ホストリガンドからの金属応答遺伝子の特性評価と金属獲得のためのナイセリア淋菌の金属有限成長

要約

ここでは、金属取り込み用遺伝子の発現を促進するために、金属制限液体培地中の淋菌のナイセリアの増殖方法について説明する。また、これらの条件で増殖したゴノコッカスの表現型を特徴付けるための下流実験についても概説する。これらの方法は、他の細菌における金属応答性遺伝子の特性評価に適するように適合され得る。

要約

鉄や亜鉛などの微量金属は、遺伝子調節、触媒、タンパク質構造を含む原核生物プロセスにおいて重要な役割を果たすことが知られている重要な栄養素です。宿主による金属隔離は、しばしば細菌の金属制限をもたらす。この制限は、タンパク質製品が細菌が金属制限された環境を克服することを可能にする細菌遺伝子発現を誘導する。このような遺伝子の特性評価は困難です。細菌は、前述の遺伝子の発現を達成するのに役立つ金属プロファイルを維持しながら細菌の増殖を可能にする栄養金属への十分なアクセスを可能にする綿密に調製された媒体で増殖しなければならない。そのため、これらの金属の濃度に対しては微妙なバランスを確立する必要があります。人間の宿主のみで生き残るために進化してきたナイセリア淋菌のような栄養的に潔癖な生物を育てることは、さらに複雑さを増す。ここでは、ゴノコッカルの増殖及び所望の遺伝子発現を可能にするのに十分な定義済金属限定培地の調製について説明する。この方法により、研究者は、鉄または亜鉛の定義された供給源を培地に補いながら、望ましくない供給源から鉄および亜鉛をキレートすることができ、その調製物も記載されている。最後に、この培地を利用して金属安定化ゴノコッカル遺伝子のタンパク質産物を特徴付ける3つの実験について概説する。

概要

ナイセリア淋菌は、一般的な性感染症淋病を引き起こす。感染時、病原性ナイセリアは、細菌がヒト宿主^1、2、3による金属制限の努力を克服することを可能にする金属応答性遺伝子のレパートリーを発現する。鉄や亜鉛などの微量金属は、触媒部位の酵素への結合、酸化還元反応への参加、および様々なタンパク質の構造因子として^4、5などの多くの細胞プロセスにおいて重要な役割を果たす。金属に限られた条件では、金属応答性の遺伝子座は破壊され、その結果生じるタンパク質はこれらの栄養素の獲得を助けることができる。これらの遺伝子およびタンパク質の特性評価は、研究者にとってユニークな技術的課題を提示する。金属イオンは、これらの遺伝子のネイティブ遺伝子の転写を天然の遺伝子から誘導するためには細菌から源泉徴収されなければならないが、金属を含む培地からのこれらのイオンの有効なキラキラを最適化することは困難である。原料水の異なる金属プロファイルと粉末成分の固有のロット間変動⁶は、豊富な媒体から特定の金属を除去するために必要なキレート剤の量が異なる場所、成分ベンダー、さらには化学在庫として単一の実験室内で時間をかけて変化することを意味します。

この課題を回避するために、溶液から微量金属を除去するための調製中にChelex-100樹脂で処理される定義された培地の調製について説明する。この培地は、ヒト宿主の外で培養することが困難であるゴノコッカスの増殖を可能にする十分な栄養密度であり、また、研究者は独自の定義された供給源および濃度を加えることによって特定の金属プロファイルを導入することを可能にする。金属。必要な金属を枯渇させる金属の制御されたアドインの方法は、実験の一貫性を高め、水源や化学ロット数などの要因に関係なく、堅牢で複製可能な実験を可能にします。さらに、この媒体はわずかな変更だけ液体か固体として展開することができる、非常に多目的な。

