Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada metal alımı için genlerin ekspresyonunu kolaylaştırmak için metal sınırlı sıvı ortamda Neisseria gonorrhoeae büyüme için bir yöntem açıklar. Ayrıca bu koşullarda yetiştirilen gonokokların fenotipini karakterize etmek için aşağı akım deneylerini ana hatlar. Bu yöntemler, diğer bakterilerde metal duyarlı genlerin karakterizasyonu için uygun olarak uyarlanabilir.

Özet

Demir ve çinko gibi eser metaller gen regülasyonu, kataliz ve protein yapısı gibi prokaryotik süreçlerde önemli rol oynadığı bilinen hayati besinlerdir. Ev sahipleri tarafından metal ayrıştırma genellikle bakteri için metal sınırlamasına yol açar. Bu sınırlama, protein ürünleri bakterilerin metal sınırlı çevrelerinin üstesinden gelmesine izin veren bakteriyel gen ekspresyonuna neden olur. Bu tür genlerin karakterizasyonu zordur. Bakteriler, yukarıda bahsedilen genlerin ekspresyonunu gerçekleştirmeye yardımcı olan bir metal profilini korurken bakteri büyümesine izin vermek için besin metallerine yeterli erişim sağlayan titizlikle hazırlanmış medyada yetiştirilmelidir. Bu nedenle, bu metallerin konsantrasyonları için hassas bir denge kurulmalıdır. Neisseria gonorrhoeaegibi besin açısından titiz bir organizmanın büyümesi, sadece insan konakta hayatta kalmak için evrimleşmiştir, karmaşıklık ek bir düzeyde ekler. Burada, gonokok büyümesi ve istenilen gen ekspresyonuna izin verecek kadar tanımlanmış metal sınırlı bir ortamın hazırlanmasını açıklıyoruz. Bu yöntem araştırmacının demir ve çinkoyu istenmeyen kaynaklardan elde etmesini sağlarken, ortamı da tanımlı demir veya çinko kaynaklarıyla tamamlar. Son olarak, metal leregüle gonokok genlerinin protein ürünlerini karakterize etmeye yardımcı olmak için bu ortamı kullanan üç deneyi ana hatlatıyoruz.

Giriş

Neisseria belsoğukluğu yaygın cinsel yolla bulaşan enfeksiyon bel soğukluğu neden olur. Enfeksiyon sırasında, patojenik Neisseria bakterilerin insankonak1 ,2,3tarafından metal kısıtlama çabaları aşmak için izin metal duyarlı genlerin bir repertoire ifade . Demir ve çinko gibi eser metaller katalitik bölgelerdeenzimlere bağlanma, redoks reaksiyonlarına katılım gibi birçok hücresel süreçte kilit rol oynarlar ve çeşitli proteinlerde yapısal faktörler olarak4,5. Metal sınırlı koşullarda, metal duyarlı loci derepressed ve ortaya çıkan proteinler bu besinlerin edinimi yardımcı olabilir. Bu genlerin ve proteinlerin karakterizasyonu araştırmacı için benzersiz bir teknik sorun sunar. Metal iyonları kendi yerli loci bu genlerin transkripsiyon ikna etmek için bakterilerden uzak tutulmalıdır, ancak metal yüklü medya bu iyonların etkili şelasyon optimize etmek zor olabilir. Kaynak suyun farklı metal profilleri ve toz malzemelerin doğal lot-to-lot varyasyon6 zengin bir ortamdan belirli bir metal kaldırmak için gerekli şelatör miktarı farklı yerler arasında değişecektir anlamına gelir, madde satıcıları, ve kimyasal envanter değiştirilir gibi zaman içinde bile.

Bu zorluğu aşmak için, çözeltiden eser metalleri çıkarmak için hazırlık sırasında Chelex-100 reçin ile tedavi edilen tanımlanmış bir ortamın hazırlanmasını anlatıyoruz. Bu ortam yeterince besin yoğun insan konak dışında kültür zordur gonokok, büyümesini sağlamak için yoğun ve araştırmacı kendi tanımlanmış kaynakları ve konsantrasyonları ekleyerek belirli bir metal profili tanıtmak için izin verir Metal. İstenilen metallerin tükenmiş ortama kontrollü şekilde eklenmesi yöntemi deneysel tutarlılığı artırır ve su kaynağı ve kimyasal lot sayıları gibi faktörlere bakılmaksızın sağlam, çoğaltılabilir deneylere olanak sağlar. Ayrıca, bu ortam sadece küçük değişiklikler ile bir sıvı veya katı olarak dağıtılabilir, oldukça çok yönlü hale.

