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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Methode zur Induktion haariger Wurzeln von Agrobacterium rhizogenes-vermittelte Transformation in Tartary Buchweizen (Fagopyrum tataricum). Dies kann verwendet werden, um Genfunktionen und die Produktion von sekundären Metaboliten in Tartary Buchweizen zu untersuchen, für jede genetische Transformation angenommen werden, oder für andere Heilpflanzen nach Verbesserung verwendet werden.

Zusammenfassung

Tartary Buchweizen (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] besitzt verschiedene biologische und pharmakologische Aktivitäten, weil es reichlich sekundäre Metaboliten wie Flavonoide enthält, insbesondere Rutin. Agrobacterium rhizogenes wurden nach und nach weltweit verwendet, um haarige Wurzeln in Heilpflanzen zu induzieren, um Genfunktionen zu untersuchen und die Ausbeute von sekundären Metaboliten zu erhöhen. In dieser Studie haben wir eine detaillierte Methode beschrieben, um A. rhizogenes-vermittelte haarige Wurzeln bei TB zu erzeugen. Cotyledons und hypokotyledonäre Achse bei 7-10 Tagen wurden als Explanten ausgewählt und mit A. rhizogenes infiziert, die einen binären Vektor tragen, die zufällige haarige Wurzeln induzierten, die nach 1 Woche erschienen. Die erzeugte haarige Wurzeltransformation wurde anhand von Morphologie, Resistenzselektion (Kanamycin) und Reportergenexpression (grünes fluoreszierendes Protein) identifiziert. Anschließend wurden die transformierten haarigen Wurzeln nach Bedarf selbst propagiert. In der Zwischenzeit wurde ein Myeloblastose (MYB) Transkriptionsfaktor, FtMYB116, mit den A. rhizogenes-vermittelten haarigen Wurzeln in das TB-Genom umgewandelt, um die Rolle von FtMYB116 bei der Synthese von Flavonoiden zu überprüfen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Expression von Flavonoid-bezogenen Genen und die Ausbeute von Flavonoid-Verbindungen (Rutin und Quercetin) signifikant (p < 0.01) von FtMYB116gefördert wurden, was darauf hindeutet, dass A. rhizogenes-vermittelte haarige Wurzeln als wirksames alternatives Werkzeug zur Untersuchung von Genfunktionen und der Produktion von sekundären Metaboliten verwendet werden können. Das in dieser Studie beschriebene detaillierte Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Erzeugung haariger Wurzeln kann nach der Anpassung für jede genetische Transformation oder andere Heilpflanzen übernommen werden.

Einleitung

Tartary Buchweizen (TB)(Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn) ist eine Art von Dikotyledon aus der Gattung Fagopyrum und der Familie Polygonaceae1. Als eine Art von homologen Lebensmitteln in der chinesischen Medizin hat TB aufgrund ihrer ausgeprägten chemischen Zusammensetzung und ihrer vielfältigen Bioaktivitäten gegen Krankheiten großes Interesse erhalten. TB ist in erster Linie reich an Kohlenhydraten, Proteinen, Vitaminen und Carotinoiden sowie an Polyphenolen wie Phenolsäuren und Flavonoiden1. Verschiedene biologische und pharmakologische Aktivitäten von Flavonoiden, einschließlich antioxidative, antihypertensive2, und entzündungshemmende sowie Anti-Krebs und antidiabetische Eigenschaften wurden gezeigt3.