この培地の有用性を実証するために、ゴノコッカル成長のためのプロトコルを概説し、金属応答性Neisseria遺伝子を特徴付けるための3つの成功した実験について説明する。まず、金属枯渇または補足培養物からゴノコッカス全細胞ライセートを調製し、金属応答性遺伝子座からのタンパク質産生の可変レベルを実証する。次に、特定の有効な亜鉛源の補給によってゴノコッカルの成長を制御する亜鉛制限成長アッセイの概要を説明します。最後に、金属を含むリガンドに結合する金属応答性表面受容体を発現する全ゴノコッカル細胞を示す結合アッセイを示す。これらの受容体の表面提示に成功するには、金属枯渇培地の成長が必要です。

本プロトコルは、ナイセリア淋菌のために特別に最適化されたが、他の多くの細菌病原体は、感染中に金属獲得戦略を採用して^7、このプロトコルは、他の細菌における金属恒常性の研究のために適応され得る。他の細菌で使用するためにこの培地およびこれらの実験プロトコルを最適化するには、他の細菌がゴノコッカスとわずかに異なる金属要件を有する可能性があるため、キレックス-100による金属キレート濃度および/または処理時間のわずかな変更が必要になる可能性があります。鉄と亜鉛は、記載された調査のために懸念される主要な金属であるが、他の金属(例えば、マンガン)は、ナイセリア^{8、9、10、11、12}を含む細菌に対して重要として実証されている。さらに、真核細胞培養作業における金属特性評価についても同様の方法が記載されているが、これも考えられる。¹³

プロトコル

1. チェレックス処理済み定義済み培地(CDM)ストックソリューションの調製

1. ストックソリューションI
   1. NaCl(233.8 g)、K2 SO_4(40.0 g)、NH₄Cl(8.8 g)、K₂HPO_4(13.9 g)、KH₂PO_4(10.9 g)をイオン化した水で1Lの最終体積に組み合わせます。
   2. 50 mL円錐形チューブに溶液とアリコートを滅菌します。
   3. -20 °Cで保管してください。
2. 株式ソリューション II
   1. チアミンHCl(0.2g)、チアミンピロリン酸-Cl(0.05g)、パントテン酸カルシウム(0.19g)、ビオチン(0.3g)を50%(vol/vol)エタノールで50%(vol/vol)エタノールで1Lの最終体積に結合する。
   2. アリコートを50 mL円錐形チューブにし、-20°Cで保管します。
3. 株式ソリューション III
   1. L-アスパラギン酸(4.0 g)、L-グルタミン酸(10.4 g)、L-アルギニン(1.2 g)、グリシン(0.2 g)、L-セリン(0.4 g)、L-ロイシン(0.7 g) 2g)、L-イソロイシン(0.24g)、L-バリン(0.48g)、L-チロシン(0.56g)、Lプロリン(0.4グラム)、L-トリプトファン(0.64g)、L-リプトファン(0.64g)、L--レ スレオニン(0.4 g)、L-フェニルアラニン(0.2 g)、L-アスパラギン-H 2O(0.2 g)、L-グルタミン(0.4 g)、L-ヒスチジン-HCl(0.2 g) 500 mL脱イオン水中のL-メチオニン(0.12g)、L-アラニン(0.8g)、L-リジン(0.4g)、および還元グルタチオン(0.36g)を含む。
   2. L-システイン(0.44 g)およびL-シスチン(0.28 g)を最小体積(〜1 mL)のHClで溶解し、上記のアミノ酸溶液に添加する。
   3. すべての微粒子が溶解するまで、溶液のpHを10N NaOHで調整します。最終 pH は 10.0 ~ 11.0 になります。
   4. 最終体積を脱イオン水で1 Lにします。
   5. フィルターは250 mLの容積に溶液およびアリコートを殺菌する。
   6. -20 °Cで保管してください。
4. 株式ソリューション IV
   1. グルコース(200g)を脱イオン水に1Lの最終体積に溶解する。
      注:溶液は、グルコースを溶解するために加熱する必要があります。
   2. フィルター滅菌し、50 mL円錐形チューブに溶液をアリクォートします。
   3. -20 °Cで保管してください。
5. ストックソリューションV
   1. 脱イオン水中の低キサンチン(5.0g)、ウラシル(5.0g)、NaOH(4.0 g)を1Lの最終体積に結合します。
   2. 50 mL円錐形チューブにフィルター滅菌し、アリクォートします。
   3. -20 °Cで保管してください。
6. ソリューション VI
   1. 脱イオン水で1MCaCl2-2H2O(147g/L)溶液を調製する。フィルター滅菌し、室温(RT)で保存します。
7. ストックソリューションVII
   1. 脱イオン水中に1M無水MgSO₄溶液を調製する。フィルター滅菌し、RTで保存します。
8. ストックソリューションVIII
   1. 脱イオン水で1M_NaHCO3溶液を調製する。フィルター滅菌し、RTで保存します。

2. 4x滅菌濃縮物と1x CDMの調製

注:この手順は、溶液中への金属の浸出を防ぐために、酸処理無菌ガラス製品またはプラスチックのいずれかで行われるべきです。

1. ストックソリューションI(50 mL)、II(20mL)、III(250mL)、IV(50mL)、およびV(20mL)を20.0gのHEPESと組み合わせて混ぜ合わせます。
2. pHを7.4に調整し、その後、脱イオン水で500mLに最終体積を持って来ます。
3. キレックス-100樹脂を1L脱イオン水で洗浄し、4x滅菌濃縮物に添加する前に防腐剤を除去する。これを行うには、1 L脱イオン水に50gの樹脂を加え、少なくとも1時間攪拌して、真空ろ過によって水を取り出し、この洗浄した樹脂をステップ2.4に使用します。
4. 50gの樹脂を加え、ちょうど90分間ゆっくりかき混ぜます。
5. フィルター滅菌により樹脂を除去し、4°Cの滅菌濃縮物を4°Cに保存します。
6. CDMの1倍の働き量を準備するには、まず4x濃縮物を無菌脱イオン水で希釈し、次に溶液VI(1x溶液の500mLあたり125μL)、溶液VII(500mL当たり535μL)、および溶液VIII(500mL当たり10mL)を加える。
   注:すべてのストック溶液はすでに滅菌されていますが、調製後に1x溶液を再び滅菌することを推奨します。

3. CDMプレートの製造

注:以下のレシピは、プレートのための1 Lメディアを作るが、それは小さなボリュームでこれらを準備するのが最善です。すべてが比例してスケールダウンします。

1. 洗浄アガロース
   1. アガロース50gを1L脱イオン水に溶かし、1時間攪拌する。
   2. RTで15分間1,200 x gで遠心分離機ボトルと遠心分離機に溶液を移し、慎重に上清を注ぎ、廃棄します。
   3. アガロースペレットを再懸濁するのに十分な脱イオン水を加え、次いで1Lフラスコに移す。脱イオン水で1 Lの最終体積に持ち込み、ステップ3.1.2のようにかき混ぜて遠心分離します。上清を捨てます。
   4. 十分な100%エタノールを加え、ペレットを再懸濁し、次いで新しい1Lフラスコに移す。エタノールで1 Lの最終容積に持って来なさい。ステップ3.1.2のようにかき混ぜ、遠心分離します。
   5. 手順 3.1.4 を繰り返します。
   6. アガロースペレットにメタノールを加え再懸濁し、1Lフラスコに移します。メタノールで1 Lの最終体積に持ち込みます。ステップ3.1.2のようにかき混ぜ、遠心分離します。
   7. 手順 3.1.6 を繰り返します。
   8. 洗浄したアガロースをアルミホイルが並ぶトレイに移し、ヒュームフードで乾燥させます。乾燥した場合は、長期保存のために金属フリー容器に移す。
2. 750 mLの脱イオン水に、洗浄したアガロース10gとジャガイモデンプン5gを加える。
3. 121 °Cで30分間、大気圧より100kPa上のオートクレーブ。
4. 媒体を〜65°Cまで冷却し、4X CDMの250 mL、溶液VIの250 μL、溶液VIIの1.07 mL、および20 mLの溶液VIIIを加えます。
5. 必要に応じて、プレートを注ぐ前に、選択した金属を追加します。キレート剤の添加は、金属フリー条件を維持するために必要ではありません。
6. ペトリ皿に注ぎ、固める。

4.金属は、ナイセリア淋菌の限られた成長

注:ほとんどのアプリケーションでは、CDMの接種前に細菌に金属応力を加える必要はありません。CDMの最初の倍増ステップとその後の希釈は、その内部鉄および亜鉛の店のゴノコッカスを枯渇させるのに十分である。したがって、以下の手順の最初の2つのステップは、ケロッグのサプリメントI¹⁴および12.5 μM Fe(NO₃₎₃を補充したGC培地ベースから作られた寒天プレートを使用して行われます。早期の金属応力が望ましい場合は、Fe(NO₃₎₃を使用せず、5 μM TPEN (N,N,N,N'-テトラキス (2-ピリジルメチル) エチレンジアミン) を使用して鉄キレーション用に GC 中ベースプレートを準備することをお勧めします。すべてのインキュベーションは、5%の_CO2で37°Cで行われる。

1. 実験の2日前、-2日目に、冷凍庫ストックからGC培地プレートにストリークゴノコッカスを入れ、24時間以下でインキュベートします。
2. 日-1に、新鮮なGC中型プレートに単一のコロニーをストリーク。この 14 ~ 16 時間は、成長実験の前に実行してください。
3. 実験当日、酸洗浄した125mLのサボアームフラスコ(補足図1)に5~10mL1x CDMを加え、これを使用してクレットの色調をブランクにします。
4. 無菌の綿棒を使用して、健康な単一コロニーからCDMを接種します。20クレットユニットを目指してください。
   注:クレットの色素メーターが利用できない場合、分光光度計も同様に適しています。KLETT ユニットから OD へのユニバーサル変換式はありませんが、大まかなガイドがあります (https://support.hunterlab.com/hc/en-us/articles/214490283-Klett-Color-Scales)。
5. 約1質量倍増(40クレット単位)まで250rpmで振とうをインキュベートする。この時間は 1 ~ 2 時間です。
6. この時点で、培養は、初期培養密度の半分に達するCDMの十分な量を加えることによって希釈され(例えば、5 mLの培養が20から40 Klett単位に達した場合、CDMの15 mLは10 Klett単位に戻る)、成長は続くだろう。ステップ 4.5 と同様にします。バック希釈、金属処理などの特定の量は、下流の用途によって異なります。以下の3つの例(セクション5、6、7)を挙げます。

5. 金属反応遺伝子製品のウェスタン分析

1. ステップ4.6から、3つのボリュームのCDM(例えば、5 mLから始まる場合は15 mLのCDM)で培養物を希釈します。この時点で、必要に応じて金属処理を追加します。
   1. 鉄を検出する遺伝子は、12.5 μM Fe(NO₃)₃で退化する可能性があります。亜鉛応答性遺伝子は、10 μM ZnSO₄で押し下げられる可能性がある。
   2. 追加の鉄や亜鉛のストレスは、メディアがすでに枯渇しているので、応答性遺伝子はすでに発現しているので、必要ありません。さらにストレスが必要な場合は、過度のストレスが培養の増加を妨げるため、1~2 μM以下のデフェロキサミンまたはTPENを推奨します。
2. 4時間のステップ4.5のように培養を成長させ、サンプルの最終的な細胞密度を記録します。金属にストレスを感じの少ない文化は、最終的な密度が高くなります。
3. 適切な密度に培養を標準化し、ライセートを調製する。
   1. 培養の1 mLで100クレット単位に相当する密度に全細胞ライセートを標準化します。これを達成するには、サンプルのKlett単位密度で100を割ります。あなたが得る数は、細胞ペレットを作るために使用される培養量(mL)です。
4. 標準的なSDS-PAGEおよびウェスタンブロッティング手順¹⁵に従って、目的のタンパク質をプローブします。

6. 金属限定成長アッセイ

注: これらのアッセイは、前作の成長プレミックスを記述します。これらの混合の調製は、セクション8で説明される。

1. ステップ4.5で質量倍増の間に、10xプレミックスと96ウェルマイクロプレートの井戸を引き出します。さらに、ブランクとして機能する 3 つの井戸を指定します。これらの井戸に、10μLの10μLのプレミックスと90 μLのCDMを加えてください。
2. サイドアームフラスコ内の培養物が2倍になったら、マイクロプレートの未使用井戸に各培養物の100μLを加え、600nm(OD₆₀₀₎で光学密度を測定する。これは分光光度計のキュベットで行うことができますが、アッセイ内の株の数が多いとこれは面倒になる可能性があり、一般的に、あなたの分光光度計が側腕フラスコの腕から直接測定できない限り、お勧めしません(補足図2)。
   1. ODを測定しながら、フラスコをインキュベーターに戻して、ゴノコッカスが生存可能なままであることを確認します。
3. カルチャを OD₆₀₀ = 0.02 に持ち込むために必要な希釈量を計算します。10x プレミックスは OD に対して無視できる影響を与え、計算から省略できます。
4. 小さな培養管でCDMで培養し、10xプレミックスをプレート内の1xに希釈するのに十分な量を加える。プレートウォーマーが利用可能な場合は、作業中にプレートを37 °Cに保ちます。
5. プレートリーダーでの揺れでプレートを8~12時間インキュベートし_、OD600の測定を所望の間隔で行います。

7. 外膜金属輸送体によるリガンド結合の検出

1. 工程5.1のように所望の培養物を処理し、その後4時間振とうを伴ってインキュベートする。
2. 4時間のマークの少し前に、3枚のろ紙とニトロセルロースをドットブロット装置に収めるのに必要なおおよその大きさに切り取った(補足図3)。ニトロセルロースを脱イオン水に前置きし、ニトロセルロースの下にろ紙で装置を組み立てます。
3. 4時間で、細胞密度を記録し、適切な最終密度に標準化します。ステップ5で細胞ライセートの調製に使用される密度の10%を〜10%使用することが推奨される。例えば、1mLの1mLで100KUを使用して、これらのブロットについて1mLで〜10KUを意味する。それ以外の場合、計算は5.3.1で説明したのと同じであり、培養液は、ライセートにするのではなく、計算されたボリュームでニトロセルロースに直接追加されます。
4. ピペット細胞培養物をニトロセルロース上に培養し、濾紙が全ての液体を吸収するのに十分な時間を確保した。
5. 装置を分解し、ブロットを乾燥させ、トリス緩衝生理食液中の5%ウシ血清アルブミンまたは非脂肪乳(w/v)で1時間ニトロセルロース膜を遮断する。
6. ドットブロット装置を組み立て直し、ろ紙をパラフィンフィルムに置き換え、ニトロセルロースの下に漏れ防止シールを作成する。
7. 目的の金属結合リガンドをブロッカーおよびプローブ細胞で0.2μMに1時間希釈します。
8. 液体を真空で吸い取り、ブロットを洗い、その後、標準的な免疫学的手順に従って信号¹⁶を開発する。洗浄手順は、装置の中または外で行われてもよい。

8. トランスフェリン、S100A7、カルプロテクチンの金属装填と10xプレミックスの調製

注:CDM製剤と同様に、溶液調製のために酸洗浄ガラスまたはプラスチックを使用してください。

1. ヒトトランスフェリンを初期バッファー(100 mMトリス、150 mM NaCl、20 mM NaHCO_3、pH= 8.4)で10 mg/mL (125 μM) で溶解します。S100A7およびカルプロテキンは、20 mMトリス、100 mM NaCl、10 mM 2-メルカプトエタノール、および1 mM CaCl₂、pH = 8.0からなるバッファーに懸濁される。
   1. フェレーション溶液(クエン酸ナトリウム100mM、100 mM NaHCO_3、5mM FeCl₃-6H₂O、pH = 8.4)を加えて30%の鉄飽和を達成する(例えば、75 μLのフェレーション溶液は10mg/mLで行われた場合5mLのトランスファーに適している)。
   2. ZnSO₄をS100A7またはカルプロテキンに添加し、タンパク質に対して50%のモル比で25%の飽和を生じさせる(各タンパク質分子は2つの金属結合部位を有する)。50 μM ZnSO₄を用いた100 μM S100A7またはカルプロテクチンの調製物を使用できます。
   3. どちらの場合も、金属荷重に対して少なくとも1時間のエンドエンド混合を許可します。
2. 4 L の透析バッファー (40 mM トリス、150 mM NaCl、20 mM NaHCO₃、pH = 7.4) を準備します。これを2つの独立した2 Lボリュームに分割し、1つを4°Cに配置します。
3. RTで4時間の最初の緩衝液量に対してシリンジと透析を使用して透析カセットに金属装填タンパク質を加える。
4. カセットを第2の緩衝液容量に移動し、4°Cで一晩透析する。これらの手順の後、非結合金属を除去する必要があります。
   注:透析後のタンパク質濃度を決定するために、ビチンポニン酸アッセイを勧めます。
5. 唯一の鉄源としてトランスフェリンの利用のために10xトランスフェリンプレミックスを使用してください。
   1. このプレミックスを準備するには、30%のヒトFe-トランスフェリンとウシアポトランスフェリン(鉄荷重ステップなしでヒトトランスフェリンについて説明したように125μMで調製)をPBSでそれぞれ75μMおよび30μMに希釈します。陽性コントロールプレミックスは、30%Fe-トランスフェリンを75 μM Fe(NO₃₎₃に置き換え、負のコントロールプレミックスは、ウシアポトランスフェリンのみを保持し、追加された鉄を省略します。成長アッセイでは、これらの濃縮物の10μLを90μLの培養で希釈します。最終濃度は7.5 μM 30%ヒトFe-トランスフェリンおよび3 μMウシアポトランスフェリンです。
6. S100A7用トランスフェリン10xプレミックスの修正版またはカルプロテクチン利用を唯一の亜鉛源として使用してください。
   1. ポジティブコントロールプレミックスの場合、50 μM ZnSO₄をトランスフェリンプレミックスに組み込みます。負の制御の場合は、50 μM TPEN を組み込み、亜鉛を省略します。次に、必要なサンプルごとに各サンプルを10 μLずつ取り、その体積を新しいチューブに移動します。無菌PBSのこの半分のボリュームに追加します。例えば、10ウェルがポジティブコントロールプレミックスを受け取る場合、プレミックスの100μLを取り、それを新しいチューブに移動させ、50 μLのPBSを加えます。負の制御に対して同じ操作を行います。
   2. S100A7またはカルプロテクチンプレミックスを作るために、必要な1ウェルあたり10 μLのマイナスコントロールプレミックスを取り、新しいチューブに移動し、25%Zn-S100A7またはカルプロテクチンの半分の体積を加えます。増殖アッセイでは、15 μLのプレミックスを使用し、85 μLの培養で希釈します。トランスフェリンの最終濃度はステップ8.5と同じままで、Zn、TPEN、またはS100A7/カルプロテクチンの5 μMを加えた。

結果

ナイセリア淋菌の増殖のための微量金属の存在しない特定の定義された媒体が開発され、金属応答性遺伝子とその遺伝子産物の特性評価のために実施された。最適化されたプロトコルでは、メディアの金属プロファイルは、金属ターゲットの滴定キレートではなく、研究者の裁量で金属を追加して制御し、ラボからラボ、実験から実験までの制御と一貫性を高?...

ディスカッション

成長メディアは、微生物学研究において様々な役割を果たします。特殊なメディアは、多くのユニークなタイプの研究のために、選択、濃縮、および他の様々なアプリケーションに使用されます。そのような用途の1つは、金属応答性遺伝子の誘導であり、これは典型的には、特定の金属イオンを標的とする特定のキレート剤を添加することによって達成される。この方法は限定され、様々な...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
125 mL sidearm flasks	Bellco	2578-S0030	Must be custom ordered
2-Mercaptoethanol	VWR	M131	Open in fume hood
3MM Paper	GE Health	3030-6461	Called "filter paper" in text
Agarose	Biolone	BIO-41025	Powder
Ammonium chloride	Sigma-Aldrich	A9434	Powder
Biotin	Sigma-Aldrich	B4501	Powder
Blotting grade blocker	Bio-Rad	170-6404	Nonfat dry milk
Bovine serum albumin	Roche	3116964001	Powder
Bovine transferrin	Sigma-Aldrich	T1428	Powder
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C5080	Powder
Calcium pantothenate	Sigma-Aldrich	C8731	Powder
Calprotectin	N/A	N/A	We are supplied with this by a collaborator
Chelex-100 Resin	Bio-Rad	142-2832	Wash with deionized water prior to use
Cotton-tipped sterile swab	Puritan	25-806	Cotton is better than polyester for this application
Deferoxamine	Sigma-Aldrich	D9533	Powder
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Powder
Dialysis cassette	Thermo	66380	Presoak in buffer prior to use
Dot blot apparatus	Schleicher & Schwell	10484138	Lock down lid as tightly as possible before sample loading
Ethanol	Koptec	V1016	Flammable liquid, store in flammables cabinet
Ferric chloride	Sigma-Aldrich	F7134	Irritant, do not inhale
Ferric nitrate nonahydrate	Sigma-Aldrich	F1143	Irritant, do not inhale
GC medium base	Difco	228950	Powder, already contains agar
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898	Powder
HEPES	Fisher	L-15694	Powder
Human transferrin	Sigma-Aldrich	T2030	Powder
Hypoxanthine	Sigma-Aldrich	H9377	Powder
Klett colorimeter	Manostat	37012-0000	Uses color transmission to assess culture density
L-alanine	Sigma-Aldrich	A7627	Powder
L-arginine	Sigma-Aldrich	A5006	Powder
L-asparagine monohydrate	Sigma-Aldrich	A8381	Powder
L-aspartate	Sigma-Aldrich	A9256	Powder
L-cysteine hydrochloride	Sigma-Aldrich	C1276	Powder
L-cystine	Sigma-Aldrich	C8755	Powder
L-glutamate	Sigma-Aldrich	G1251	Powder
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G3126	Powder
L-histidine monohydrochloride	Sigma-Aldrich	H8125	Powder
L-isoleucine	Sigma-Aldrich	I2752	Powder
L-leucine	Sigma-Aldrich	L8000	Powder
L-lysine	Sigma-Aldrich	L5501	Powder
L-methionine	Sigma-Aldrich	M9625	Powder
L-phenylalanine	Sigma-Aldrich	P2126	Powder
L-proline	Sigma-Aldrich	P0380	Powder
L-serine	Sigma-Aldrich	S4500	Powder
L-threonine	Sigma-Aldrich	T8625	Powder
L-tryptophan	Sigma-Aldrich	T0254	Powder
L-tyrosine	Sigma-Aldrich	T3754	Powder
L-valine	Sigma-Aldrich	V0500	Powder
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506	Powder
Methanol	VWR	BDH1135-4LP	Flammable liquid, store in flammables cabinet
Nitrocellulose	GE Health	10600002	Keep in protective sheath until use
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	60356	Powder
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P9791	Powder
Potassium sulfate	Sigma-Aldrich	P0772	Powder
Potato starch	Sigma-Aldrich	S4251	Powder
Reduced glutathione	Sigma-Aldrich	G4251	Handle carefully. Can oxidize easily.
S100A7	N/A	N/A	We are supplied with this by a collaborator
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	Powder
Sodium chloride	VWR	470302	Powder
Sodium citrate	Fisher	S279	Powder
Sodium hydroxide	Acros Organics	383040010	Highly hygroscopic
Thiamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	T4625	Powder
Thiamine pyrophosphate	Sigma-Aldrich	C8754	Also called cocarboxylase
TPEN	Sigma-Aldrich	P4413	Powder
Tris	VWR	497	Powder
Uracil	Sigma-Aldrich	U0750	Powder
Zinc sulfte heptahydrate	Sigma-Aldrich	204986	Irritant, do not inhale