Bu ortamın yararını göstermek için, gonokok alabilmesi için bir protokol uyguluyoruz ve metalduyarlı Neisseria genlerini karakterize etmek için üç başarılı deney imal ediyoruz. İlk olarak, metal tükenmiş veya takviye edilmiş kültürlerden gonokok tüm hücreli lysates hazırlamak ve metal duyarlı loci protein üretiminin değişken düzeyde göstermek. Daha sonra gonokok alonu belirli, uygulanabilir çinko kaynaklarının takviyesi ile kontrol edilir çinko sınırlı büyüme töz anahat. Son olarak, metal içeren ligandlara bağlanan metal duyarlı yüzey reseptörlerini ifade eden tüm gonokok hücrelerini gösteren bağlayıcı tahliller gösteririz. Bu reseptörlerin başarılı yüzey sunumu metal tükenmiş ortamda büyüme gerektirir.

Mevcut protokol özellikle Neisseria gonorrhoeaeiçin optimize edilmiştir, ancak çok sayıda diğer bakteriyel patojenler enfeksiyon sırasında metal edinme stratejileri istihdam7, Bu protokol diğer bakterilerde metal homeostaz çalışması için adapte edilebilir bu yüzden. Diğer bakteriler gonokok biraz daha farklı metal gereksinimleri olabilir gibi bu ortam ve diğer bakterilerde kullanılmak üzere bu deneysel protokolleri optimize büyük olasılıkla metal şelatör konsantrasyonları ve / veya Chelex-100 ile tedavi süresi hafif değişiklik gerektirir. Demir ve çinko açıklanan araştırmalar için endişe birincil metaller, ancak diğer metaller (örneğin, manganez) bakteriler için kritik olarak gösterilmiştir, Neisseriadahil 8,9,10,11,12. Ayrıca ökaryotik hücre kültürü çalışmalarında metal karakterizasyonlar için de benzer yöntemler tanımlanmıştır. 13.000

Protokol

1. Chelex ile tedavi edilen Tanımlı Orta (CDM) Stok Çözümlerinin hazırlanması

  1. Stok çözümü I
    1. NaCl (233,8 g), K2SO4 (40,0 g), NH4Cl (8,8 g), K2HPO4 (13,9 g) ve KH2PO4 (10,9 g) deiyonize suda 1 L'lik son hacmi birleştirin.
    2. Filtre çözeltisi sterilize ve 50 mL konik tüpler içine aliquot.
    3. -20 °C'de saklayın.
  2. Stok çözeltisi II
    1. Birleştirir tiamin HCl (0.2 g), tiamin pirofosfat-Cl (0.05 g), kalsiyum pantotenat (0.19 g), ve biotin (0.3 g) 50% (vol / vol) etanol son hacmi için 1 L.
    2. Aliquot 50 mL konik tüpler içine ve saklamak -20 °C.
  3. Stok çözümü III
    1. L-aspartat (4.0 g), L-glutamat (10.4 g), L-arginin (1.2 g), glisin (0.2 g), L-serine (0.4 g), L-lösin (0.7) 2 g), L-izolösin (0.24 g), L-valine (0.48 g), L-tirozin (0.56 g), L-prolin (0.4 g), L-triptofan (0.64 g), L-treonin (0.4 g), L-fenilalanin (0.2 g), L-asparagine-H2O (0.2 g), L-glutamin (0.4 g), L-histidin-HCl (0.2 g), L-metiyonin (0.12 g), L-alanin (0.8 g), L-lizin (0.4 g) ve 500 mL deiyonize suda azalmış glutatyon (0.36 g).
    2. L-sistein (0.44 g) ve L-sistin (0.28 g) 1 M HCl'lik en az hacimde (~1 mL) çözünve yukarıdaki amino asit çözeltisine ekleyin.
    3. Çözeltinin pH'ını 10 N NaOH ile tüm partiküller eriyene kadar ayarlayın. Son pH 10.0-11.0 olacaktır.
    4. Son hacmi deiyonize su ile 1 L'ye getirin.
    5. Filtre çözeltiyi sterilize edin ve 250 mL hacimde aliquot.
    6. -20 °C'de saklayın.
  4. Stok çözeltisi IV
    1. Deiyonize sudaki glikozu (200 g) 1 L'lik son bir hacimde çözün.
      NOT: Çözeltinin glikozu eritmek için ısıtılması gerekebilir.
    2. Filtre sterilize ve 50 mL konik tüpler içine çözelti aliquot.
    3. -20 °C'de saklayın.
  5. Stok çözümü V
    1. Hipoksantin (5,0 g), urasil (5,0 g) ve NaOH 'u (4,0 g) deiyonize suda 1 L'lik son bir hacimle birleştirin.
    2. Filtre sterilize ve aliquot içine 50 mL konik tüpler.
    3. -20 °C'de saklayın.
  6. Çözüm VI
    1. Deiyonize suda 1 M CaCl2-2H2O (147 g/L) çözeltihazırlayın. Filtre sterilize ve oda sıcaklığında saklamak (RT).
  7. Stok çözeltisi VII
    1. Deiyonize suda 1 M susuz MgSO4 çözeltisi hazırlayın. Filtre sterilize ve RT de saklayın.
  8. Stok çözümü VIII
    1. Deiyonize suda 1 M NaHCO3 çözeltisi hazırlayın. Filtre sterilize ve RT de saklayın.

2. 4x Steril Konsantre ve 1x CDM hazırlanması

NOT: Bu işlem, metallerin çözeltilere akmasını önlemek için asitle işlenmiş steril cam veya plastik olarak uygulanmalıdır.

  1. Stok çözeltilerini Birleştirin I (50 mL), II (20 mL), III (250 mL), IV (50 mL) ve V (20 mL) 20.0 g HEPES ile karıştırın ve karıştırın.
  2. PH'ı 7,4'e ayarlayın, ardından son hacmi deiyonize suyla 500 mL'ye getirin.
  3. 4x steril konsantreye eklemeden önce koruyucuları gidermek için Chelex-100 reçinesini 1 L deiyonize suda yıkayın. Bunu 1 L deiyonize suya 50 g reçineler ekleyerek ve en az 1 saat karıştırarak yapın.
  4. Reşin 50 g ekleyin ve yavaş yavaş tam 90 dakika karıştırın.
  5. Filtre sterilizasyonu ile reçine çıkarın ve 4x steril konsantresini 4 °C'de saklayın.
  6. CDM'nin 1x çalışma konsantrasyonu hazırlamak için, önce steril deiyonize su ile 4x konsantre seyreltin, sonra çözelti VI (125 μL başına 1x çözeltisi), çözelti VII (500 mL başına 535 μL) ve çözelti VIII (500 mL başına 10 mL).
    NOT: Tüm stok çözümleri sterilize edilmiş olmasına rağmen, 1x çözeltisini hazırlandıktan sonra tekrar sterilize etmek önerilir.

3. CDM Plakalarının Hazırlanması

NOT: Aşağıdaki tarif tabaklar için 1 L ortam yapar, ancak bunları daha küçük hacimlerde hazırlamak en iyisidir. Her şey orantılı olarak küçüler.

  1. Yıkanmış agarose
    1. 1 L deiyonize suda 50 g agarose çözünür, 1 saat karıştırarak.
    2. Çözeltiyi 1.200 x g'de 15 dk'da bir santrifüj şişeye ve santrifüje aktarın.
    3. Agarose pelet resuspend için yeterli deiyonize su ekleyin, sonra 1 L şişe aktarın. Deiyonize su ile 1 L son bir hacme getirin ve sonra adım 3.1.2 gibi karıştırın ve santrifüj. Supernatant atın.
    4. Pelet resuspend için yeterli% 100 etanol ekleyin, sonra yeni bir 1 L şişe aktarın. Etanol ile 1 L son hacmine getirin. Adım 3.1.2 gibi karıştırın ve santrifüj.
    5. Adımı 3.1.4'e tekrarlayın.
    6. Yeniden askıya agarose pelet metanol ekleyin, sonra 1 L şişe aktarın. Metanol ile 1 L'lik son bir sese getirin. Adım 3.1.2 gibi karıştırın ve santrifüj.
    7. Adımı 3.1.6'yı tekrarlayın.
    8. Transfer alüminyum folyo ile kaplı bir tepsiye agarose yıkanmış ve bir duman kaputunda kurumasını bekleyin. Kuruduğunda, uzun süreli depolama için metaliçermeyen bir konteynere aktarın.
  2. 750 mL deiyonize suya 10 gr yıkanmış agarose ve 5 g patates nişastası ekleyin.
  3. 121 °C'de 30 dk, atmosfer basıncıüzerinde 100 kPa otoklav.
  4. Ortamın ~65 °C'ye soğumasını bekleyin, ardından 250 mL 4X CDM, 250 μL çözelti VI, 1,07 mL çözelti VII ve 20 mL çözelti VIII ekleyin.
  5. İstenirse, plakaları dökmeden önce seçtiğiniz metalleri ekleyin. Şelatörlerin eklenmesi metalsiz koşulları korumak için gerekli değildir.
  6. Petri yemekleri içine dökün ve katılaşmak için izin verin.

4. Neisseria belsoğukluğu Metal Sınırlı Büyüme

NOT: Çoğu uygulama için CDM aşısından önce bakterilerin metal stresine gerek yoktur. CDM'de ilk iki misli basım ve sonraki seyreltme iç demir ve çinko depolarının gonokoklarını tüketmek için yeterlidir. Bu nedenle, aşağıdaki işlemin ilk iki adımı Kellogg ek I14 ve 12.5 μM Fe(NO3)3ile takviye edilmiş GC orta tabanından yapılmış agar plakaları kullanılarak yapılır. Erken metal stresi isteniyorsa, GC orta taban plakalarının Fe(NO3)3 ve 5 μM TPEN (N,N,N',N'-tetrakis (2-piriridylmetil) etilenin) ile çinko şelasyon veya demir şelasyon için 10 μM deferoksamin hazırlanmasını öneririz. Tüm kuluçka 37 °C'de %5 CO 2 ileyapılır.

  1. Deneyden iki gün önce, -2.
  2. Gün -1, taze GC orta plakalar üzerine çizgi tek koloniler. Büyüme deneyinden önce bunu 14-16 saat önce yapmaya çalışın.
  3. Deney günü, yıkanmış bir asit 5-10 mL 1x CDM ekleyin 125 mL şaşkın yan kol şişesi(Ek Şekil 1) ve bir Klett kolorimetre boş bu kullanın.
  4. Sağlıklı, tek kolonilerden CDM aşılamak için steril, pamuk uçlu bir bez kullanın. 20 Klett birimi hedefleyin.
    NOT: Bir Klett kolorimetre mevcut değilse, bir spektrofotometre de uygundur. Klett birimleri için OD için evrensel bir dönüşüm formülü yoktur, ancak kaba bir kılavuz mevcuttur(https://support.hunterlab.com/hc/en-us/articles/214490283-Klett-Color-Scales).
  5. Yaklaşık bir kitle iki katına kadar 250 rpm sallayarak inkübül (40 Klett birimleri). Bu 1-2 saat arasında olmalıdır.
  6. Bu noktada, kültürler ilk kültür yoğunluğunun yarısına ulaşmak için yeterli miktarda CDM eklenerek seyreltilir (örneğin, kültürün 5 mL'si 20-40 Klett üniteden çıkmışsa, 15 mL CDM onu 10 Klett ünitesine geri getirecektir) ve büyüme devam edecektir. adım 4.5 gibi. Sırt seyreltme, metal tedavileri, vb belirli miktarı downstream uygulamalara bağlıdır. Aşağıda üç örnek veriyoruz (bölüm 5, 6 veya 7).

5. Metal Duyarlı Gen Ürünlerinin Batı Analizi

  1. 4.6'dan başlayarak, kültürleri üç cilt LIK CDM ile seyreltin (örneğin, 5 mL ile başlıyorsa 15 mL CDM). Bu noktada, istenirse metal tedaviler ekleyin.
    1. Demir algılama genleri 12.5 μM Fe(NO3)3ile derepressed olabilir. Çinko duyarlı genler 10 μM ZnSO4ile derepressed olabilir.
    2. Ek demir veya çinko stresgerekli değildir, medya zaten tükenmiş olduğu gibi, bu yüzden duyarlı genler zaten ifade edilecektir. Daha fazla stres isteniyorsa, aşırı stres kültürlerin büyümesini önleyeceği için en fazla 1-2 μM deferoksamin veya TPEN öneririz.
  2. 4 saat için adım 4.5 gibi kültürleri büyümek ve örneklerin son hücre yoğunluğunu kaydedin. Daha az metal stresli kültürler daha yüksek nihai yoğunlukları büyüyecek.
  3. Kültürleri uygun bir yoğunlukta standartlaştırın ve lysates hazırlayın.
    1. 1 mL kültürde 100 Klett birimine eşdeğer bir yoğunluğa tüm hücre lisatlarını standartlaştırın. Bunu başarmak için, numunenizin Klett birim yoğunluğuna 100 bölün. Alacağınız sayı, hücre peletini yapmak için kullanılacak kültürün mL'deki hacmidir.
  4. İlgi çeken proteinleri araştırmak için standart SDS-PAGE ve Western blotting prosedürleri15'i izleyin.

6. Metal sınırlı Büyüme Tahlilleri

NOT: Bu tahliller önceden yapılan büyüme premikslerini tanımlar. Bu karışımların hazırlanması bölüm 8'de açıklanmıştır.

  1. Adım 4.5'te kütle ikikatına çıkarken, 10x premiksli 96 kuyulu bir mikroplakanın kuyularını çekin. Ayrıca, boş olarak hizmet vermek üzere üç kuyu belirleyin. Bu kuyulara 10 μL 10x premix ve 90 μL CDM ekleyin.
  2. Yan kol şişelerinde kültürler iki katına çıktıktan sonra, her kültürün 100 μL'sini mikroplakadaki kullanılmayan bir kuyuya ekleyin ve optik yoğunluğu 600 nm 'de ölçün (OD600). Bu bir spektrofotometre cuvettes ile yapılabilir, ancak bir tizin içinde suşları daha büyük sayıda bu hantal olabilir ve spektrofotometre yan kol şişesikolundan doğrudan ölçmek sürece genellikle tavsiye edilmez (Ek Şekil 2).
    1. OD ölçerken, gonokokların canlı kalmasını sağlamak için şişeleri kuvöze geri yerleştirin.
  3. Kültürleri OD600 = 0,02'ye getirmek için gereken doğru seyreltme miktarını hesaplayın. 10x premiksler OD üzerinde ihmal edilebilir bir etkiye sahiptir ve hesaplamadan atlanabilir.
  4. Küçük kültür tüpleri CDM ile seyreltmek ve plaka 1x 10x premiksleri seyreltmek için yeterli hacim ekleyin. Bir tabak ısıtıcı varsa, çalışırken 37 °C'de plakatutun.
  5. Plakayı 8-12 saat boyunca bir plaka okuyucuda sallayarak, istenilen aralıklarla OD600 ölçümleri alarak kuluçkaya yatırın.

7. Dış Membran Metal Taşıyıcılar tarafından Ligand Bağlanmasının Tespiti

  1. Adım 5.1 olarak istenilen kültürleri tedavi, sonra 4 saat sallayarak kuluçka.
  2. 4 saat işaretinden kısa bir süre önce, üç adet filtre kağıdı ve bir parça nitroselüloz, nokta leke aparatına sığması için gereken yaklaşık boyuta kadar kesilir(Ek Şekil 3). Deiyonize sunitroselüloz önceden ıslatın, sonra nitroselüloz altında filtre kağıdı ile cihaz monte.
  3. Saat 4'te hücre yoğunluklarını kaydedin ve uygun bir son yoğunlukta standartlaştırın. 5. adımda hücre lisatlarının hazırlanmasında kullanılan yoğunluğun ~%10'unun kullanılması tavsiye edilir. Örneğin, 1 mL'de 100 KU lysates kullanıyorsanız, bu lekeler için 1 mL'de ~10 KU anlamına gelir. Hesaplama 5.3.1'de açıklandığı gibi aynıdır ve kültürler lysates yerine hesaplanan hacimlerde nitroselüloza doğrudan eklenir.
  4. Nitroselüloz üzerine Pipet hücre kültürleri ve filtre kağıdı tüm sıvı emmek için yeterli zaman sağlar.
  5. Cihazı sökün, lekenin kurumasını bekleyin ve nitroselüloz membranı Tris-tamponlu salinde %5 büyükbaş serum albumin veya yağsız sütte (w/v) 1 saat boyunca bloke edin.
  6. Nitroselüloz altında sızdırmaz bir mühür oluşturmak için parafin film ile filtre kağıdı yerine nokta leke aparatı yeniden monte.
  7. Metal bağlayıcı ligand'ı bloker ve prob hücrelerinde 0,2 μM'ye 1 saat seyreltin.
  8. Bir vakum ile sıvı sifon, leke yıkayın, sonra sinyal geliştirmek için standart immünolojik prosedürleri izleyin16. Yıkama adımları cihazın içinde veya dışında yapılabilir.

8. Transferrin, S100A7 ve Calprotectin Metal Yükleme ve 10x Premixs Hazırlanması

NOT: CDM hazırlığında olduğu gibi, çözelti hazırlama için asitle yıkanmış cam veya plastik kullanın.

  1. İnsan transferrini ilk tamponda 10 mg/mL (125 μM) eritin (100 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 mM NaHCO3, pH = 8.4). S100A7 ve kalprotectin 20 mM Tris, 100 mM NaCl, 10 mM 2-Mercaptoetanol ve 1 mM CaCl2, pH = 8,0'dan oluşan tamponda askıya alınır.
    1. Transferrin çözeltisine %30 demir doygunluğu elde etmek için ferrasyon çözeltisi (100 mM sodyum sitrat, 100 mM NaHCO3, 5 mM FeCl3-6H2O, pH = 8,4) ekleyin (örneğin, 10 mg/mL'de yapılmışsa 5 mL transferrin için uygundur).
    2. %25 doygunluk oluşturmak için proteine %50 molar oranıyla ZnSO4'ü S100A7'ye veya kalprotectin'e ekleyin (her protein molekülünün iki metal bağlama alanı vardır). 100 μM S100A7 veya 50 μM ZnSO4 ile calprotectin preparatları kullanılabilir.
    3. Her iki durumda da, metal yükleme için en az 1 saat uç üzerinden karıştırmaya izin verin.
  2. 4 L diyaliz tamponu hazırlayın (40 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 mM NaHCO3, pH = 7.4). Bunu iki ayrı 2 L hacime bölün ve birini 4 °C'ye yerleştirin.
  3. Metal yüklü proteinleri bir şırınga kullanarak diyaliz kasetine ekleyin ve RT'de 4 saat boyunca ilk tampon hacmine karşı diyalize alın.
  4. Kaseti ikinci tampon hacmine taşıyın ve gece boyunca 4 °C'de diyalize alın. Bu adımlardan sonra, herhangi bir bağlanmamış metaller kaldırılmalıdır.
    NOT: Diyaliz sonrası protein konsantrasyonlarını belirlemek için biinkoninik asit titreşmenizi öneriyoruz.
  5. Tek demir kaynağı olarak transferrin kullanımı için 10x transferrin premix kullanın.
    1. PBS'de sırasıyla 75 μM ve 30 μM'ye %30 insan Fe-transferrin ve büyükbaş apo-transferrin (insan transferrini için açıklandığı şekilde 125 μM'de hazırlanmış) seyrelterek bu premixi hazırlayın. Pozitif kontrol premix 75 μM Fe(NO3)3ile% 30 Fe-transferrin yerini alır , ve negatif kontrol premix herhangi bir ek demir atlar, sadece büyükbaş apo-transferrin istin. Büyüme analizinde, bu konsantrelerin 10 μL'sini 90 μL kültürile seyreltin. Son konsantrasyonlar 7.5 μM %30 insan Fe-transferrin ve 3 μM büyükbaş apo-transferrindir.
  6. Tek çinko kaynağı olarak S100A7 veya calprotectin kullanımı için transferrin 10x premixdeğiştirilmiş bir sürümünü kullanın.
    1. Pozitif kontrol premiksi için, 50 μM ZnSO4'u transferrin premixine dahil edin. Negatif kontrol için, 50 μM TPEN dahil ve çinko atla. Daha sonra, ihtiyaç duyulan her numune için bunlardan 10°L alın ve bu hacmi yeni bir tüpe taşıyın. Steril PBS bu yarısı kadar hacim ekleyin. Örneğin, 10 kuyu pozitif kontrol premiksini alacaksa, 100 μL premix alın, yeni bir tüpe taşıyın ve 50 μL PBS ekleyin. Negatif denetim için aynı şeyi yapın.
    2. S100A7 veya calprotectin premixyapmak için, iyi ihtiyaç duyulan başına negatif kontrol premix 10 μL almak, yeni bir tüp taşımak ve% 25 Zn-S100A7 veya calprotectin bu hacmin yarısını ekleyin. Büyüme analizinde, 85 μL kültür ile 15 μL premix ve seyreltme kullanın. Transferrinler için son konsantrasyonlar adım 8.5 ile aynı kalır, zn ek5 μM, TPEN, veya S100A7/calprotectin.

Sonuçlar

Neisseria gonorrhoeae büyümesi için iz metallerin yokluğunda belirli bir tanımlanmış ortam geliştirilmiş ve metal duyarlı genler ve gen ürünlerinin karakterizasyonu için uygulanmıştır. Optimize edilmiş protokolde, medyanın metal profili, metal bir hedefin titre şelasyonunu değil, araştırmacının takdirine bağlı olarak metaller ekleyerek kontrol edilir ve laboratuvardan laboratuvara ve deneyden deneye kadar daha fazla kontrol ve tutarlılık sağlar. Bu or...

Tartışmalar

Büyüme ortamı mikrobiyolojik araştırmalarda çeşitli rollere hizmet vermektedir. Özel ortam seçimi, zenginleştirme ve çalışma birçok benzersiz türleri için çeşitli diğer uygulamalar için kullanılır. Böyle bir uygulama metal duyarlı genlerin indüksiyon, genellikle belirli bir metal iyon hedefleyen belirli bir şelatör eklenmesi ile gerçekleştirilir. Bu yöntem sınırlıdır, çeşitli eser metaller için gerekli şelasyon miktarı benzersiz metal profilleri içeren farklı su kaynakları nedeni...

Açıklamalar

Yazarların beyan etmek için hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma NIH'nin R01 AI125421, R01 AI127793 ve U19 AI144182 hibeleri ile desteklenmiştir. Yazar, bu yöntemin okunmasında ve incelenmesinde emeği geçen tüm laboratuvar üyelerine teşekkür eder.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
125 mL sidearm flasksBellco2578-S0030Must be custom ordered
2-MercaptoethanolVWRM131Open in fume hood
3MM PaperGE Health3030-6461Called "filter paper" in text
AgaroseBioloneBIO-41025Powder
Ammonium chlorideSigma-AldrichA9434Powder
BiotinSigma-AldrichB4501Powder
Blotting grade blockerBio-Rad170-6404Nonfat dry milk
Bovine serum albuminRoche3116964001Powder
Bovine transferrinSigma-AldrichT1428Powder
Calcium chloride dihydrateSigma-AldrichC5080Powder
Calcium pantothenateSigma-AldrichC8731Powder
CalprotectinN/AN/AWe are supplied with this by a collaborator
Chelex-100 ResinBio-Rad142-2832Wash with deionized water prior to use
Cotton-tipped sterile swabPuritan25-806Cotton is better than polyester for this application
DeferoxamineSigma-AldrichD9533Powder
D-glucoseSigma-AldrichG8270Powder
Dialysis cassetteThermo66380Presoak in buffer prior to use
Dot blot apparatusSchleicher & Schwell10484138Lock down lid as tightly as possible before sample loading
EthanolKoptecV1016Flammable liquid, store in flammables cabinet
Ferric chlorideSigma-AldrichF7134Irritant, do not inhale
Ferric nitrate nonahydrateSigma-AldrichF1143Irritant, do not inhale
GC medium baseDifco228950Powder, already contains agar
GlycineSigma-AldrichG8898Powder
HEPESFisherL-15694Powder
Human transferrinSigma-AldrichT2030Powder
HypoxanthineSigma-AldrichH9377Powder
Klett colorimeterManostat37012-0000Uses color transmission to assess culture density
L-alanineSigma-AldrichA7627Powder
L-arginineSigma-AldrichA5006Powder
L-asparagine monohydrateSigma-AldrichA8381Powder
L-aspartateSigma-AldrichA9256Powder
L-cysteine hydrochlorideSigma-AldrichC1276Powder
L-cystineSigma-AldrichC8755Powder
L-glutamateSigma-AldrichG1251Powder
L-glutamineSigma-AldrichG3126Powder
L-histidine monohydrochlorideSigma-AldrichH8125Powder
L-isoleucineSigma-AldrichI2752Powder
L-leucineSigma-AldrichL8000Powder
L-lysineSigma-AldrichL5501Powder
L-methionineSigma-AldrichM9625Powder
L-phenylalanineSigma-AldrichP2126Powder
L-prolineSigma-AldrichP0380Powder
L-serineSigma-AldrichS4500Powder
L-threonineSigma-AldrichT8625Powder
L-tryptophanSigma-AldrichT0254Powder
L-tyrosineSigma-AldrichT3754Powder
L-valineSigma-AldrichV0500Powder
Magnesium sulfateSigma-AldrichM7506Powder
MethanolVWRBDH1135-4LPFlammable liquid, store in flammables cabinet
NitrocelluloseGE Health10600002Keep in protective sheath until use
Potassium phosphate dibasicSigma-Aldrich60356Powder
Potassium phosphate monobasicSigma-AldrichP9791Powder
Potassium sulfateSigma-AldrichP0772Powder
Potato starchSigma-AldrichS4251Powder
Reduced glutathioneSigma-AldrichG4251Handle carefully. Can oxidize easily.
S100A7N/AN/AWe are supplied with this by a collaborator
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS5761Powder
Sodium chlorideVWR470302Powder
Sodium citrateFisherS279Powder
Sodium hydroxideAcros Organics383040010Highly hygroscopic
Thiamine hydrochlorideSigma-AldrichT4625Powder
Thiamine pyrophosphateSigma-AldrichC8754Also called cocarboxylase
TPENSigma-AldrichP4413Powder
TrisVWR497Powder
UracilSigma-AldrichU0750Powder
Zinc sulfte heptahydrateSigma-Aldrich204986Irritant, do not inhale

Referanslar

  1. Cornelissen, C. N. Subversion of nutritional immunity by the pathogenic Neisseriae. Pathogens and Disease. 76 (1), (2018).
  2. Ducey, T. F., Carson, M. B., Orvis, J., Stintzi, A. P., Dyer, D. W. Identification of the iron-responsive genes of Neisseria gonorrhoeae by microarray analysis in defined medium. Journal of Bacteriology. 187 (14), 4865-4874 (2005).
  3. Pawlik, M. C., et al. The zinc-responsive regulon of Neisseria meningitidis comprises 17 genes under control of a Zur element. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6594-6603 (2012).
  4. Andreini, C., Banci, L., Bertini, I., Rosato, A. Zinc through the three domains of life. Journal of Proteome Research. 5 (11), 3173-3178 (2006).
  5. Frawley, E. R., Fang, F. C. The ins and outs of bacterial iron metabolism. Molecular Microbiology. 93 (4), 609-616 (2014).
  6. Thompson, S., Chesher, D. Lot-to-Lot Variation. The Clinical Biochemist Reviews. 39 (2), 51-60 (2018).
  7. Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nature Reviews Microbiology. 10 (8), 525-537 (2012).
  8. Lopez, C. A., Skaar, E. P. The Impact of Dietary Transition Metals on Host-Bacterial Interactions. Cell Host Microbe. 23 (6), 737-748 (2018).
  9. Kehl-Fie, T. E., et al. MntABC and MntH contribute to systemic Staphylococcus aureus infection by competing with calprotectin for nutrient manganese. Infection and Immunity. 81 (9), 3395-3405 (2013).
  10. Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (2), 218-224 (2010).
  11. Seib, K. L., et al. Defenses against oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae: a system tailored for a challenging environment. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70 (2), 344-361 (2006).
  12. Wu, H. J., et al. PerR controls Mn-dependent resistance to oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae. Molecular Microbiology. 60 (2), 401-416 (2006).
  13. Rayner, M. H., Suzuki, K. T. A simple and effective method for the removal of trace metal cations from a mammalian culture medium supplemented with 10% fetal calf serum. Biometals. 8 (3), 188-192 (1995).
  14. Kellogg, D. S., Peacock, W. L., Deacon, W. E., Brown, L., Pirkle, D. I. Neisseria Gonorrhoeae. I. Virulence Genetically Linked to Clonal Variation. Journal of Bacteriology. 85, 1274-1279 (1963).
  15. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  16. Heinicke, E., Kumar, U., Munoz, D. G. Quantitative dot-blot assay for proteins using enhanced chemiluminescence. Journal of Immunological Methods. 152 (2), 227-236 (1992).
  17. Jean, S., Juneau, R. A., Criss, A. K., Cornelissen, C. N. Neisseria gonorrhoeae Evades Calprotectin-Mediated Nutritional Immunity and Survives Neutrophil Extracellular Traps by Production of TdfH. Infection and Immunity. 84 (10), 2982-2994 (2016).
  18. Stork, M., et al. Zinc piracy as a mechanism of Neisseria meningitidis for evasion of nutritional immunity. PLoS Pathogens. 9 (10), 1003733 (2013).
  19. Maurakis, S., et al. The novel interaction between Neisseria gonorrhoeae TdfJ and human S100A7 allows gonococci to subvert host zinc restriction. PLoS Pathogens. 15 (8), 1007937 (2019).
  20. Cornelissen, C. N., Sparling, P. F. Iron piracy: acquisition of transferrin-bound iron by bacterial pathogens. Molecular Microbiology. 14 (5), 843-850 (1994).
  21. Quillin, S. J., Seifert, H. S. Neisseria gonorrhoeae host adaptation and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 16 (4), 226-240 (2018).
  22. Platt, D. J. Carbon dioxide requirement of Neisseria gonorrhoeae growing on a solid medium. Journal of Clinical Microbiology. 4 (2), 129-132 (1976).
  23. Grim, K. P., et al. The Metallophore Staphylopine Enables Staphylococcus aureus To Compete with the Host for Zinc and Overcome Nutritional Immunity. MBio. 8 (5), 01281-01317 (2017).
  24. Helbig, K., Bleuel, C., Krauss, G. J., Nies, D. H. Glutathione and transition-metal homeostasis in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 190 (15), 5431-5438 (2008).
  25. Calmettes, C., et al. The molecular mechanism of Zinc acquisition by the neisserial outer-membrane transporter ZnuD. Nature Communications. 6, 7996 (2015).
  26. Hubert, K., et al. ZnuD, a potential candidate for a simple and universal Neisseria meningitidis vaccine. Infection and Immunity. 81 (6), 1915-1927 (2013).
  27. Kumar, P., Sannigrahi, S., Tzeng, Y. L. The Neisseria meningitidis ZnuD zinc receptor contributes to interactions with epithelial cells and supports heme utilization when expressed in Escherichia coli. Infection and Immunity. 80 (2), 657-667 (2012).
  28. Stork, M., et al. An outer membrane receptor of Neisseria meningitidis involved in zinc acquisition with vaccine potential. PLoS Pathogens. 6, 1000969 (2010).
  29. Rosadini, C. V., Gawronski, J. D., Raimunda, D., Argüello, J. M., Akerley, B. J. A novel zinc binding system, ZevAB, is critical for survival of nontypeable Haemophilus influenzae in a murine lung infection model. Infection and Immunity. 79 (8), 3366-3376 (2011).
  30. Ammendola, S., et al. High-affinity Zn2+ uptake system ZnuABC is required for bacterial zinc homeostasis in intracellular environments and contributes to the virulence of Salmonella enterica. Infection and Immunity. 75 (12), 5867-5876 (2007).
  31. Gabbianelli, R., et al. Role of ZnuABC and ZinT in Escherichia coli O157:H7 zinc acquisition and interaction with epithelial cells. BMC Microbiology. 11, 36 (2011).
  32. Biswas, G. D., Anderson, J. E., Chen, C. J., Cornelissen, C. N., Sparling, P. F. Identification and functional characterization of the Neisseria gonorrhoeae lbpB gene product. Infection and Immunity. 67 (1), 455-459 (1999).
  33. Biswas, G. D., Sparling, P. F. Characterization of lbpA, the structural gene for a lactoferrin receptor in Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 63 (8), 2958-2967 (1995).
  34. Chen, C. J., Sparling, P. F., Lewis, L. A., Dyer, D. W., Elkins, C. Identification and purification of a hemoglobin-binding outer membrane protein from Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 64 (12), 5008-5014 (1996).
  35. Wong, C. T., et al. Structural analysis of haemoglobin binding by HpuA from the Neisseriaceae family. Nature Communications. 6, 10172 (2015).
  36. Carson, S. D., Klebba, P. E., Newton, S. M., Sparling, P. F. Ferric enterobactin binding and utilization by Neisseria gonorrhoeae. Journal of Bacteriology. 181 (9), 2895-2901 (1999).
  37. Tseng, H. J., Srikhanta, Y., McEwan, A. G., Jennings, M. P. Accumulation of manganese in Neisseria gonorrhoeae correlates with resistance to oxidative killing by superoxide anion and is independent of superoxide dismutase activity. Molecular Microbiology. 40 (5), 1175-1186 (2001).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve EnfeksiyonSay 157Neisseria gonorrhoeaemetallertan mlanm medyab y me tahlilleriba lay c tahlillerbakteriyel patojenler

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır