である。H24そこで、この研究は、結核性毛深い根におけるFtMYB116の過剰発現と主要な酵素遺伝子の発現、ならびにルチンおよびケルセチンなどの他のフラボノイドの含有量を示す。

プロトコル

この研究で使用される結核は、山西農業科学アカデミーの小雑穀物研究センターが栽培した「JinQiao No.2」の品種に由来するBT18と名付けられました。このプロトコルの主要な手順を図 1に示します。

注:外植に関連する操作を迅速に操作し、可能であれば、ペトリ皿を閉じてしまい、しおれや汚染を避けてください。特に明記しない限り、全ての外植物インキュベーションは、25°Cで14時間光と10時間の暗光期の条件下で行った。特に明記されていない限り、すべての外植または細菌関連の操作は、層流フードで無菌条件下で行われた。A.根茎遺伝子およびインビトロ植物培養のためのすべての培地成分を表1に示す。pHを調整した後、全ての培地を120°Cで20分間オートクレーブし、固化培地を25mLの培地を直径9cmのシャーレに充填し、固化させた。

注意:すべての遺伝子組み換え細菌や植物を適切な廃棄物容器に堆積させます。煙の食器棚ですべての有害化学物質を操作し、有害廃棄物容器に堆積させます。

1. 結核の外植の準備

  1. 結核種子の調製
    1. 20°C未満の温度で2年以内に保存されているふっくらと損傷していないTB種子(図1A1)を選択します。
    2. 種子を28°Cで約20分間水に浸し、種子コートを簡単に剥がすことができるようにします(図1A2)。必要に応じて、はさみを使用して種子のスロットを切断し、剥離を容易にします。
  2. 結核種子の殺菌
    1. 100~200種を100mLの殺菌した円錐フラスコに入れます。
    2. 30sに対して75%エタノールを用いて種子を消毒する。
    3. エタノールを次亜塩素酸ナトリウム5%に交換し、15分間消毒します。
      注:8分間1g/Lの濃度で2塩化水銀を使用した消毒は、不十分な滅菌の場合には、次亜塩素酸ナトリウムを置き換える代替滅菌剤として使用することができます。
      注意: 二塩化水銀は危険で、環境にやさしい材料ではありません。発煙食器棚で操作し、有害廃棄物容器に堆積します, 任意の場合に二塩化水銀が使用されている場合.
    4. 次亜塩素酸ナトリウムを注ぎます。
    5. 滅菌脱イオン水を5回使用して種子を洗浄します。
    6. 種子を滅菌バイブル紙で乾かします。
  3. TB苗の調製
    1. 300 mL の植物組織培養ボトルに、30 g/L スクロースと 7 g/L 寒天粉末 (MSSA) (表 1)を添加した 50 mL ムラシゲおよびスクーグ (MS) 基底培地 (1962) を準備します。
    2. pHをオートクレーブする前に5.8に調整します。
    3. MSSA培地のボトルごとに10種を均等に配布します。
    4. 7~10日間、光条件下で25°C±1°Cの培養室で種子を発芽させる。
  4. 滅菌外植の調製
    1. 2枚のコチルドンが展開されたときに、TB(図1C)の堅牢な苗を選択します。
    2. 根から苗を切り取ります (図 1C C 赤ダッシュ矢印ヘッド), 媒体との接触を避けるために.
    3. 滅菌ペトリ皿に入れます。
    4. 0.8〜1cmのセグメントに低コチルをカットし、約0.5センチメートルにコチルドンを剪断します。
    5. これらの外植物をMSSA培地上で24時間光条件下で前培養する。
    6. 100 mL滅菌された円錐形フラスコに移し、感染の準備が整いました。

2. A.根茎遺伝子の変形の準備

注:A.根茎株ACCC10060は親切に薬用植物開発研究所によって提供され、−80°Cで保存されました。A. リゾゲネスは、GFPに付随するb4遺伝子を指標遺伝子として、カン抵抗遺伝子を選択マーカーとして持つT-DNAを保持するバイナリベクター pK7GWIWG2D(II)で形質転換した。遺伝子b4は、まだ公表されていない転写因子bHLHファミリーのメンバーである。結核性毛根の可能性を評価するために、A.根茎遺伝子をMYB116遺伝子を含むバイナリベクター pK7WG2Dで形質転換し、遺伝子発現レベルおよび代謝分析によるフラボノイドなどの二次代謝産物の産生に及ぼす影響を調べた。活性化されたA.根茎遺伝子は、外植と同時に十分に調製されるべきである。

