JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Описываем метод индуцирования волосатых корней агробактериями ризогенов-опосредованногопреобразования в тартарной гречке(Fagopyrum tataricum). Это может быть использовано для исследования функций генов и производства вторичных метаболитов в тартарной гречихе, быть принятым для любой генетической трансформации, или использоваться для других лекарственных растений после улучшения.

Аннотация

Тартарная гречка (ТБ) -Фагопирум татарикум (L.) Gaertn) обладает различными биологическими и фармакологическими видами деятельности, поскольку содержит обильные вторичные метаболиты, такие как флавоноиды, особенно рутетин. Агробактерии rhizogenes постепенно используются во всем мире, чтобы вызвать волосатые корни в лекарственных растений для исследования функций генов и повышения урожайности вторичных метаболитов. В этом исследовании мы описали подробный метод для создания A. rhizogenes-опосредованноговолосатые корни при туберкулезе. Cotyledons и hypocotyledonary соты на 7-10 дней были выбраны в качестве explants и инфицированных A. rhizogenes проведения бинарного вектора, который индуцированных приключений волосатые корни, которые появились после 1 недели. Генерируемая трансформация волосатых корней была определена на основе морфологии, отбора резистентности (канамицин) и экспрессии генов репортера (зеленый флуоресцентный белок). Впоследствии, преобразованные волосатые корни были самораспространены по мере необходимости. Между тем, миелобластоз (MYB) транскрипционный фактор, FtMYB116, был преобразован в геном тб с помощью A. rhizogenes-опосредованноговолосатые корни для проверки роли FtMYB116 в синтезации флавоноидов. Результаты показали, что экспрессия генов, связанных с флавоноидами, и урожайность флавоноидных соединений (рутина и кверцетина) были значительно (p qlt; 0.01) способствовали FtMYB116, что свидетельствует о том, что A. rhizogenes-опосредованныеволосатые корни могут быть использованы в качестве эффективного альтернативного инструмента для исследования функций генов и производства вторичных метаболитов. Подробный пошаговый протокол, описанный в данном исследовании для генерации волосатых корней, может быть принят для любой генетической трансформации или других лекарственных растений после корректировки.

Введение

Тартарная гречка (ТБ)(Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn) является одним из видов дикотипидона, относящихся к роду Фагопирум и семейство Polygonaceae1. Как вид гомологионной пищи китайской медицины, ТБ получает значительный интерес благодаря своему характерю химического состава и разнообразной биоактивности против болезней. Туберкулез в основном богат углеводами, белками, витаминами и каротиноидами, а также полифенолами, такими как фенольные кислоты и флавоноиды1. Продемонстрировано различные биологические и фармакологические свойства флавоноидов, в том числе антиоксидативные, антигипертензивные2и противовоспалительные, а также противораковые и антидиабетическиесвойства.

Agrobacterium rhizogenes является бактериейпочвы,которая способствует развитию волосатых корнеплодов в нескольких высших растений, особенно dicotyledons, путем заражения раны сайтов4,5. Этот процесс инициируется передачей T-ДНК в корневой плазмид(Ri) плазмид 5,,6 и обычно сопровождается интеграцией и экспрессией экзогенного гена из плазмида Ri и последующими шагами генерации волосатого фенотипа корня7. A.rhizogenes-опосредованные трансгенные волосатые корни, как мощный инструмент в области биотехнологии растений, наиболее широко используются благодаря их стабильной и высокой производительности и легкому получению в короткий период. Кроме того, волосатые корни, индуцированные A. rhizogenes эффективно отличаются их плагиотропного развития корня и высоко ветвления роста в гормон-свободной среде8. Они могут быть использованы в нескольких областях исследований, в том числе искусственного производства семян, исследования корневых узелков, а также при изучении взаимодействия с другими организмами, такими как микоризные грибы, нематод, и корнеплоды7,9. Кроме того, волосатые культуры преобразования корней широко используются в качестве экспериментальной системы для исследования биохимических путей и химической сигнализации и для производства вторичных метаболитов растений, которые используются в качестве фармацевтических препаратов, косметики и пищевых добавок8,10. Ценные вторичные метаболиты, в том числе индоле алкалоиды, акониты, тропановые алкалоиды, терпеноиды и флавоноиды, синтезированные в волосатых корнях дикого типа, были исследованы в течение нескольких десятилетий у многочисленных2,видов, таких как ginsenoside в panax ginseng11, кумарин в Am majmius12, и phenolic compounds.

Волосатые корни были произведены с использованием A. rhizogenes в 79 видов растений из 27 семейства14. Например, A. rhizogenes-опосредованныеволосатые корня преобразование было сообщено в сое15,16, Сальвиа17, Пламбаго Indica18, Lotus japonicus19, и цикорий (Cichorium intybus Л.) 20. ТБ волосатые преобразования корня также были исследованы2. Немногие подробные протоколы доступны в отношении развития волосатые корни при посредничестве A. rhizogenes либо проведение бинарный вектор или нет. Например, Sandra et al.21 внедрили метод производства трансгенных картофельных волосатых корней, выдержанный в побегах дикого типа. Полностью развитые волосатые корни могут быть визуализированы через 5-6 недель после инъекции А. ризогенов, несущих ген gus reporter в стволовые межузлы картофельных растений. Другое исследование также сообщило трансгенной волосатой корневой системы, индуцированной A. rhizogenes укрывательство гена репортера gusA в джуте (Corchorus capsularis L.) 22. Кроме того, Supaart et al.23 получили трансгенные табачные волосатые корни с использованием A. rhizogenes, преобразованного с помощью экспрессионного вектора pBI121, несущего ген синтазы 11-тетрагидроканнабиноловой кислоты (ТГКА) для производства ТГКА.

Однако поэтапный процесс эффективного поколения трансформации волосатых корней, особенно при тб-тбе, был относительно менее продемонстрирован. В этом исследовании, мы описали подробный протокол с использованием A. rhizogenes проведения репортер гена (GFP), селективный маркер (Кан), и ген интереса (b4, определены из нашей группы, но неопубликованный ген из основных селип-петля-сhelix (bHLH) семьи) для создания волосатых корней генетической трансформации при туберкулезе. Эксперимент длился 5-6 недель, от прививки семян до генерации волосатых корней, включая препарат эксплантации, инфекцию, сокультивирование, субкультирование и последующее распространение. Кроме того, A. rhizogenes, содержащий бинарную плазмиду, несущую тб-трансген транскрипционного фактора миелобластоза 116 (FtMYB116),был использован для определения того, может ли FtMYB116 способствовать накоплению флавоноидов, особенно рутения, в туберкулезе на гене и метаболическом уровне через тб-волосатую трансформацию корня. FtMYB116, который является светоиндуцированным транскрипционным фактором, регулирует синтез рутения при различных условиях света5. Синкон синтаза (CHS), флаванон-3-гидроксилаза (F3H),флавоноид-3'-гидроксилаза (F3'H), и флавонол синтаза (FLS)24 являются ключевыми ферментами, участвующими в метаболический путь биосинтеза рутина. Таким образом, это исследование демонстрирует переэкспрессию FtMYB116 в ТБ волосатые корни и экспрессия ключевых генов фермента, а также содержание рутения и других флавоноидов, таких как кверцетин.

протокол

Туберкулез, используемый в этом исследовании, был назван BT18, который возник из породы "Цзиньцзяо No 2", культивируемой Исследовательским центром малого разного зерна Академии сельскохозяйственной науки Шаньси. Основные этапы этого протокола иллюстрируются на рисунке 1.

ПРИМЕЧАНИЕ: Работа explants связанных манипуляций быстро, и, когда это возможно, держать Петри блюда закрыты, чтобы избежать увядания и загрязнения. Если не указано иное, все эксплантные инкубации проводились при состоянии 14-х света и 10-х темного фотопериода при 25 градусах Цельсия. Если иное не указано, все explants- или бактерий, связанных операций были выполнены в асептических условиях в ламинарный капот потока. Все средства массовой информации ингредиенты для A. rhizogenes и in vitro культур растений предоставляются в таблице 1. После регулировки рН, все носители были автоматически заведомо при 120 градусах по Цельсию в течение 20 мин. Твердые носители были подготовлены путем заполнения 25 мл среднего в чашку Петри диаметром 9 см и позволяющие ему затвердеть.

ВНИМАНИЕ: Депозит все генетически модифицированные бактерии и растения в соответствующий контейнер отходов. Эксплуатировать все опасные химические вещества в дымовом шкафу и откладывать их в контейнер для опасных отходов.

