内塞里亚淋病的金属有限生长，用于金属反应基因特征和从宿主配体中获取金属

摘要

我们在这里描述了一种在金属受限液体介质中生长淋病的方法，以促进金属吸走基因的表达。我们还概述了下游实验，以表征在这些条件下生长的淋球菌的表型。这些方法可以适应其他细菌中金属反应基因的表征。

摘要

微量金属，如铁和锌，是已知在原核过程（包括基因调控、催化和蛋白质结构）中起关键作用的重要营养物质。主机的金属封存通常会导致细菌的金属限制。这种限制诱导细菌基因表达，其蛋白质产品允许细菌克服其金属有限的环境。这种基因的特性具有挑战性。细菌必须在精心准备的培养基培养中生长，使营养金属能够充分获得，从而允许细菌生长，同时保持有利于表达上述基因的金属轮廓。因此，必须为这些金属的浓度建立微妙的平衡。生长一种营养挑剔的有机体，如奈瑟里亚淋病，这种有机体进化到只在人类宿主中生存，增加了一层复杂性。在这里，我们描述了一种定义的金属有限介质的制备，该介质足以允许淋球菌生长和所需的基因表达。这种方法允许调查员从不需要的来源中分离铁和锌，同时用定义的铁或锌来源补充介质，其制备也描述。最后，我们概述了利用这种介质帮助描述金属调节性淋球菌基因的蛋白质产物的三个实验。

引言

淋病导致常见的性传播感染淋病。在感染期间，致病性Neisseria表达一系列金属反应基因，使细菌能够克服人类宿主^1、2、3的金属限制。铁和锌等微量金属在许多细胞过程中起着关键作用，如与催化位点的酶结合、参与氧化还原反应以及各种蛋白质^4、5的结构因素。在金属有限条件下，金属反应位位被压减，其产生的蛋白质可以帮助获得这些营养物质。这些基因和蛋白质的特性对研究者来说是一个独特的技术挑战。金属离子必须从细菌中预扣，才能诱导这些基因从原生位点转录，但是这些离子从含金属介质中的有效结合可能难以优化。源水的不同金属轮廓和粉末成分固有的批次到批次变化⁶意味着从富介质中去除特定金属所需的夹子数量会因不同位置、成分供应商而异，甚至在更换化学品库存时，在单个实验室中随时间而变化。

为了规避这一挑战，我们描述了在制备过程中用Chelex-100树脂处理的已定义介质的制备，以去除溶液中的微量金属。这种介质营养密集，允许淋巴球菌的生长，这种生长在人类宿主之外很难培养，并且允许调查员通过添加自己定义的来源和浓度来引入特定的金属轮廓。金属。将所需金属控制添加到耗尽介质的方法提高了实验的一致性，并允许进行可靠、可复制的实验，而不考虑水源和化学批次数等因素。此外，这种介质可以部署为液体或固体，只需稍作修改，使其相当通用。

为了证明这种介质的效用，我们概述了用于淋球菌生长的协议，并描述了三个成功的实验来描述金属反应性奈塞利亚基因。首先，我们从金属耗尽或补充培养物制备淋球菌全细胞解结物，并展示来自金属响应位点的蛋白质生产水平。然后，我们概述锌限制生长测定，其中淋球菌生长通过补充特定的，可使用的锌源控制。最后，我们展示了结合测定，证明整个淋球细胞表达金属反应性表面受体结合到各自的含金属配体。这些受体的成功表面呈现需要金属耗尽介质的生长。

本方案是专门针对淋病的，但许多其他细菌病原体在感染⁷期间采用金属采集策略，因此该协议可以适用于研究其他细菌的金属平衡。优化此介质和用于其他细菌的这些实验方案可能需要对 Chelex-100 的金属包合剂浓度和/或处理时间进行轻微修改，因为其他细菌的金属要求可能与淋球菌略有不同。铁和锌是上述调查关注的主要金属，但其他金属（如锰）已被证明对细菌至关重要，包括Neisseria8、9、10、11、12。此外，还描述了真核细胞培养工作中金属表征的类似方法，也可以考虑。¹³