  1. A.根茎遺伝子の活性化
    1. 氷の上のA.根茎遺伝子を解凍する
    2. 細菌を浸し、15 g /L寒天粉末、50 mg/Lリフェンピシン、および50 mg/L分光マイシン(YEBARS、pH 7.0)を添加した酵母マンニトール培地(YEB)に均等に並べておきます。
    3. 28°Cで12〜16時間培養します。
    4. モノクローナルコロニーを選び、上述の同じ方法で別のペトリ皿で培養します。
    5. モノクローナルコロニーを選択し、50mg/Lリフィンピシンと50mg/Lスペクチノマイシン(YEBRS、pH 7.0)を28°Cで20mg/Lスペクチノマイシン(YEBRS、pH 7.0)を含む100mLの滅菌された円錐形フラスコで200mL培養し、OD6000hまで16〜18時間に達します。
    6. 上記の培養物の2%~4%を、28°Cで20mLのYEBRS培地を含む別の100mL円錐形フラスコ、4~5時間4~5時間でOD600値が約0.5になるまでインキュベートする(図1D)。

3. 結核の外植の感染とスクリーニング

注:このプロトコルの目的は、遺伝的に変換された毛深い根を得ることです。野生型の根を陰性対照として使用し、トランスジェニック発現を評価した。このプロトコルでは、A.リゾゲレンスは、b4の遺伝子を予め運ぶFtMYB116またはpK7GWIWG2D(II)の遺伝子を運ぶpK7WG2Dのいずれかのバイナリベクターで変換された。

  1. A.根茎遺伝子の再懸濁
    1. 工程2.1.6で得られた培養物を50mLの殺菌遠心管に移す。
    2. 20°Cで10分間4,000 x gでスピンします。
    3. 上清を取り除き、30 g/Lスクロースと300 μMアセトシリンゴン(AS)(MSSAS、pH 5.8)をOD600 ≈ 0.2で補ったMS培地で細菌ペレットを再懸濁します。
  2. 外植の感染
    1. ステップ3.1.3で得られた細菌懸濁液を、ステップ1.4.6で調製した外植物を10分間含む円錐形フラスコに注入する(図1E)。
    2. 外植を取り出し、滅菌二大紙を使用して乾燥させた。

4. A.根茎遺伝子との外植の共培養

  1. 30 g/L スクロースと 100 μM AS (MSSAAS 培地、pH 5.2) を補った 7 g/L 寒天粉末を使用して固化した MS 培地に、無菌直径 9 cm のフィルターペーパーを置きます。
  2. 露光物を25°Cのフィルター用紙に重ねて、暗闇の中で3日間重ねる(図1F)。

5. 誘導・選択的培養

  1. 500 mg/L セフォタキシムと50 mg/L カナマイシン(Kan)を添加したMSSA培地に約20個の感染した外植体を配置する(MSSACK, pH 5.8) (図 1G)。
  2. 25°C±1°Cで光条件下で垂直にインキュベートします。毛深い根は、インキュベーションの約1週間後に生じる(図1H黒いダッシュ矢印は毛深い根の発生を示す)。
    注: 必要に応じて、MSSACK メディアを 15 日ごとに交換してください。

6. 結核毛深い根を下塗りする

注:この手順は、活発な毛深い根を収穫することを目的としています。伝播時に毛深い根の成長を定期的に観察し、汚染された不活性化したものを適時に取り除きます。必要に応じて、次の手順を繰り返して、より多くの毛深い根を伝播します。収穫まで約10~14日かかります。

  1. 白い外観と急速な成長を示す毛深い根を選択します。
  2. 2〜3cmの部分にカットします。
  3. 明らかにクリーンベンチにそれらを番号。
  4. 30 g/Lスクロースを補うMS培地5mLと50mg/L Kan(MSSK,pH 5.8)を含む100mL殺菌した円錐形フラスコで、フラスコの底に広がるまで暗闇の中で25°Cで80rpmの回転速度で培養する(図1I)。

7. 変形毛の根の同定と保全

注:変形した毛状の根は、形態や遺伝子レベルの側面に基づいて識別することができます。識別はまた、このプロトコルではカバーされていない毛深い根ゲノムおよび抵抗に従って行うことができる。この手順は、主にレポーター遺伝子と標的遺伝子同定に焦点を当てています。