Agrobacterium rhizogenes ist ein Bodenbakterium, das zur Entwicklung von haarigen Wurzelerkrankungen in mehreren höheren Pflanzen, insbesondere Dikotyledonen, beiträgt, indem es Wundstellen4,5infiziert. Dieser Prozess wird durch die Übertragung der T-DNA in das wurzelinduzierende (Ri) Plasmid5,6 eingeleitet und wird häufig von der Integration und Expression eines exogenen Gens aus dem Ri-Plasmid und den nachfolgenden Schritten zur Erzeugung des haarigen Wurzelphäpusten7begleitet. A. rhizogenes-vermittelte transgene Haarwurzeln, als ein leistungsfähiges Werkzeug auf dem Gebiet der Pflanzenbiotechnologie, wurden aufgrund ihrer stabilen und hohen Produktivität und der einfachen Beschaffung in kurzer Zeit am häufigsten eingesetzt. Darüber hinaus zeichnen sich behaarte Wurzeln, die von A. rhizogenes induziert werden, effizient durch ihre plagiotrope Wurzelentwicklung und ein stark verzweigtes Wachstum in einem hormonfreien Medium8aus. Sie können in verschiedenen Forschungsbereichen eingesetzt werden, einschließlich der künstlichen Samenproduktion, der Wurzelknötchenforschung und bei der Untersuchung der Wechselwirkungen mit anderen Organismen wie Mykorrhizapilzen, Nematoden und Wurzelregern7,9. Darüber hinaus wurden haarige Wurzeltransformationskulturen ausgiebig als experimentelles System verwendet, um die biochemischen Wege und chemische Signalisierung zu untersuchen und pflanzliche sekundäre Metaboliten zu produzieren, die als Pharmazeutika, Kosmetika und Lebensmittelzusatzstoffe8,10verwendet werden. Die wertvollen sekundären Metaboliten, einschließlich Indole-Alkaloide, Aconite, Tropanalkaloide, Terpenoide und Flavonoide, synthetisiert in wildartigen haarigen Wurzeln wurden seit mehreren Jahrzehnten in zahlreichen Arten untersucht, wie Ginsenosid in Panax Ginseng11, Coumarine in Ammi majus12, und Phenolverbindungen in TB2,13.

Haarige Wurzeln wurden mit A. rhizogenes in 79 Pflanzenarten aus 27 Familien14hergestellt. Zum Beispiel, A. rhizogenes-vermittelte haarige Wurzeltransformation wurde in Sojabohnen15,16, Salvia17, Plumbago indica18, Lotus japonicus19, und Chicorée (Cichorium intybus L.) berichtet 20. TB haarige Wurzeltransformation wurde auch untersucht2. Es gibt nur wenige detaillierte Protokolle zur Entwicklung haariger Wurzeln, die von A. rhizogenes vermittelt werden, die entweder einen binären Vektor tragen oder nicht. Zum Beispiel führten Sandra et al.21 eine Methode zur Herstellung transgener Kartoffelhaarwurzeln ein, die in Wildtrieben getragen werden. Die voll entwickelten haarigen Wurzeln konnten 5-6 Wochen nach der Injektion von A. rhizogenes visualisiert werden, die das gus-Reporter-Gen in die Stamminternoden von Kartoffelpflanzen tragen. Eine andere Studie hatte auch berichtet, dass ein transgenes haariges Wurzelsystem, das von A. rhizogenes induziert wurde, das gusA-Reportergen in Jute(Corchorus capsularis L.) beherbergte. 22. Darüber hinaus erhielten Supaart et al.23 transgene Tabakhaarwurzeln mit A. rhizogenes, die mit dem Expressionsvektor pBI121 transformiert wurden, der das Gen von1-Tetrahydrocannabinolic acid (THCA) Synthase trug, um THCA zu produzieren.

Ein Schrittweise-Prozess für eine effektive Generierung haariger Wurzeltransformation, insbesondere bei TB, wurde jedoch relativ weniger demonstriert. In dieser Studie haben wir ein detailliertes Protokoll mit A. rhizogenes beschrieben, das das Reportergen (GFP), einen selektiven Marker (Kan) und ein Gen von Interesse (b4, ein aus unserer Gruppe identifiziertes, aber unveröffentlichtes Gen aus der grundlegenden Helix-Loop-Helix (bHLH) Familie verwendet, um eine haarige Wurzelgenetische Transformation bei TB zu erzeugen. Das Experiment dauerte 5-6 Wochen, von der Inokulation von Samen bis zur Erzeugung von haarigen Wurzeln, die die Explantation, Infektion, Kokultivierung, Subkulierung und anschließende Vermehrung beinhalteten. Darüber hinaus wurde A. rhizogenes, das ein binäres Plasmid mit dem TB-Transgen des Myeloblastose-Transkriptionsfaktors 116 (FtMYB116) enthält, verwendet, um festzustellen, ob FtMYB116 die Ansammlung von Flavonoiden, insbesondere Rutin, bei TB auf Gen- und Metabolzenebene durch die haarige TB-Wurzeltransformation fördern kann. FtMYB116, ein lichtinduzierter Transkriptionsfaktor, reguliert die Synthese von Rutin unter verschiedenen Lichtbedingungen5. Chalcone-Synthase (CHS), Flavanon-3-Hydroxylase (F3H), Flavonoid-3'-Hydroxylase (F3'H), und Flavonol-Synthase (FLS)24 sind Schlüsselenzyme, die am Stoffwechselweg der Rutin-Biosynthese beteiligt sind. Daher zeigt diese Studie die Überexpression von FtMYB116 bei TB haarigen Wurzeln und die Expression von wichtigen Enzymgenen sowie den Gehalt an Rutin und anderen Flavonoiden wie Quercetin.

Protokoll

Die in dieser Studie verwendete TB wurde bt18 genannt, die aus der Rasse "JinQiao No.2" stammt, die vom Research Center of Small Miscellaneous Grain of Shanxi Academy of Agricultural Science angebaut wurde. Die wichtigsten Schritte dieses Protokolls sind in Abbildung 1dargestellt.

HINWEIS: Betreiben Sie Explanten-bezogene Manipulationen schnell, und halten Sie die Petrischalen nach Möglichkeit geschlossen, um Welken und Kontaminationen zu vermeiden. Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Explant-Inkubationen unter der Bedingung einer 14-h-Licht- und einer 10-h-Dunkelphotoperiode bei 25 °C durchgeführt. Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Explanten- oder Bakterienoperationen unter aseptischen Bedingungen in einer laminaren Strömungshaube durchgeführt. Alle Medienzutaten für A. rhizogenes und in vitro Pflanzenkulturen sind in Tabelle 1enthalten. Nach der Einstellung des pH-Werts wurden alle Medien bei 120 °C für 20 min autoklaviert. Verfestigte Medien wurden hergestellt, indem 25 ml Medium in eine Petrischale mit 9 cm Durchmesser gefüllt und verfestigt werden konnten.

VORSICHT: Legen Sie alle genetisch veränderten Bakterien und Pflanzen in den entsprechenden Abfallbehälter. Betreiben Sie alle gefährlichen Chemikalien in einem Rauchschrank und deponieren Sie sie im Gefahrstoffbehälter.

1. Herstellung von TB-Expflanzen

  1. Herstellung von TB-Samen
    1. Wählen Sie plump und unbeschädigte TB-Samen(Abbildung 1A1), die bei einer Temperatur von weniger als 20 °C für nicht mehr als 2 Jahre konserviert wurden.
    2. Die Samen ca. 20 min in Wasser einweichen, damit die Samenschicht leicht abgeschält werden kann (Abbildung 1A2). Verwenden Sie bei Bedarf eine Schere, um einen Schlitz auf den Samen zu schneiden, um das Peeling zu erleichtern.
  2. Sterilisation von TB-Samen
    1. 100–200 geschälte Samen in einen 100 ml sterilisierten konischen Kolben geben.
    2. Desinfizieren Sie die Samen mit 75% Ethanol für 30 s.
    3. Ersetzen Sie das Ethanol durch 5% Natriumhypochlorit und desinfizieren Sie es 15 min.
      HINWEIS: Die Desinfektion mit Quecksilberbichlorid in einer Konzentration von 1 g/L für 8 min kann als alternativer Sterilisator verwendet werden, um Natriumhypochlorit in jedem Fall einer unzureichenden Sterilisation zu ersetzen.
      VORSICHT: Quecksilberbichlorid ist gefährlich und kein umweltfreundliches Material. Betreiben Sie es im umlaufenden Schrank und legen Sie es in den Behälter für gefährliche Abfälle, wenn Quecksilberbichlorid in jedem Fall verwendet wird.
    4. Gießen Sie das Natriumhypochlorit aus.
    5. Waschen Sie die Samen mit sterilem entionisiertem Wasser 5 mal.
    6. Die Samen mit einem sterilen bibulösen Papier trocknen lassen.
  3. Herstellung von TB-Sämlingen
    1. Bereiten Sie 50 ml Murashige und Skoog (MS) Basalmedium (1962) ergänzt mit 30 g/L Saccharose und 7 g/L Agarpulver (MSSA) (Tabelle 1) in einer 300 ml Pflanzengewebekulturflasche vor.
    2. Stellen Sie den pH-Wert vor dem Autoklavieren auf 5,8 ein.
    3. Verteilen Sie 10 Samen gleichmäßig pro Flasche MSSA Medium.
    4. Die Samen in einem Kulturraum bei 25 °C bei 1 °C unter dem Lichtzustand für 7-10 Tage keimen.
  4. Herstellung steriler Expflanzen
    1. Wählen Sie robuste Sämlinge von TB (Abbildung 1C), wenn die 2 Stücke von Kotyledonen entfaltet werden.
    2. Schneiden Sie die Sämlinge von den Wurzeln ab (Abbildung 1C Rot-Dash-Pfeilspitzen),um den Kontakt mit dem Medium zu vermeiden.
    3. Legen Sie sie in eine sterile Petrischale.
    4. Die Hypocotyle in 0,8–1 cm große Segmente schneiden und die Kotyledonen in ca. 0,5 cm stücken scheren.
    5. Präkultur diese Explants auf MSSA Medium unter der Lichtbedingung für 24 h.
    6. Übertragen Sie sie in einen 100 ml sterilisierten konischen Kolben, die nun für eine Infektion bereit sind.

2. Vorbereitung von A. rhizogenes für die Transformation

HINWEIS: Der A. rhizogenes-Stamm ACCC10060 wurde freundlicherweise vom Institut für Medizinische Pflanzenentwicklung zur Verfügung gestellt und bei 80 °C konserviert. A. rhizogenes wurde mit dem binären Vektor pK7GWIWG2D (II) transformiert, der eine T-DNA mit dem b4-Gen, das ein GFP als Indikatorgen begleitet, und dem Kan-Resistenzgen als wählbarem Marker beherbergt. Das Gen b4 ist ein Mitglied der Transkriptionsfaktor bHLH Familie, die noch nicht veröffentlicht wurde. Um das Potenzial von TB-Haarwurzeln zu bewerten, wurde A. rhizogenes mit dem binären Vektor pK7WG2D transformiert, der das MYB116-Gen enthält, um seine Wirkung auf die Produktion von sekundären Metaboliten wie Flavonoiden auf der Ebene der Genexpression und durch metabolische Analysen zu untersuchen. Aktivierte A. rhizogenes sollten gleichzeitig mit den Expflanzen gut vorbereitet sein.

  1. Aktivierung von A. rhizogenes
    1. Tau A. rhizogenes auf Eis
    2. Tauchen Sie die Bakterien und linie sie gleichmäßig auf Hefe Mannitol Medium (YEB) ergänzt mit 15 g/L Agar Pulver, 50 mg/L Rifampicin, und 50 mg/L Spectinomycin (YEBARS, pH 7.0).
    3. Inkubieren Sie die Bakterien bei 28 °C für 12-16 h.
    4. Wählen Sie eine monoklonale Kolonie und kulturen Sie sie in einer anderen Petrischale in der oben beschriebenen Weise.
    5. Wählen Sie monoklonale Kolonien und kulturen Sie sie in einem 100 ml sterilisierten konischen Kolben mit 20 ml YEB-Medium, ergänzt mit 50 mg/L Rifampicin und 50 mg/L-Spektinomycin (YEBRS, pH 7,0) bei 28 °C und 200 U/min für 16–18 h, bis der OD600-Wert 2,0 erreicht.
    6. In einem weiteren 100-ml-Konuskolben, der 20 ml YEBRS-Medium bei 28 °C und 200 U/min bei 4-5 h enthält, bis der OD600-Wert etwa 0,5 erreicht ist, 2%–4% der oben genannten Kultur inkubieren (Abbildung 1D).

3. Infektion und Screening von TB-Expflanzen

HINWEIS: Das Ziel dieses Protokolls ist es, genetisch transformierte haarige Wurzeln zu erhalten. Die Wildtypwurzeln wurden als Negativkontrolle verwendet, um die transgene Expression zu bewerten. In diesem Protokoll wurde A. rhizogenes mit dem binären Vektor entweder pK7WG2D transformiert, der das Gen von FtMYB116 oder pK7GWIWG2D (II) mit dem Gen b4 im Voraus trägt.

  1. Resuspension von A. rhizogenes
    1. Übertragen Sie die in Schritt 2.1.6 erhaltene Kultur in ein 50-ml sterilisiertes Zentrifugalrohr.
    2. Drehen Sie bei 4.000 x g für 10 min bei 20 °C.
    3. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das bakterielle Pellet mit MS-Medium, ergänzt mit 30 g/L Saccharose und 300 M Acetosyringon (AS) (MSSAS, pH 5.8) auf OD600 bei 0,2, wieder ab.
  2. Infektion von Expflanzen
    1. Infundieren Sie die in Schritt 3.1.3 erhaltene bakterielle Suspension in einen konischen Kolben, der die in Schritt 1.4.6 hergestellten Exaten für 10 min enthält (Abbildung 1E).
    2. Nehmen Sie die Explants heraus und bposten Sie sie mit einem sterilen bibulösen Papier.

4. Kokultur von Expflanzen mit A. rhizogenes

  1. Legen Sie ein steriles Filterpapier mit 9 cm Durchmesser auf das MS-Medium, das mit 7 g/L Agarpulver verfestigt wird, ergänzt mit 30 g/L Saccharose und 100 m AS (MSSAAS-Medium, pH 5,2).
  2. Überlagern Sie die Expflanzen auf dem Filterpapier bei 25 °C für 3 Tage im Dunkeln (Abbildung 1F).

5. Induktion und selektive Kultur

  1. Platzieren Sie etwa 20 infizierte Explanten auf dem MSSA-Medium, ergänzt durch 500 mg/L Cefotaxim und 50 mg/L Kanamycin (Kan) (MSSACK, pH 5.8) (Abbildung 1G).
  2. Inkubieren Sie sie vertikal unter der Lichtbedingung bei 25 °C bei 1 °C. Die haarigen Wurzeln treten etwa 1 Woche nach der Inkubation auf(Abbildung 1H Schwarz-Dash-Pfeilspitzen zeigen das Auftreten haariger Wurzeln an).
    HINWEIS: Ersetzen Sie MSSACK Medium bei Bedarf alle 15 Tage.

6. Subkulierende TB haarige Wurzeln

HINWEIS: Dieses Verfahren zielt darauf ab, kräftige haarige Wurzeln zu ernten. Beobachten Sie regelmäßig das Wachstum haariger Wurzeln während der Vermehrung, und entfernen Sie die kontaminierten und inaktivierten in einer rechtzeitigen Weise. Wiederholen Sie bei Bedarf die folgenden Schritte, um haarigere Wurzeln zu propagieren. Es dauert etwa 10 bis 14 Tage von der Subkulesiierung bis zur Ernte.

  1. Wählen Sie die haarigen Wurzeln, die weißes Aussehen und schnelles Wachstum zeigen.
  2. Schneiden Sie sie in Stücke von 2-3 cm.
  3. Sie werden eindeutig auf einer sauberen Bank nummerieren.
  4. Subkultur sie in einem 100 ml sterilisierten konischen Kolben mit 5 ml MS-Medium, ergänzt durch 30 g/L Saccharose und 50 mg/L Kan (MSSK, pH 5,8) mit einer Drehgeschwindigkeit von 80 U/min bei 25 °C im Dunkeln, bis sie sich bis zum Boden des Kolbens überbreiten (Abbildung 1I).

7. Identifizierung von transformierten haarigen Wurzeln und Konservierung

HINWEIS: Transformierte haarige Wurzeln können anhand der Aspekte der Morphologie und des Genspiegels identifiziert werden. Die Identifizierung kann auch entsprechend dem haarigen Wurzelgenom und dem Widerstand durchgeführt werden, die in diesem Protokoll nicht abgedeckt sind. Dieses Verfahren konzentriert sich in erster Linie auf die Identifizierung von Reportergenunden und Zielgenen.

  1. Entfernen Sie tawny und kontaminierte haarige Wurzeln und wählen Sie diejenigen mit weißem Aussehen.
  2. Bewerten Sie, ob unter einem blau/lichtdualen ultravioletten Transilluminator eine grüne Fluoreszenz vorhanden ist.
  3. Wählen Sie die haarigen Wurzeln aus, die ein starkes Fluoreszenzsignal in den nummerierten Röhren aufweisen, oder wickeln Sie sie mit einem markierten Tinfoil, nachdem Sie sie mit einem saugfähigen Papier ausgetrocknet haben.
  4. Lyophilisieren Sie sie in flüssigem Stickstoff, gefolgt von der Lagerung der gesamten Ernte bei 80 °C für weitere Untersuchungen.
  5. Genidentifikation
    1. Trituieren Sie 0,1 g der haarigen Wurzeln zu feinem Pulver in flüssigem Stickstoff.
    2. Bereiten Sie die genomische DNA unabhängiger transgener TB-Linien mit der modifizierten Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB)-Methode25 nach Anweisung des Herstellers des pflanzlichen genomischen DNA-Kits vor.
    3. Führen Sie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit 100 ng genomischer DNA-Vorlage und Primern aus, die in Tabelle 2aufgeführt sind.
    4. Führen Sie den Amplifikationszyklus wie folgt durch: Vordenaturierung bei 94 °C für 5 min, Denaturierung bei 94 °C für 30 s, Primerglühen bei 55 °C für 30 s und Grundverlängerung bei 72 °C für 30 s. Nach 36 Zyklen und einem letzten Verlängerungsschritt bei 72 °C für 10 min, analysieren Sie die Amplifikationsprodukte auf 1% Agarose-Gelen.
    5. Färben Sie die Gele mit Nukleinsäurefärbung und visualisieren Sie sie unter UV-Licht.

Ergebnisse

Agrobacterium rhizogenes-vermittelte TB haarige Wurzeltransformation
Diese Studie beschreibt das Schritt-für-Schritt-Protokoll, das eingerichtet wurde, um genetisch transformierte haarige Wurzeln mit A. rhizogeneszu erhalten. Es dauerte etwa 5-6 Wochen von der Impfung von TB-Samen bis zur Ernte der identifizierten haarigen Wurzeln, und einige wichtige Schritte sind in Abbildung 1 (A-H) dargestellt. Kurz gesagt, sterilisierte Schalensame...

Diskussion

TB wurde in mehreren Studien im Zusammenhang mit sekundären Metaboliten auf genetischen und metabolischen Ebenen1,2,5,27,28verwendet. Haarige Wurzelkultur, als eine einzigartige Quelle für die Metabolitenproduktion, spielt eine zentrale Rolle in metabolischen Engineering29 und kann verwendet werden, um Stoffwechselwege durch Einfügen...

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von den Grundlagenforschungsfonds der zentralen öffentlichen Wohlfahrtsforschungsinstitute ZXKT17002 unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
2*Taq PCR MasterMixAidlab, ChinaPC0901
Agar powderSolarbio Life Science, Beijing, ChinaA8190
Applied Biosystems 2720 thermo cyclerThermoFisher Scientific, USA37834
ASSolarbio Life Science, Beijing, ChinaA8110Diluted in DMSO, 100 mM
binary vectorsThermoFisher Scientific (invitrogen), US/pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II)
Cefotaxime,sodiumSolarbio Life Science, Beijing, ChinaC8240Diluted in Water, 200 mg/mL
CF15RXII high-speed microHitachi, JapanNo. 90560201
Diposable Petri-dishGuanghua medical instrument factory, Yangzhou, China/
DYY-6C electrophoresis apparatusBjliuyi, Beijing ChinaECS002301
EASYspin Plus Plant RNA KitAidlab, ChinaRN38
ELGA purelab untra bioscienceELGA LabWater, UK82665JK1819
Epoch Microplate Spectrophotometerbiotek, US/
Gateway BP/LR reaction enzymeThermoFisher Scientific (invitrogen), US11789100/11791110
HYG-C multiple-function shakerSuzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China/
KanSolarbio Life Science, Beijing, ChinaK8020Diluted in Water, 100 mg/mL
MLS-3750 Autoclave sterilizerSanyo, Japan/
MS salts with vitaminsSolarbio Life Science, Beijing, ChinaM8521
NaClSolarbio Life Science, Beijing, ChinaS8210
Other chemicals unstatedBeijing Chemical Works, Chinaethanol, mercury bichloride, etc.
PHS-3C pH meterShanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, Chinaa008
Plant Genomic DNA KitTIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTDDP305
RifampinSolarbio Life Science, Beijing, ChinaR8010Diluted in DMSO, 50 mg/mL
SpectinomycinSolarbio Life Science, Beijing, ChinaS8040Diluted in Water, 100 mg/mL
SucroseSolarbio Life Science, Beijing, ChinaS8270
Trans2K DNA MarkerTransGen Biotech, Beijing, ChinaBM101-01
TryptoneSolarbio Life Science, Beijing, ChinaLP0042
Whatman diameter 9 cm Filter paperHangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd/
Yeast Extract powderSolarbio Life Science, Beijing, ChinaLP0021

Referenzen

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