1. Подготовка противотуберкулезных установок

  1. Подготовка семян туберкулеза
    1. Выберите пухлые и неповрежденные семена туберкулеза(рисунок 1A1),которые сохраняются при температуре менее 20 градусов по Цельсию в течение не более 2 лет.
    2. Замочите семена в воде при 28 градусах по Цельсию в течение примерно 20 минут, чтобы семя слоя можно было легко снять(рисунок 1A2). При необходимости используйте ножницы, чтобы вырезать слот на семена для облегчения пилинг.
  2. Стерилизация семян туберкулеза
    1. Поместите 100-200 очищенных семян в стерилизненую конильную колбу 100 мл.
    2. Дезинфицировать семена с помощью 75% этанола в течение 30 с.
    3. Замените этанол 5% гипохлорит натрия и дезинфицировать в течение 15 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дезинфекция с использованием бихлорида ртути в концентрации 1 г/л в течение 8 минут может быть использована в качестве альтернативного стерилизатора для замены гипохлорита натрия в любом случае недостаточной стерилизации.
      ВНИМАНИЕ: Меркурий бихлорид является опасным, а не экологически чистый материал. Эксплуатировать его в дымящийся шкаф и сажать в контейнер для опасных отходов, если в любом случае используется ртуть бихлорид.
    4. Вылейте гипохлорит натрия.
    5. Вымойте семена с помощью стерильной деионизированной воды 5 раз.
    6. Прожтели семена сухими стерильной бибулульной бумагой.
  3. Подготовка саженцев туберкулеза
    1. Подготовка 50 мл Мурашиге и Skoog (MS) базальной среде (1962) дополнены 30 г / л сахарозы и 7 г / l агар порошок (MSSA) (Таблица 1) в 300 мл растительной ткани бутылки.
    2. Отрегулируйте рН до 5.8 перед autoclaving.
    3. Распределите 10 семян равномерно на бутылку среды MSSA.
    4. Пронзите семена в культурном зале при 25 градусах Цельсия и 1 кв с при условии света в течение 7-10 дней.
  4. Приготовление стерильных эксплуатсов
    1. Выберите надежные саженцы туберкулеза(рисунок 1C), когда 2 части котиледона развернуты.
    2. Отрежьте саженцы от корней(Рисунок 1C красно-даковых наконечников стрел),избегая контакта со средой.
    3. Поместите их в стерильное блюдо Петри.
    4. Нарежьте гипокотилы на 0,8-1 см сегментами и стриги котиддоны примерно на 0,5 см.
    5. Прекультуры этих экскультуры на MSSA среды при условии света для 24 ч.
    6. Перенесите их в стерилизненую конильную колбу 100 мл, которая теперь готова к заражению.

2. Подготовка А. ризогенов для преобразования

ПРИМЕЧАНИЕ: Штамм A. rhizogenes ACCC10060 любезно предоставлен Институтом развития лекарственных растений и сохранен при 80 градусах Цельсия. A. rhizogenes был преобразован с бинарным вектором pK7GWIWG2D (II), который укрывает T-ДНК, несущий ген b4, сопровождающий ген GFP в качестве гена индикатора и ген ажиотажа сопротивления Кана в качестве выбираемого маркера. Ген b4 является членом семейства транскрипционных факторов bHLH, который еще не опубликован. Для оценки потенциала тб волосатых корней, A. rhizogenes был преобразован с бинарным вектором pK7WG2D, содержащим ген MYB116, чтобы исследовать его влияние на производство вторичных метаболитов, таких как флавоноиды на уровне экспрессии генов и путем метаболического анализа. Активированный A. rhizogenes должен быть хорошо подготовлен в то же время с explants.

  1. Активация а. ризогенов
    1. Оттепель А. rhizogenes на льду
    2. Опустите бактерии и выровняйте их равномерно на дрожжевой маннитол среды (YEB) дополнены 15 г / л агар порошок, 50 мг / л рифампицин, и 50 мг / л спектриномицин (YEBARS, рН 7.0).
    3. Инкубировать бактерии при 28 градусах по Цельсию в течение 12-16 ч.
    4. Выберите моноклональную колонию и культивайте ее в другом блюде Петри в том же вышеописанном ключе.
    5. Выберите моноклональные колонии и культуры их в 100 мл стерилизованной конической колбы, содержащей 20 мл среды YEB дополнены 50 мг / л рифампицин и 50 мг / л спектриномицин (YEBRS, pH 7.0) при 28 кс и 200 об/ и 200 об/ чем на 16-18 л, пока значение OD600 не достигнет 2.0.
    6. Инкубировать 2%-4% вышеупомянутой культуры в другой конической колбе калибра 100 мл, содержащей 20 мл среды YEBRS при 28 градусах Цельсия и 200 об/мин при 4-5 ч, пока значение OD600 не достигнет примерно 0,5(рисунок 1D).