  1. タウニーと汚染された毛深い根を取り除き、白い外観のものを選択します。
  2. 青/光デュアル紫外線トランスイルミエーターの下に緑色の蛍光があるかどうかを評価します。
  3. 番号付きチューブに強い蛍光シグナルを示す毛深い根を選択するか、吸収性紙で乾燥させた後、マークされたtinfoilを使用してラップします。
  4. 液体窒素で凍結乾燥し、続いてすべての収穫を−80°Cで保存してさらなる調査を行います。
  5. 遺伝子同定
    1. 毛深い根の0.1gを液体窒素中の微粉末にトリチュレートする。
    2. 改変セチルトリメチルアンモニウムブロマイド(CTAB)方法25を用いて、植物ゲノムDNAキットの製造者の指示に従って、独立したトランスジェニック株のゲノムDNAを調製する。
    3. 表2に記載されているゲノムDNAテンプレートおよびプライマーの100ngを用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行う。
    4. 増幅サイクルは、94°Cで5分間、94°Cで30sで変性、30sの場合は55°Cでプライマーアニール、プライマー延長を30sで72°Cで行います。36サイクルと72°Cでの最終延長ステップを10分間行った後、1%アガロースゲルで増幅産物を分析します。
    5. 核酸染色でゲルを染色し、UV光の下で視覚化します。

結果

アグロバクテリウム根虫遺伝子-媒介性結核毛状根形変換
本研究では、A.根茎遺伝子を用いて遺伝的に形質転換された毛深い根を得るために確立されたステップバイステップのプロトコルについて説明する。TB種子の接種から、同定された毛深い根の収穫まで約5〜6週間かかり、いくつかの重要なステップが図1(A-H)に示A-Hされてい?...

ディスカッション

結核は、遺伝的および代謝レベル,,1、2、5、27、282,5で二1次代謝産物に関連するいくつかの研究で使用されている。2728毛深い根培養は、代謝産物産生のユニークな供給源として、代謝工学29において極めて重要な役割を果たし、関連遺伝子を挿入するこ?...

開示事項

著者らは開示する利益相反を持っていません。

謝辞

本研究は中央公共福祉研究機関ZXKT17002の基礎研究基金によって支援されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
2*Taq PCR MasterMixAidlab, ChinaPC0901
Agar powderSolarbio Life Science, Beijing, ChinaA8190
Applied Biosystems 2720 thermo cyclerThermoFisher Scientific, USA37834
ASSolarbio Life Science, Beijing, ChinaA8110Diluted in DMSO, 100 mM
binary vectorsThermoFisher Scientific (invitrogen), US/pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II)
Cefotaxime,sodiumSolarbio Life Science, Beijing, ChinaC8240Diluted in Water, 200 mg/mL
CF15RXII high-speed microHitachi, JapanNo. 90560201
Diposable Petri-dishGuanghua medical instrument factory, Yangzhou, China/
DYY-6C electrophoresis apparatusBjliuyi, Beijing ChinaECS002301
EASYspin Plus Plant RNA KitAidlab, ChinaRN38
ELGA purelab untra bioscienceELGA LabWater, UK82665JK1819
Epoch Microplate Spectrophotometerbiotek, US/
Gateway BP/LR reaction enzymeThermoFisher Scientific (invitrogen), US11789100/11791110
HYG-C multiple-function shakerSuzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China/
KanSolarbio Life Science, Beijing, ChinaK8020Diluted in Water, 100 mg/mL
MLS-3750 Autoclave sterilizerSanyo, Japan/
MS salts with vitaminsSolarbio Life Science, Beijing, ChinaM8521
NaClSolarbio Life Science, Beijing, ChinaS8210
Other chemicals unstatedBeijing Chemical Works, Chinaethanol, mercury bichloride, etc.
PHS-3C pH meterShanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, Chinaa008
Plant Genomic DNA KitTIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTDDP305
RifampinSolarbio Life Science, Beijing, ChinaR8010Diluted in DMSO, 50 mg/mL
SpectinomycinSolarbio Life Science, Beijing, ChinaS8040Diluted in Water, 100 mg/mL
SucroseSolarbio Life Science, Beijing, ChinaS8270
Trans2K DNA MarkerTransGen Biotech, Beijing, ChinaBM101-01
TryptoneSolarbio Life Science, Beijing, ChinaLP0042
Whatman diameter 9 cm Filter paperHangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd/
Yeast Extract powderSolarbio Life Science, Beijing, ChinaLP0021

参考文献

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