研究方案

1. Chelex 处理的定介质 （CDM） 库存解决方案的制备

1. 库存解决方案 I
   1. 将 NaCl （233.8 g）、K₂SO₄ （40.0 g）、NH₄Cl （8.8 g）、K₂HPO₄ （13.9 g） 和 KH₂PO₄ （10.9 g） 结合到去离子水中，最终体积为 1 L。
   2. 过滤溶液消毒，并等分成50 mL锥形管。
   3. 储存在-20°C。
2. 库存解决方案 2
   1. 将硫胺 HCl （0.2 g）、硫胺热磷酸-Cl （0.05 g）、泛酸钙 （0.19 g） 和生物素 （0.3 g） 结合到 50% （vol/vol） 乙醇中，最终体积为 1 L。
   2. 与50 mL 锥形管中的异位，储存在 -20°C。
3. 库存解决方案 III
   1. 结合 L-阿斯巴酯 （4.0 g）、L-谷氨酸 （10.4 g）、L-精氨酸 （1.2 g）、甘氨酸 （0.2 g）、L-丝氨酸 （0.4 g）、L-亮氨酸 （0.72 g）、L-isoleuin （0.24 g）、L-valine （0.48 g）、L-酪氨酸 （0.56 g）、L-proline （0.4 g）、L-色氨酸 （0.64 g）、L-- 三氯胺（0.4克）、L-苯丙氨酸（0.2克）、L-芦笋-H₂O（0.2 g）、L-谷氨酰胺（0.4克）、L-硫氨酸-HCl（0.2克） ）、L-蛋氨酸（0.12克）、L-丙氨酸（0.8克）、L-利氨酸（0.4克）和500 mL去离子水中的谷胱甘肽（0.36克）。
   2. 将L-半胱氨酸（0.44克）和L-半胱氨酸（0.28克）溶解在1 M HCl的最小体积（±1 mL）中，并加入上述氨基酸溶液。
   3. 使用 10 N NaOH 调节溶液的 pH，直到所有颗粒溶解。最终的pH为10.0~11.0。
   4. 使用去离子水将最终体积调至 1 L。
   5. 过滤溶液消毒，并分量至250 mL体积。
   6. 储存在-20°C。
4. 库存解决方案 IV
   1. 将葡萄糖（200克）溶解在去离子水中，最终体积为1升。
      注:溶液可能需要加热以溶解葡萄糖。
   2. 过滤灭菌，并将溶液与50 mL锥形管等分。
   3. 储存在-20°C。
5. 库存解决方案 V
   1. 将低氧二元（5.0克）、尿素（5.0克）和NaOH（4.0克）结合在去离子水中，最终体积为1升。
   2. 将消毒和等分过滤成50 mL锥形管。
   3. 储存在-20°C。
6. 解决方案六
   1. 在去离子水中制备 1M CaCl_2-2H2O （147 g/L） 溶液。过滤器在室温 （RT） 下消毒和储存。
7. 库存解决方案 VII
   1. 在去离子水中制备1M无水_MgSO4溶液。过滤器消毒并储存在RT。
8. 库存解决方案八
   1. 在去离子水中制备 1M NaHCO₃溶液。过滤器消毒并储存在RT。

2. 制备4x无菌浓缩物和1倍CDM

注:此程序应在酸处理无菌玻璃器皿或塑料中执行，以防止金属渗入溶液中。

1. 将库存溶液 I （50 mL）、II （20 mL）、III （250 mL）、IV （50 mL） 和 V （20 mL） 与 20.0 g 的 HEPES 混合。
2. 将 pH 调节到 7.4，然后用去离子水将最终体积调至 500 mL。
3. 在 1 L 去离子水中清洗 Chelex-100 树脂，在将其添加到 4x 无菌浓缩物之前去除防腐剂。为此，在 1 L 去离子水中加入 50 克树脂，搅拌至少 1 小时。通过真空过滤去除水，并将此洗涤树脂用于步骤 2.4。
4. 加入50克树脂，慢慢搅拌90分钟。
5. 通过过滤灭菌去除树脂，并将4x无菌浓缩物储存在4°C。
6. 要制备CDM工作浓度为1倍，首先用无菌去离子水稀释4x浓缩物，然后加入溶液VI（每500 mL1x溶液125 μL）、溶液VII（每500mL535μL）和溶液VIII（每500mL10mL）。
   注:尽管所有库存溶液均已灭菌，但建议在制备后再次过滤灭菌1x溶液。

3. CDM板的制备

注: 下面的配方为板制作 1 L 介质，但最好以较小的体积准备这些介质。一切都按比例缩小。

1. 洗过的阿加罗斯
   1. 将50克甘蔗在1L去离子水中溶解，搅拌1小时。
   2. 将溶液转移到离心瓶和离心机在1，200 x g下15分钟，在RT.小心地倒出上清液并丢弃。
   3. 加入足够的去离子水，以重新悬浮甘蔗颗粒，然后转移到1L烧瓶。将去离子水的最终体积引入 1 L，然后搅拌和离心机，如步骤 3.1.2 中。丢弃上清液。
   4. 加入足够的100%乙醇来重新悬浮颗粒，然后转移到新的1L烧瓶。用乙醇将最终体积为 1 L。搅拌和离心机，如步骤 3.1.2 中。
   5. 重复步骤 3.1.4。
   6. 将甲醇加入甘蔗颗粒以重新悬浮，然后转移到1L烧瓶中。用甲醇将最终体积为 1 L。搅拌和离心机，如步骤 3.1.2 中。
   7. 重复步骤 3.1.6。
   8. 将洗过的甘蔗转移到装有铝箔的托盘上，并在烟气罩中干燥。干燥时，转移到无金属容器进行长期存放。
2. 将10克洗过的甘蔗和5克马铃薯淀粉加入750 mL的去离子水中。
3. 高压灭菌器在121°C下工作30分钟，高于大气压100kPa。
4. 让介质冷却至+65°C，然后加入250 mL的4X CDM、250 μL溶液VI、1.07 mL溶液VII和20 mL溶液VIII。
5. 如果需要，在浇注板之前添加所选择的金属。无需添加包合器以保持无金属条件。
6. 倒入培养皿，并允许凝固。

4.内塞利亚淋病的金属生长有限

注:对于大多数应用，在接种CDM之前，无需对细菌进行金属应力。CDM 的初始翻倍步骤和随后的稀释足以耗尽其内部铁和锌储存的淋球菌。因此，以下程序的前两个步骤使用由GC介质底座制成的琼脂板进行，这些板已辅以凯洛格的补品I¹⁴和12.5 μM Fe（NO_3）3。如果需要早期金属应力，我们建议制备不含铁（NO_3）3和 5 μM TPEN（N、N、N'、N'-四聚氰胺（2-pyridy甲基）乙烯二胺的 GC 介质基板，用于锌合合或 10 μM 递延氧胺用于铁合化。所有孵育在37°C下进行_，CO2为5%。

1. 实验前两天，第2天，从冷冻库存到GC介质板上的连续淋球菌，孵育不超过24小时。
2. 第-1天，将单菌群连胜到新鲜的GC介质板上。在生长实验之前，尝试这样做14~16小时。
3. 在实验当天，将5~10 mL 1x CDM添加到酸洗的125 mL迷糊侧臂烧瓶中（补充图1），并用它来将Klett色度计填空。
4. 使用无菌棉签拭子从健康的单一菌落中接种CDM。瞄准20克莱特单位。
   注:如果 Klett 色度计不可用，则也适合分光光度计。Klett 单位没有通用转换为 OD 的公式，但提供了粗略的指南（https://support.hunterlab.com/hc/en-us/articles/214490283-Klett-Color-Scales）。
5. 以 250 rpm 的转速孵育，直到大约一个质量翻倍（40 Klett 单位）。这大约需要 1 到 2 小时。
6. 此时，通过添加足够的 CDM 量，达到初始培养密度的一半（例如，如果 5 mL 的培养从 20 Klett 单位增加到 40 Klett 单位，15 mL 的 CDM 将使其降至 10 Klett 单位），并且增长将继续如第 4.5 步中的那样。背部稀释、金属处理等的具体量取决于下游应用。下面给出了三个示例（第 5、6 或 7 节）。

5. 金属反应基因产品的西方分析

1. 从步骤 4.6 开始，用三卷 CDM（例如，从 5 mL 开始）冲淡培养物（例如，CDM 的 15 mL）。此时，如果需要，添加金属处理。
   1. 铁感应基因可以通过12.5 μM Fe（NO_3）3进行解压。锌反应基因可能被10μMZnSO₄压榨。
   2. 额外的铁或锌应力是没有必要的，因为介质已经耗尽，所以反应基因已经表达。如果需要进一步的压力，我们建议不超过1⁄2 μM的递生胺或TPEN，因为过度压力会阻止培养物的生长。
2. 在步骤 4.5 中生长培养物 4 小时，并记录样本的最终细胞密度。金属应力较低的培养物将增长到更高的最终密度。
3. 将培养物标准化到适当的密度并制备莱萨。
   1. 在 1 mL 的培养值中，将全细胞分量标准化为相当于 100 Klett 单位的密度。为此，请将 100 除以样品的 Klett 单位密度。你得到的数字是用于制造细胞颗粒的培养的体积（以 mL）。
4. 遵循标准SDS-PAGE和西方印迹程序^15，以探测感兴趣的蛋白质。

6. 金属有限生长测定

注:这些测定说明预熟的生长预混料。第 8 节描述了这些混合料的制备。

1. 在步骤 4.5 中质量倍增期间，用 10 倍预混料预处理 96 孔微孔板的井。此外，指定三口井作为空白。在这些井中，添加 10 μL 的 10x 预混合和 90 μL 的 CDM。
2. 一旦侧臂烧瓶中的培养物翻倍，将每个培养物的 100 μL 添加到微孔中未使用的孔中，并在 600 nm （OD₆₀₀） 处测量光学密度。这可以通过分光光度计的比色皿来完成，但在测定中菌株数量较多，这可能变得很麻烦，除非分光光度计可以直接从侧臂烧瓶的手臂进行测量，否则通常不建议这样做（补充图2）。
   1. 测量 OD 时，将烧瓶放回培养箱中，以确保淋球菌保持活力。
3. 计算将培养物带到 OD₆₀₀ = 0.02 所需的正确稀释量。10x 预混料对 OD 的影响可以忽略不计，可以从计算中省略。
4. 用CDM在小培养管中稀释培养物，并添加足够的体积，将10倍预混料稀释至板中的1倍。如果有板加热器可用，则在工作时将板保持在 37°C。
5. 在板片读取器中摇动，孵育板 8~12 小时，以所需的间隔进行 OD₆₀₀测量。

7. 外膜金属运输机对利带结合的检测

1. 按照步骤 5.1 中所需的处理培养物，然后用摇动孵育 4 小时。
2. 在 4 小时标记前不久，将三块滤纸和一块硝化纤维素切成适合点印装置所需的近似大小（补充图 3）。将硝基纤维素预吸到脱离子水中，然后用硝基纤维素下面的滤纸组装设备。
3. 在 4 小时时，记录细胞密度并标准化到适当的最终密度。建议使用步骤 5 中用于制备细胞内分量的密度的 ±10%。例如，如果在 1 mL 中使用 100 KU 来用于莱沙，这意味着这些血隙在 1 mL 中为 10 KU。计算方式与 5.3.1 中所述相同，区域性直接添加到计算体积中的硝基纤维素中，而不是制成掉糖。
4. 移管细胞培养到硝基纤维素上，让过滤纸有足够的时间吸收所有液体。
5. 拆解设备，让斑点干燥，并在5%牛血清白蛋白或脱脂牛奶（w/v）中，在Tris缓冲盐水中将硝化纤维素膜块1小时。
6. 重新组装点印片装置，用石蜡薄膜替换滤纸，在硝基纤维素下形成防漏密封。
7. 将感兴趣的金属结合配体稀释至阻滞剂和探针单元中的0.2 μM，1小时。
8. 用真空吸出液体，洗掉斑点，然后按照标准的免疫学程序开发信号^16。清洗步骤可在设备内或外进行。

8. 转移剂、S100A7 和卡护素的金属装载，以及 10x 预混料的准备

注:与 CDM 制备一样，使用酸洗玻璃或塑料进行溶液制备。

1. 在初始缓冲液（100 mM Tris，150 mM NaCl，20 mM NaHCO₃，pH = 8.4）中以10mg/mL（125 μM）溶解人体转移素。S100A7 和卡保护素悬浮在缓冲液中，包括 20 mM Tris、100 mM NaCl、10 mM 2-Mercaptoto 乙醇和 1 mM CaCl₂，pH = 8.0）。
   1. 在转因溶液中加入铁化溶液（100mM柠酸钠，100 mM NaHCO₃，5 mM FeCl₃-6H₂O，pH = 8.4），以实现30%的铁饱和度（例如，75 μL的铁化溶液适用于5 mL转因，如果以10mg/mL制成）。
   2. 将 ZnSO₄添加到 S100A7 或卡护林，以 50% 的摩尔比与蛋白质形成 25% 的饱和度（每个蛋白质分子有两个金属结合位点）。可使用 100 μM S100A7 或带 50 μM ZnSO₄的护套。
   3. 对于这两种情况，对于金属装载，允许端对端混合至少 1 小时。
2. 准备4 L透析缓冲液（40 mM Tris，150 mM NaCl，20 mM NaHCO₃，pH = 7.4）。将此卷拆分为两个单独的 2 L 卷，并将一个卷放在 4°C。
3. 使用注射器将金属加载的蛋白质添加到透析盒中，并在 RT 时对第一个缓冲液体积进行 4 小时透析。
4. 将盒式磁带移到第二个缓冲液体积，并在 4°C 下进行通宵透析。在这些步骤之后，应去除任何未绑定的金属。
   注:我们建议在透析后进行双辛辛酸测定，以确定蛋白质浓度。
5. 使用 10 倍转移素预混合剂作为唯一铁源进行转移素利用。
   1. 在PBS中分别将30%的人类Fe转移素和牛转移素（在125μM下制备，用于人体转移素，无铁载荷步骤）至75μM和30μM，制备此预混料。正控制预混料将 30% 的 Fe 转移素替换为 75 μM Fe（NO₃）_3，负控制预混合省略任何添加的铁，仅保留牛 apo-转移素。在生长测定中，用90μL的培养物稀释10μL。最终浓度为7.5 μM 30%人铁转移素和3μM牛apo-转移素。
6. 使用改进版的转移素 10x 预混合 S100A7 或卡保护素利用率作为唯一锌源。
   1. 对于正控制预混合，将 50 μM ZnSO₄加入转移剂预混合。对于负控制，合并 50 μM TPEN 并省略锌。然后，为每个需要的样品取10μL，并将该体积移至新管中。加上这一半无菌PBS的体积。例如，如果 10 口井将收到正控制预混合，则取 100 μL 的预混合，将其移动到新管中，并添加 50 μL 的 PBS。对负控制执行相同的操作。
   2. 要制作 S100A7 或卡护林预混料，请按所需的负控制预混合量 10 μL，移动到新管中，并添加 25% Zn-S100A7 或卡护林的一半体积。在生长测定中，使用15μL的预混合，用85μL的培养剂稀释。转移剂的最终浓度与步骤 8.5 中相同，添加 5 μM 的 Zn、TPEN 或 S100A7/卡保护。

结果

在没有微量金属的情况下，开发和实施了一种用于对金属反应基因及其基因产物进行表征的特异性介质。在优化的协议中，介质的金属轮廓通过由调查人员酌情添加金属来控制，而不是通过金属目标的定位夹层来控制，从而增加了实验室到实验室的控制和一致性，并进行了实验实验。这种介质可用于液体和固态，使其在许多实验设置中具有通用性。

讨论

生长介质在微生物研究中发挥着多种作用。专用介质用于选择、浓缩以及各种其他应用，用于许多独特的研究类型。其中一种应用是诱导金属响应基因，这通常是通过添加针对特定金属子的特异性包剂来完成的。这种方法是有限的，因为由于含有独特金属型材的不同水源和含有不同金属浓度的两批相同介质成分，各种微量金属所需的包合量可能是可变^的。为了避免这种固有的缺?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
125 mL sidearm flasks	Bellco	2578-S0030	Must be custom ordered
2-Mercaptoethanol	VWR	M131	Open in fume hood
3MM Paper	GE Health	3030-6461	Called "filter paper" in text
Agarose	Biolone	BIO-41025	Powder
Ammonium chloride	Sigma-Aldrich	A9434	Powder
Biotin	Sigma-Aldrich	B4501	Powder
Blotting grade blocker	Bio-Rad	170-6404	Nonfat dry milk
Bovine serum albumin	Roche	3116964001	Powder
Bovine transferrin	Sigma-Aldrich	T1428	Powder
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C5080	Powder
Calcium pantothenate	Sigma-Aldrich	C8731	Powder
Calprotectin	N/A	N/A	We are supplied with this by a collaborator
Chelex-100 Resin	Bio-Rad	142-2832	Wash with deionized water prior to use
Cotton-tipped sterile swab	Puritan	25-806	Cotton is better than polyester for this application
Deferoxamine	Sigma-Aldrich	D9533	Powder
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Powder
Dialysis cassette	Thermo	66380	Presoak in buffer prior to use
Dot blot apparatus	Schleicher & Schwell	10484138	Lock down lid as tightly as possible before sample loading
Ethanol	Koptec	V1016	Flammable liquid, store in flammables cabinet
Ferric chloride	Sigma-Aldrich	F7134	Irritant, do not inhale
Ferric nitrate nonahydrate	Sigma-Aldrich	F1143	Irritant, do not inhale
GC medium base	Difco	228950	Powder, already contains agar
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898	Powder
HEPES	Fisher	L-15694	Powder
Human transferrin	Sigma-Aldrich	T2030	Powder
Hypoxanthine	Sigma-Aldrich	H9377	Powder
Klett colorimeter	Manostat	37012-0000	Uses color transmission to assess culture density
L-alanine	Sigma-Aldrich	A7627	Powder
L-arginine	Sigma-Aldrich	A5006	Powder
L-asparagine monohydrate	Sigma-Aldrich	A8381	Powder
L-aspartate	Sigma-Aldrich	A9256	Powder
L-cysteine hydrochloride	Sigma-Aldrich	C1276	Powder
L-cystine	Sigma-Aldrich	C8755	Powder
L-glutamate	Sigma-Aldrich	G1251	Powder
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G3126	Powder
L-histidine monohydrochloride	Sigma-Aldrich	H8125	Powder
L-isoleucine	Sigma-Aldrich	I2752	Powder
L-leucine	Sigma-Aldrich	L8000	Powder
L-lysine	Sigma-Aldrich	L5501	Powder
L-methionine	Sigma-Aldrich	M9625	Powder
L-phenylalanine	Sigma-Aldrich	P2126	Powder
L-proline	Sigma-Aldrich	P0380	Powder
L-serine	Sigma-Aldrich	S4500	Powder
L-threonine	Sigma-Aldrich	T8625	Powder
L-tryptophan	Sigma-Aldrich	T0254	Powder
L-tyrosine	Sigma-Aldrich	T3754	Powder
L-valine	Sigma-Aldrich	V0500	Powder
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506	Powder
Methanol	VWR	BDH1135-4LP	Flammable liquid, store in flammables cabinet
Nitrocellulose	GE Health	10600002	Keep in protective sheath until use
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	60356	Powder
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P9791	Powder
Potassium sulfate	Sigma-Aldrich	P0772	Powder
Potato starch	Sigma-Aldrich	S4251	Powder
Reduced glutathione	Sigma-Aldrich	G4251	Handle carefully. Can oxidize easily.
S100A7	N/A	N/A	We are supplied with this by a collaborator
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	Powder
Sodium chloride	VWR	470302	Powder
Sodium citrate	Fisher	S279	Powder
Sodium hydroxide	Acros Organics	383040010	Highly hygroscopic
Thiamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	T4625	Powder
Thiamine pyrophosphate	Sigma-Aldrich	C8754	Also called cocarboxylase
TPEN	Sigma-Aldrich	P4413	Powder
Tris	VWR	497	Powder
Uracil	Sigma-Aldrich	U0750	Powder
Zinc sulfte heptahydrate	Sigma-Aldrich	204986	Irritant, do not inhale