3. Инфекция и скрининг на оргии

ПРИМЕЧАНИЕ: Цель этого протокола состоит в том, чтобы получить генетически преобразованные волосатые корни. Корни дикого типа использовались в качестве отрицательного контроля для оценки трансгенного выражения. В этом протоколе, A. rhizogenes был преобразован с бинарным вектором либо pK7WG2D проведения гена FtMYB116 или pK7GWIWG2D (II) проведение гена b4 заранее.

  1. Отсрочка А. ризогенов
    1. Передача культуры, полученной в шаге 2.1.6, в стерилизную центробежную трубку мощностью 50 мл.
    2. Спин при 4000 х г в течение 10 мин при 20 градусах Цельсия.
    3. Удалите супернатант и повторно бактериальные гранулы с MS среды дополняется 30 г / l сахарозы и 300 мкм ацетосирингон (AS) (MSSAS, рН 5,8) до OD600 '0.2.
  2. Инфекция эксплантов
    1. Наполнить бактериальной подвеской, полученной в шаге 3.1.3 в коническую колбу, содержащую вылазывания, подготовленные в шаге 1.4.6 за 10 мин(Рисунок 1E).
    2. Выняйте экспланты и сужайте их с помощью стерильной бибулульной бумаги.

4. Культура экскультуры с A. rhizogenes

  1. Поместите стерильную фильтровальную бумагу диаметром 9 см на среде MS, которая затвердевает с помощью 7 г/л агар-порошка, дополненного сахарозой 30 г/л и 100 мкм AS (MSSAAS medium, pH 5.2).
  2. Наложение эксрастенив на фильтровальную бумагу при 25 градусах По Цельсия в течение 3 дней в темноте(рисунок 1F).

5. Индукционная и селективная культура

  1. Поместите приблизительно 20 инфицированных эксрастений на среду MSSA, дополненную 500 мг/л цефотаксима и 50 мг/л канамицина (Кан) (MSSACK, pH 5.8)(Рисунок 1G).
  2. Инкубировать их вертикально при состоянии света при 25 градусах Цельсия и 1 кв. м. Волосатые корни возникают примерно через 1 неделю после инкубации(рисунок 1H черно-дэшнс наконечники стрел указывают на появление волосатых корней).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Заменить msSACK среды каждые 15 дней, если это необходимо.

6. Субкультирование ТБ волосатые корни

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура направлена на сбор энергичных волосатых корней. Регулярно наблюдайте за ростом волосатых корней во время распространения и своевременно удаляйте загрязненные и инактивированные корни. При необходимости повторите следующие шаги, чтобы распространить более волосатые корни. От субкультивирования до сбора урожая уходит примерно 10-14 дней.

  1. Выберите волосатые корни, показывающие белый вид и быстрый рост.
  2. Нарежьте их на кусочки 2-3 см.
  3. Очевидно, число их на чистой скамейке.
  4. Субкультура их в 100 мл стерилизованной конической колбы, содержащей 5 мл MS среды дополнены 30 г / л сахарозы и 50 мг / л Кан (MSSK, рН 5,8) на роторной скорости 80 об/ ч при 25 градусов по Цельсию в темноте, пока они не распространились на дно колбы (Рисунок 1I).

7. Определение трансформированных волосатых корней и сохранение

ПРИМЕЧАНИЕ: Преобразованные волосатые корни могут быть определены на основе аспектов морфологии и уровня генов. Идентификация также может проводиться в соответствии с волосатым геномом корня и сопротивлением, которые не охвачены в этом протоколе. Эта процедура в первую очередь фокусируется на гене репортера и идентификации гена.

  1. Удалите рыжие и загрязненные волосатые корни и выберите те, с белой внешностью.
  2. Оцените, есть ли зеленая флуоресценция под синим/светлым двойным ультрафиолетовым трансиллюминолором.
  3. Выберите волосатые корни, демонстрирующие сильный сигнал флуоресценции в пронумерованных трубках или завернутые с помощью отмеченной фольги после высыхания их с абсорбирующей бумагой.
  4. Лиофилизируют их в жидком азоте, а затем хранили весь урожай при 80 градусах По Цельсию для дальнейшего исследования.
  5. Идентификация гена
    1. Тритуруировать 0,1 г волосатых корней в мелкий порошок в жидком азоте.
    2. Подготовьте геномную ДНК независимых трансгенных линий туберкулеза с использованием модифицированного метода бромистого цетилтриметилламмония (CTAB)25 в соответствии с инструкцией производителя набора геномной ДНК растений.
    3. Выполните полимеразы цепной реакции (PCR) с использованием 100 нг геномных шаблонов ДНК и праймеров, перечисленных в таблице 2.
    4. Выполните цикл усиления следующим образом: предденатурация при 94 градусах по Цельсию в течение 5 мин, денатурация при 94 градусах по Цельсию на 30 с, грунтовка при 55 градусах По Цельсию на 30 с и грунтовка при 72 градусах по Цельсию на 30 с. После 36 циклов и заключительного шага расширения на 72 градусов по Цельсию в течение 10 минут, проанализируйте продукты усиления на 1% гелей агарозы.
    5. Пятно гели с нуклеиновой кислотой окрашивания и визуализировать их под ультрафиолетовым светом.

Результаты

Agrobacterium rhizogenes-опосредованный ТБ волосатые корня преобразования
Это исследование описывает пошаговое протокол, который был создан для получения генетически преобразованных волосатых корней с использованием A. rhizogenes. Потребовалось около 5-6 недель от прививки семян ...

Обсуждение

Туберкулез был использован в нескольких исследованиях, связанных со вторичными метаболитами на генетическом и метаболических уровнях1,,2,,5,,27,,28. Волосатые корневой культуры, как уникальный источни...

Раскрытие информации

Авторы не имеют конфликта интересов раскрыть.

Благодарности

Эта работа была поддержана Фундаментальными научно-исследовательскими фондами для Центральных научно-исследовательских институтов социального обеспечения (XKT17002).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
2*Taq PCR MasterMixAidlab, ChinaPC0901
Agar powderSolarbio Life Science, Beijing, ChinaA8190
Applied Biosystems 2720 thermo cyclerThermoFisher Scientific, USA37834
ASSolarbio Life Science, Beijing, ChinaA8110Diluted in DMSO, 100 mM
binary vectorsThermoFisher Scientific (invitrogen), US/pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II)
Cefotaxime,sodiumSolarbio Life Science, Beijing, ChinaC8240Diluted in Water, 200 mg/mL
CF15RXII high-speed microHitachi, JapanNo. 90560201
Diposable Petri-dishGuanghua medical instrument factory, Yangzhou, China/
DYY-6C electrophoresis apparatusBjliuyi, Beijing ChinaECS002301
EASYspin Plus Plant RNA KitAidlab, ChinaRN38
ELGA purelab untra bioscienceELGA LabWater, UK82665JK1819
Epoch Microplate Spectrophotometerbiotek, US/
Gateway BP/LR reaction enzymeThermoFisher Scientific (invitrogen), US11789100/11791110
HYG-C multiple-function shakerSuzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China/
KanSolarbio Life Science, Beijing, ChinaK8020Diluted in Water, 100 mg/mL
MLS-3750 Autoclave sterilizerSanyo, Japan/
MS salts with vitaminsSolarbio Life Science, Beijing, ChinaM8521
NaClSolarbio Life Science, Beijing, ChinaS8210
Other chemicals unstatedBeijing Chemical Works, Chinaethanol, mercury bichloride, etc.
PHS-3C pH meterShanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, Chinaa008
Plant Genomic DNA KitTIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTDDP305
RifampinSolarbio Life Science, Beijing, ChinaR8010Diluted in DMSO, 50 mg/mL
SpectinomycinSolarbio Life Science, Beijing, ChinaS8040Diluted in Water, 100 mg/mL
SucroseSolarbio Life Science, Beijing, ChinaS8270
Trans2K DNA MarkerTransGen Biotech, Beijing, ChinaBM101-01
TryptoneSolarbio Life Science, Beijing, ChinaLP0042
Whatman diameter 9 cm Filter paperHangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd/
Yeast Extract powderSolarbio Life Science, Beijing, ChinaLP0021

Ссылки

  1. Fabjan, N., et al. Tartary Buckwheat ( Fagopyrum tataricum Gaertn .) as a Source of Dietary Rutin and Quercitrin. Agricultural and Food Chemistry. 51, 6452-6455 (2003).
  2. Kim, Y. K., et al. Production of Phenolic Compounds in Hairy Root Culture of Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn). Journal of Crop Science & Biotechnology. 12 (1), 53-57 (2009).
  3. Yao, Y., et al. D-chiro-inositol-enriched tartary buckwheat bran extract lowers the blood glucose level in KK-Ay mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10027-10031 (2008).
  4. Giri, A., Narasu, M. L. Transgenic hairy roots. Biotechnology Advances. 18 (1), 1-22 (2000).
  5. Zhang, D., et al. The light-induced transcription factor FtMYB116 promotes accumulation of rutin in Fagopyrum tataricum. Plant, Cell & Environment. 42, (2018).
  6. Chilton, M. -. D., et al. Agrobacterium thizogenes inserts T-DNA into the genomes of the host plant root cells. Nature. 295 (4), 129 (1982).
  7. Guillon, S., Trémouillaux-Guiller, J., Kumar Pati, P., Gantet, P. Hairy Roots: a Powerful Tool for Plant Biotechnological Advances. Bioactive Molecules and Medicinal Plants. , 271-283 (2008).
  8. Srivastava, S., Srivastava, A. K. Hairy root culture for mass-production of high-value secondary metabolites. Critical Reviews in Biotechnology. 27 (1), 29-43 (2007).
  9. Veena, V., Taylor, C. G. Agrobacterium rhizogenes: Recent developments and promising applications. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant. 43 (5), 383-403 (2007).
  10. Ramachandra Rao, S., Ravishankar, G. A. Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites. Biotechnology Advances. 20 (2), 101-153 (2002).
  11. Palazón, J., et al. Growth and Ginsenoside Production in Hairy Root Cultures of Panax ginseng using a Novel Bioreactor. Planta Med. 69 (04), 344-349 (2003).
  12. Staniszewska, I., Królicka, A., Maliński, E., Łojkowska, E., Szafranek, J. Elicitation of secondary metabolites in in vitro cultures of Ammi majus L. Enzyme and Microbial Technology. 33 (5), 565-568 (2003).
  13. Uddin, M. R., Li, X., Won, O. J., Park, S. U., Pyon, J. Y. Herbicidal activity of phenolic compounds from hairy root cultures of Fagopyrum tataricum. Weed Research. 52, 25-33 (2011).
  14. Christey, M. C., Braun, R. H. Production of hairy root cultures and transgenic plants by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Methods in Molecular Biology. 286, 47-60 (2005).
  15. Olhoft, P. M., et al. A novel Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation method of soybean [Glycine max (L.) Merrill] using primary-node explants from seedlings. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant. 43 (6), 536-549 (2007).
  16. Kereszt, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology. Nature Protocols. 2 (4), (2007).
  17. Pistelli, L., et al. . Bio-Farms for Nutraceuticals: Functional Food and Safety Control by Biosensors. , (2010).
  18. Gangopadhyay, M., Sircar, D., Mitra, A., Bhattacharya, S. Hairy root culture of Plumbago indica as a potential source for plumbagin. Biologia Plantarum. 52 (3), 533-537 (2008).
  19. Okamoto, S., Yoro, E., T, S., K, M. Division Hairy Root Transformation in lotus Japonicus. Bio-Protocol. 3 (12), 14-17 (2013).
  20. Fathi, R., Mohebodini, M., Chamani, E. High-efficiency Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation in Cichorium intybus L. via removing macronutrients. Industrial Crops and Products. 128, 572-580 (2019).
  21. Fernández-piñán, S., et al. Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining. Journal Of Visualized Experiments. , e1 (2019).
  22. Chattopadhyay, T., Roy, S., Mitra, A., Maiti, M. K. Development of a transgenic hairy root system in jute (Corchorus capsularis L.) with gusA reporter gene through Agrobacterium rhizogenes mediated co-transformation. Plant Cell Reports. 30 (4), 485-493 (2011).
  23. Sirikantaramas, S., et al. The gene controlling marijuana psychoactivity. Molecular cloning and heterologous expression of Δ1-tetrahydrocannabinolic acid synthase from Cannabis sativa L. Journal of Biological Chemistry. 279 (38), 39767-39774 (2004).
  24. Zhou, M. L., et al. Characterization of Functional Genes in Buckwheat. Molecular Breeding and Nutritional Aspects of Buckwheat. , 327-331 (2016).
  25. Liang, C., et al. A Comparative Analysis of the Chloroplast Genomes of Four Salvia Medicinal Plants. Engineering. 5 (5), 907-915 (2019).
  26. Wang, J., Zhang, X., Yan, G., Zhou, Y., Zhang, K. Over-expression of the PaAP1 gene from sweet cherry (Prunus avium L.) causes early flowering in Arabidopsis thaliana. Journal of Plant Physiology. 170 (3), 315-320 (2013).
  27. Li, J., et al. Analysis of Flavonoid Metabolites in Buckwheat Leaves Using UPLC-ESI-MS/MS. Molecules. , (2019).
  28. Zhu, F. Chemical composition and health effects of Tartary buckwheat. Food Chemistry. 203, 231-245 (2016).
  29. Kaur, B., Malik, C. P. Hairy root culture -a unique source for metabolites production. Journal of Plant Science Research. 25 (2), 123-141 (2010).
  30. Thwe, A. A., et al. Metabolomic Analysis and Phenylpropanoid Biosynthesis in Hairy Root Culture of Tartary Buckwheat Cultivars. Plos One. 8 (6), (2013).
  31. Thwe, A. A., et al. Accumulation of Phenylpropanoids and Correlated Gene Expression in Hairy Roots of Tartary Buckwheat under Light and Dark Conditions. Applied Biochemistry and Biotechnology. 174 (7), 2537-2547 (2014).
  32. Zhang, K., et al. Jasmonate-responsive MYB factors spatially repress rutin biosynthesis in Fagopyrum tataricum. Journal of Experimental Botany. 69 (8), 1955-1966 (2018).
  33. Zhou, M., et al. FtSAD2 and FtJAZ1 regulate activity of the FtMYB11 transcription repressor of the phenylpropanoid pathway in Fagopyrum tataricum. New Phytologist. 216, (2017).
  34. Giri, A., Narasu, M. L. Transgenic hairy roots: Recent trends and applications. Biotechnology Advances. 18 (1), 1-22 (2000).
  35. Thwe, A., et al. Effect of different Agrobacterium rhizogenes strains on hairy root induction and phenylpropanoid biosynthesis in tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn). Frontiers in Microbiology. 7, 1-10 (2016).
  36. Cheng, Q., et al. RNA interference-mediated repression of SmCPS (copalyldiphosphate synthase) expression in hairy roots of Salvia miltiorrhiza causes a decrease of tanshinones and sheds light on the functional role of SmCPS. Biotechnology Letters. 36 (2), 363-369 (2014).
  37. Huang, X., et al. Efficient Rutin and Quercetin Biosynthesis through Flavonoids-Related Gene Expression in Fagopyrum tataricum Gaertn . Hairy Root Cultures with UV-B Irradiation. Frontiers In Plant Science. 7, 1-11 (2016).
  38. Godwin, I., Todd, G., Ford-lloyd, B., Newbury, H. J. The effects of acetosyringone and pH on Agrobacterium-mediated transformation vary according to plant species. Plant Cell Reports. 9, 671-675 (1991).
  39. Stachel, S. E., Messens, E., Van Montagiu, M., Zambryski, P. Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens. Nature. 318 (19), (1985).
  40. Bolton, G. W., Nester, E. W., Gordon, M. P. Plant Phenolic Compounds Induce Expression of the Agrobacterium tumefaciens loci needed for virulence. Science. 232 (10), 983-985 (1986).
  41. Ferri, M., et al. Chitosan treatment induces changes of protein expression profile and stilbene distribution in Vitis vinifera cell suspensions. Proteomics. 9 (3), 610-624 (2009).
  42. Bourgaud, F., Gravot, A., Milesi, S., Gontier, E. Production of plant secondary metabolites: a historical perspective. Plant Science. 161 (5), 839-851 (2001).
  43. Kumagai, H., Kouchi, H. Gene Silencing by Expression of Hairpin RNA in Lotus japonicus Roots and Root Nodules. Molecular Plant-Microbe Interactions. 16 (8), 663-668 (2003).
  44. Sunil Kumar, G. B., Ganapathi, T. R., Srinivas, L., Revathi, C. J., Bapat, V. A. Expression of hepatitis B surface antigen in potato hairy roots. Plant Science. 170 (5), 918-925 (2006).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

157GFPrhizogenes

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены