מתכת-צמיחה מוגבלת של הגגורסריה של ניציבטיים לאפיון של גנים מתכתיים מגיבים ורכישת מתכות מהמארח ליגנדס

Summary

אנו מתארים כאן שיטה לצמיחה של זיבה Neisseria במדיום נוזלי מוגבל מתכת כדי להקל על ביטוי של גנים ספיגת מתכת. כמו כן, אנו מגדירים במטה ניסויים לאפיון הפנוטיפ של גונקוצ'י שגדל בתנאים אלה. שיטות אלה ניתן להתאים כדי להיות מתאים לאפיון של גנים התגובה מתכת בחיידקים אחרים.

Abstract

עקבות מתכות כגון ברזל ואבץ הם חומרים מזינים חיוניים הידועים לשחק תפקידי מפתח בתהליכים prokaryotic כולל רגולציה גנטית, זרז, מבנה החלבון. קיבוע על מתכת על ידי מארחים מוביל לעתים קרובות הגבלת מתכת עבור החיידק. מגבלה זו מעוררת ביטוי גנים חיידקי אשר מוצרי החלבון שלהם מאפשרים לחיידקים להתגבר על הסביבה מתכת מוגבלת שלהם. אפיון של גנים כאלה הוא מאתגר. חיידקים יש לגדל במדיה מוכנה בקפדנות המאפשרת גישה מספקת מתכות תזונתיות כדי לאפשר גידול חיידקי תוך שמירה על פרופיל מתכת התורמת להשגת ביטוי של הגנים הנ ל. ככזה, יש להקים איזון עדין בריכוזים של מתכות אלה. גידול אורגניזם בררן מבחינה תזונתית, כגון גונדו,שהתפתח לשרוד רק בפונדקאי האנושי, מוסיף רמה נוספת של מורכבות. כאן, אנו מתארים את ההכנה של המדיום מוגבל מתכת מוגבלת מספיק כדי לאפשר צמיחת דלקת ואת הביטוי הגן הרצוי. שיטה זו מאפשרת לחוקר ברזל ואבץ ממקורות בלתי רצויים, תוך הגדלת המדיה עם מקורות ברזל או אבץ, שהכנתה מתוארת גם כן. בסופו של דבר, אנו מתווה שלושה ניסויים המשתמשים במדיה זו כדי לעזור לאפיין את מוצרי החלבון של הגנים המוסדרים מתכת המתכת.

Introduction

גונדוניים גורם לזיבה השכיחה. של זיהום מינית במהלך הדלקת, Neisseria הפתוגניים מבטא רפרטואר של גנים מגיבים מתכת המאפשרים לחיידקים להתגבר על מאמצי הגבלת מתכת על ידי הפונדקאי האנושי^1,2,3. מעקב אחר מתכות כמו ברזל ואבץ תפקידי מפתח בתהליכים סלולריים רבים, כגון קשירה לאנזימים באתרים קטליטיים, השתתפות בתגובות נגד חמצון, וכגורמים מבניים בחלבונים שונים^4,5. בתנאים מוגבלים במתכת, המצב הניתן לתגובה ממתכת מצטמצם והחלבונים העשויים לסייע לרכישת החומרים המזינים הללו. אפיון הגנים והחלבונים הללו מציג אתגר טכני ייחודי עבור החוקר. יוני מתכת חייב להיות מחוץ חיידקים כדי לגרום שעתוק של גנים אלה מן המוצא הילידים שלהם, אבל הכלרות יעיל של יונים אלה מדיה לאדן מתכת יכול להיות קשה למטב. פרופילי מתכת שונים של מים המקור הטבועה הרבה-ללוט וריאציה⁶ של מרכיבים אבקה פירושה כי כמות הכלור נדרש כדי להסיר מתכת מסוימת ממדיום עשיר ישתנה בין מיקומים שונים, ספקי המרכיב, ואפילו לאורך זמן בתוך מעבדה אחת כמו מלאי כימי מוחלף.

כדי לעקוף את האתגר הזה, אנו מתארים את ההכנה של בינוני מוגדר כי הוא טיפל עם שרף צ'אקס-100 במהלך ההכנה להסרת מתכות מעקב מהפתרון. המדיום הזה הוא מזון מספיק צפוף כדי לאפשר את הצמיחה של gonococcus, אשר קשה לתרבות מחוץ הפונדקאי האנושי, ומאפשר לחוקר להציג פרופיל מתכת ספציפית על ידי הוספת מקורות שלהם מוגדרים וריכוזים של מתכות. שיטת התוספת מבוקרת של מתכות הרצוי לרוקן בינונית מגביר את העקביות ניסיוני ומאפשר לחזק, ניסויים השכפול ללא קשר לגורמים כגון מקור המים מספרים החומר הכימי. יתר על כן, מדיה זו ניתן לפרוס כמו נוזל או מלא עם שינויים קלים בלבד, מה שהופך אותו צדדי למדי.

כדי להדגים את כלי השירות של המדיום הזה, אנו מתארים פרוטוקול עבור השימוש בו עבור צמיחה דלקת ולתאר שלושה ניסויים מוצלחים לאפיון גנים מתכת התגובה הגיבה. ראשית, אנו מכינים בתאי מתכת שלמים מתרבויות מתכתיות או שנוספו ומדגימים רמות משתנה של ייצור חלבונים מתוך המצב התגובה המתכתי. לאחר מכן אנו מתווה שיטת צמיחה מוגבלת אבץ שבו הצמיחה דלקת נשלטת על ידי תוספי מקורות אבץ ספציפיים, שמיש. בסופו של דבר, אנו מראים כריכה מחייב כי להפגין תאים דלקת שלם ביטוי מתכת-תגובה קולטני השטח כריכה על מתכת בהתאמה שלהם המכילים ליגנדס. מצגת פני השטח מוצלחת של קולטנים אלה דורש צמיחה בינונית המרוקנת מתכת.

הפרוטוקול הנוכחי היה מיטבי במיוחד עבור גונדוסטין, אבל רבים פתוגנים חיידקים אחרים להעסיק אסטרטגיות רכישת מתכת במהלך זיהום⁷, כך פרוטוקול זה עשוי להיות מותאם לחקר הומאוסטזיס מתכת בחיידקים אחרים. מיטוב התקשורת הזאת ואת הפרוטוקולים הניסיוניים האלה לשימוש בחיידקים אחרים צפויים לדרוש שינוי קל של ריכוזי מתכת כלאטור ו/או זמן טיפול עם צ'אקס-100, כמו חיידקים אחרים עשויים להיות מעט שונה דרישות מתכת מאשר gonococcus. ברזל ואבץ הם המתכות העיקריות של דאגה החקירות המתוארות, אבל מתכות אחרות (למשל, מנגן) הוכחו כקריטיים עבור חיידקים, כולל neisseria^8,9,10,11,12. יתר על כן, שיטות דומות תוארו עבור המאפיינים מתכת בעבודה בתרבות התאים איקריוטית, אשר עשוי גם להיחשב. מיכל ^{בן 13}

Protocol

1. הכנת מניות שטופלו במדיום (CDM) פתרונות מדמין

1. פתרון מניות אני
   1. לשלב הנאל (233.8 g), K₂SO₄ (40.0 g), NH₄Cl (8.8 g), K₂hpo₄ (13.9 g), ו-KH₂פו₄ (10.9 g) במים מאוהים לנפח הסופי של 1 L.
   2. מסננים לחטא את הפתרון סדרת מחלקים לתוך 50 מ"ל צינורות חרוט.
   3. חנות ב-20 ° c.
2. פתרון מניות II
   1. לשלב את הHCl תיאמין (0.2 g), תיאמין פירופוספט-קלרנית (0.05 g), הסידן פנטטיאט (0.19 g), ו ביוטין (0.3 g) ב 50% (vol/vol) אתנול לכרך הסופי של 1 L.
   2. מ50 לצינורות חרוטיים ולחנות ב-20 ° c.
3. פתרון מניות III
   1. לשלב L-aspartate (4.0 g), L-גלוטמט (10.4 g), L-arginine (1.2 g), גליצין (0.2 g), L-סרין (0.4 g), L-leucine (0.72 g), L-isoleucine (0.24 g), L-valine (0.48 g), l-טירולך (0.56 g), L-proline (0.4 g), L-טריפטופן (0.64 g), L-טראונין (0.4 g), L-פנילאלנין (0.2 g), L-אספרגין-H₂O (0.2 g), l-גלוטמין (0.4 g), l-היסטידין-HCl (0.2 g), l-מתיונין (0.12 g), l-alanine (0.8 g), l-ליזין (0.4 g), ומופחתת גלוטתיון (0.36 g) במים שאינם מוהים בשנת 500.
   2. התמוססות L-cysteine (0.44 g) ו-L-cyסטינה (0.28 g) בנפח מינימלי (~ 1 mL) של הHCl 1 M ולהוסיף לפתרון חומצות אמינו לעיל.
   3. להתאים את ה-pH של הפתרון עם 10 N NaOH עד כל החלקיקים הוא הומס. ה-pH האחרון יהיה 10.0 – 11.0.
   4. הביאו את הכרך האחרון ל-1 ל' עם מים מפוהים.
   5. מסנן לחטא את הפתרון סדרת מחלקים לתוך אמצעי אחסון 250 mL.
   6. חנות ב-20 ° c.
4. פתרון מניות IV
   1. התמוססות גלוקוז (200 g) במים מפוהים לנפח הסופי של 1 ל.
      הערה: ייתכן שיש לחמם את הפתרון כדי לפזר את הגלוקוז.
   2. מסנן לעקר ולאחד את הפתרון לתוך 50 מ"ל צינורות חרוט.
   3. חנות ב-20 ° c.
5. פתרון מניות V
   1. לשלב היפוקסאתה (5.0 g), אורציל (5.0 g), ו naoh (4.0 g) במים מאוהים לנפח הסופי של 1 L.
   2. מסנן לעקר ו סדרת מחלקים לתוך 50 מ"ל צינורות חרוט.
   3. חנות ב-20 ° c.
6. פתרון VI
   1. הכינו 1 מטרים₂-_{2h 2}O (147 g/L) הפתרון במים מוכי מלים. מסנן לעקר ולאחסן בטמפרטורת החדר (RT).
7. פתרון מניות VII
   1. הכינו_{תמיסה של} 1 מטר וחצי. במים מוכי מלים סנן לעקר ולאחסן ב RT.
8. פתרון מניות VIII
   1. הכינו תמיסה של 1 מ א₃ במים הנהים. סנן לעקר ולאחסן ב RT.

2. הכנת 4 x ריכוז סטרילי ו-1x CDM

הערה: הליך זה הוא להתבצע באמצעות חומצה מטופלת כלי זכוכית סטרילי או פלסטיק כדי למנוע שטיפת מתכות לתוך הפתרונות.

1. לשלב פתרונות מניות I (50 mL), II (20 mL), III (250 mL), IV (50 mL), ו V (20 mL) עם 20.0 g של HEPES ומערבבים לערבב.
2. להתאים את ה-pH ל 7.4, ואז להביא את הנפח הסופי ל 500 mL עם מים מוכי.
3. לשטוף את השרף צ'אקס-100 ב 1 ליטר מים להסרת חומרים משמרים לפני הוספת אותו לריכוז סטרילי 4x. לעשות את זה על ידי הוספת 50 g של שרף ל 1 L מוכי המים ו זע לפחות 1 h. להסיר את המים על ידי סינון ואקום ולהשתמש שרף זה שטף לשלב 2.4.
4. הוסף 50 גרם של שרף ומערבבים לאט בדיוק 90 דקות.
5. להסיר שרף על ידי סינון עיקור ולאחסן את הריכוז 4 x סטרילי ב 4 ° c.
6. כדי להכין ריכוז 1x עבודה של CDM, הראשון לדלל את הריכוז 4x עם מים מוכי סטרילי, לאחר מכן להוסיף פתרון VI (125 μL לכל 500 mL של פתרון 1x), פתרון VII (535 μL לכל 500 mL), פתרון VIII (10 מ"ל לכל 500 mL).
   הערה: למרות כל הפתרונות מניות כבר מעוקר, מומלץ לסנן לעקר את הפתרון 1x שוב לאחר ההכנה.

3. הכנת צלחות CDM

הערה: המתכון להלן מבצע 1 מדיית L עבור צלחות, אך מומלץ להכין אותן בנפחים קטנים יותר. . הכל מאזניים באופן פרופורציונלי

1. צמח שטוף
   1. מתמוסס 50 גרם של agarose ב 1 לאחד המים הללו, מערבב עבור 1 h.
   2. העבר את הפתרון בקבוק צנטריפוגה ו צנטריפוגה ב 1,200 x g עבור 15 דקות ב-RT. בזהירות לשפוך את supernatant ולהשליך.
   3. הוסף מים מספיקים מספיק כדי להשעות מחדש את הגלולה הראשונה, ואז להעביר ל 1 בקבוקון. הביאו את הכרך האחרון של L 1 עם מים מפוהים ולאחר מכן מערבבים וצנטריפוגה כמו בשלב 3.1.2. . מחק את הסופרנטאנט
   4. הוסף מספיק 100% אתנול כדי להשעות את הגלולה, ואז להעביר לבקבוקון 1 L חדש. הביאי את הכרך האחרון. של ל -1 עם אתנול מערבבים וצנטריפוגה כמו בשלב 3.1.2.
   5. חזור על שלב ה3.1.4.
   6. הוסף מתנול לגלולה agarose כדי להשעות מחדש, ואז להעביר ל 1 בקבוקון. הביאי את הכרך האחרון. של 1 ל' עם מתנול מערבבים וצנטריפוגה כמו בשלב 3.1.2.
   7. חזור על שלב ה3.1.6.
   8. העברת שטף מעלה למגש מרופדת ברדיד אלומיניום ומאפשרים ייבוש במנוע. כאשר יבשים, העבר למיכל נטול מתכת לאחסון לטווח ארוך.
2. הוסף 10 גרם של שטוף שטף ו 5 גרם של עמילן תפוחי אדמה כדי 750 mL של מים מוכי.
3. אוטוקלב במשך 30 דקות ב 121 ° c, 100 kPa מעל לחץ אטמוספירי.
4. אפשר למדיה להתקרר ~ 65 ° c, לאחר מכן להוסיף 250 mL של 4X CDM, 250 μL של פתרון VI, 1.07 mL של פתרון VII, ו 20 מ ל של פתרון VIII.
5. אם תרצה, הוסף את מתכות הבחירה לפני שפיכת צלחות. אין צורך בתוספת מתכת לשמירת תנאים ללא מתכות.
6. יוצקים לתוך מנות פטרי ומאפשרות לגבש.

4. מתכת צמיחה מוגבלת של גונדואני מתכתי

הערה: עבור רוב היישומים, אין צורך להדגיש מתכת את החיידקים לפני החיסון CDM. הצעד ההתחלתי ההכפלה ב-CDM ואת הדילול הבאים הוא מספיק כדי לרוקן את gonococci של הברזל הפנימי שלהם חנויות אבץ. ככזה, שני השלבים הראשונים של ההליך הבא מתנהלים באמצעות לוחות אגר עשוי בסיס בינוני GC כי כבר שיושלם עם תוספת של קלוג אני¹⁴ ו 12.5 Μm FE (לא₃)₃. אם הלחץ מתכת מוקדם הוא הרצוי, אנו ממליצים להכין לוחות בסיס בינוני GC ללא Fe (לא₃)₃ עם 5 μm tpen (n, n, n ', n'-טטרקיס (2-פיקנוridylמתיל) ethylenediamine) עבור אבץ הכליון או 10 μm דפרוקסמין עבור ב כל הדגירה מתבצעת ב 37 ° c עם 5% CO_2.

1. יומיים לפני הניסוי, ביום-2, פס gonococci מן המקפיא מניות אל הצלחות בינונית GC ו דגירה עבור לא יותר מ 24 h.
2. ביום -1, רצף מושבות יחיד על לוחיות חדשות של GC בינונית. נסה לעשות את זה 14-16 h לפני הניסוי הצמיחה.
3. ביום הניסוי, להוסיף 5 – 10 מ ל 1x CDM חומצה שנשטפו 125 mL מבולבל בקבוקון נשק (איור משלים 1) ולהשתמש בזה כדי לריק מונה הצביעה klett.
4. השתמש בדגימה סטרילית, משופעת כותנה כדי לחסן CDM מתוך בריאות, מושבות יחיד. . המטרה היא 20 יחידות קלט
   הערה: אם מונה הצביעה Klett אינו זמין, גם ספקטרוסקופיה מתאימה. אין נוסחת המרה אוניברסלית עבור יחידות Klett ל-OD, אך מדריך מחוספס זמין (https://support.hunterlab.com/hc/en-us/articles/214490283-Klett-Color-Scales).
5. דגירה עם טלטול ב 250 סל ד עד הכפלה אחת המסה (40 היחידות Klett). זה צריך לקחת בין 1 – 2 ה.
6. בשלב זה, התרבויות חזרו מדולל על ידי תוספת של נפח מספיק של CDM להגיע למחצית צפיפות התרבות הראשונית (למשל, אם 5 מ ל התרבות הלכה מ 20 כדי 40 Klett יחידות, 15 מ ל של CDM יביא אותו חזרה אל 10 Klett יחידות) וצמיחה יימשך כמו בשלב 4.5. כמות מסוימת של דילול הגב, טיפולי מתכת, וכו ' תלויים ביישומים במורד הזרם. אנו מעניקים שלוש דוגמאות להלן (סעיפים 5, 6, או 7).

5. אנליזה מערבית של מוצרי מתכת לתגובה גנטית

1. החל בשלב 4.6, לאחור לדלל את התרבויות עם שלושה כרכים של CDM (למשל, 15 מ ל של CDM אם מתחילים עם 5 מ ל). בשלב זה, להוסיף טיפולי מתכת אם תרצה.
   1. ניתן להסיר את הלחץ על גנים בעלי חישת ברזל עם 12.5 μM Fe (מס '₃)₃. הגנים להגיב אבץ ניתן להסיר את הלחץ עם 10 μM לייכה₄.
   2. אין צורך במתח נוסף ברזל או אבץ, מכיוון שהתקשורת כבר מרוקנת, כך שניתן יהיה להביע את הגנים המתגיבים. אם המתח הנוסף רצוי, אנו ממליצים לא יותר מ 1 – 2 μm של דפרוקסמין או tpen, כמו לחץ מוגזם תמנע תרבויות לצמוח.
2. לצמוח תרבויות כמו בשלב 4.5 עבור 4 h ולהקליט את צפיפות התא הסופי של דגימות. פחות תרבויות מתכת להדגיש יגדל לצפיפויות הסופי גבוהה יותר.
3. לתקנן את התרבויות לצפיפות מתאימה ולהכין ליסביטים.
   1. תקנן את התאים האחרים לדחיסות שווה ערך ל-100 יחידות Klett ב-1 מ ל של תרבות. כדי להשיג זאת, לחלק 100 על ידי צפיפות יחידת Klett של המדגם שלך. המספר שאתה מקבל הוא הנפח, ב-mL, של התרבות שישמש כדי להפוך את הגלולה התא.
4. בצע את ההליכים הסטנדרטיים של SDS-PAGE ו-המערבי¹⁵ כדי לחקור עבור חלבונים של עניין.

6. מתכת-מוגבלת הצמיחה Assays

הערה: מאמר זה מתאר מראש צמיחה מראש. הכנת תערובות אלה מתוארת בסעיף 8.

1. במהלך הכפלת המסה בשלב 4.5, התייחס מראש את הבארות של 96 מיקרופלייט היטב עם מפרקסים 10x. בנוסף, הגדר שלוש בארות שישמשו ככדורי סרק. כדי בארות אלה, להוסיף 10 μL של 10x הכורה x ו 90 μL של CDM.
2. לאחר התרבויות בצלוחיות נשק הוכפלו, להוסיף 100 μL של כל תרבות היטב בשימוש במיקרו לוחית ולמדוד את הצפיפות האופטית ב 600 nm (OD₆₀₀). זה יכול להיעשות עם כימיקלים ב ספקטרוסקופיה, אבל עם מספר גדול יותר של זנים בתוך התשובה זה יכול להיות מסורבל והוא בדרך כלל לא מומלץ אלא אם ספקטרוסקופיה שלך יכול למדוד ישירות מהזרוע של הזרוע בצד בקבוקון (משלים איור 2).
   1. בזמן מדידת OD, מניחים את מבחנות בחזרה בחממה כדי להבטיח gonococci להישאר קיימא.
3. לחשב את כמות הדילול הנכונה הנדרשת כדי להביא את התרבויות OD₆₀₀ = 0.02. הפרקסים 10x יש השפעה זניחה על OD וניתן להשמיט מהחישוב.
4. לדלל תרבויות עם CDM צינורות התרבות הקטנה ולהוסיף נפח מספיק כדי לדלל את מראשות 10x מראש 1 x בצלחת. אם מחמם צלחת זמין, שמור את הצלחת ב 37 ° c בזמן העבודה.
5. מודקת את הצלחת עבור 8-12 h עם טלטול בקורא צלחת, לקיחת OD₆₀₀ מדידות במרווחי זמן הרצוי.

7. זיהוי ליגוקשירה על-ידי טרנספורטי מתכת ממברנות חיצוניים

1. לטפל בתרבויות כרצונך כמו בשלב 5.1, ולאחר מכן דגירה עם טלטול עבור 4 h.
2. זמן קצר לפני הסימון 4 h, לחתוך שלוש חתיכות של נייר סינון פיסת תאית לגודל המשוער הדרוש כדי להתאים למנגנון כתמי נקודה (משלים איור 3). להשרות את הניטרוצלולוזה במים המוהים, ואז להרכיב את המנגנון עם נייר סינון מתחת הניטרוצלולוזה.
3. בשעה 16:00, הקלט את צפיפות התא ותקנן לצפיפות סופית מתאימה. מומלץ להשתמש ב-~ 10% מהצפיפות המשמשת להכנת התאים הסלולריים בשלב 5. לדוגמה, אם באמצעות 100 KU ב-1 mL עבור lysates, זה אומר ~ 10 KU ב 1 mL עבור אלה blots. החישוב הוא אותו הדבר כפי שמתואר ב 5.3.1, ותרבויות מתווספים ישירות הניטרוצלולוזה באמצעי האחסון המחושבים ולא נעשה lysates.
4. התרבויות התאים pipet על הניטרוצלולוזה לאפשר זמן מספיק עבור נייר סינון לקלוט את כל הנוזל.
5. לפרק את המנגנון, לאפשר את האבן החשופה לייבוש, ולחסום את קרום הניטרוצלולוזה עבור 1 h ב 5% סרום שור או חלב ללא שומן (w/v) ב-Tris מלוחים באגירה.
6. לחבר את מנגנון כתמי הנקודה, החלפת נייר סינון עם סרט פרפין כדי ליצור חותם הוכחה דליפה מתחת ניטרוצלולוזה.
7. לדלל את המתכת מחייב מתכת ועניין של 0.2 μM ב חוסם ו בדיקה תאים 1 h.
8. לשאוב את הנוזל בוואקום ואקום, לשטוף את האבן החשופה ולאחר מכן לבצע הליכים אימונולוגיים סטנדרטיים כדי לפתח את האות¹⁶. ניתן לבצע את צעדי השטיפה בתוך או מחוץ למנגנון.

8. טעינת מתכת, S100A7 וקלגנה והכנת מראשות המלך 10x

הערה: כמו עם הכנה CDM, חומצה שנשטפו זכוכית או פלסטיק עבור הכנת הפתרון.

1. התמוססות האדם ב 10 מ"ג/mL (125 μM) במאגר הראשוני (100 mM טריס, 150 מ"מ הנאל, 20 מ"מ נחקו₃, pH = 8.4). S100A7 ו cal tin הם הושעו במאגר המורכב 20 מ"מ טריס, 100 מ"מ הנאל, 10 מ"מ 2-Mercaptoethanol, ו 1 מ"מ CaCl₂, pH = 8.0).
   1. להוסיף פתרון ferration (100 mM נתרן ציטראט, 100 mM נחקו₃, 5 מ"מ לתקן₃-6h₂O, pH = 8.4) לפתרון העברת כדי להשיג 30% ברזל רוויית (g., 75 μl של פתרון Ferration מתאים ל 5 mL העברת אם נעשה ב 10 מ"ג/mL).
   2. הוסף לS100A7_{או לקלגנה} ביחס טוחנת של 50% לחלבון כדי ליצור רוויה של 25% (לכל מולקולת חלבון יש שני אתרי איגוד מתכת). ההכנות של 100 μM S100A7 או cal tin עם 50 μM האוכל לשימוש₄ ניתן להשתמש.
   3. בשני המקרים, אפשר ערבוב מהסוף לקצה עבור לפחות 1 h עבור טעינת מתכת.
2. להכין 4 L של מאגר דיאליזה (40 mM טריס, 150 מ"מ הנאל, 20 מ"מ נחקו₃, pH = 7.4). פצל את זה לשני כרכים נפרדים של L ומניחים אחד ב -4 ° c.
3. הוסף את המתכת טעון חלבונים לקלטת דיאליזה באמצעות מזרק ו dialyze נגד נפח המאגר הראשון עבור 4 h ב RT.
4. הזז את הקלטת לכרך השני של המאגר והבן לילה ב-4 ° c. לאחר שלבים אלה, יש להסיר כל מתכות לא מאוגדות.
   הערה: אנו ממליצים על שיטת החומצה הבינועית לקביעת ריכוזי חלבונים לאחר דיאליזה.
5. השתמש בקדם העברת 10 x לניצול ההעברה כמקור ברזל יחיד.
   1. להכין את זה מראש על ידי דילול 30% האדם Fe-transferrin ו בשור העברת-החלפת (מוכן ב 125 μM כפי שמתואר עבור העברת האדם, ללא שלב הטעינה ברזל) כדי 75 μM ו 30 μM, בהתאמה, ב-PBS. מראשות שליטה חיובית מחליף 30% Fe-transferrin עם 75 μM Fe (NO₃)₃, ו מראשות שליטה שלילית x משמיט כל ברזל נוסף, שמירה רק על בסיס השור-הועבר. בתוך שיטת הצמיחה, לדלל 10 μL של מרכזים אלה עם 90 μL של התרבות. ריכוזי הסופי הם 7.5 μM 30% האדם Fe-transferrin ו 3 μM בשור-מועבר.
6. השתמש בגירסה שונה של הקדם 10x מראש עבור S100A7 או מקור ניצול כמקור אבץ הבלעדי.
   1. לקבלת שליטה חיובית בכורה, לשלב 50 μM לוקס₄ לתוך העברת מראשות. עבור פקד שלילי, לשלב 50 μM TPEN ולהשמיט את האבץ. לאחר מכן, לקחת 10 μL של כל אחד מהם עבור כל מדגם הדרוש היטב, ולהעביר את הנפח הזה לשפופרת חדשה. הוסף לחצי הזה נפח של הערוץ הסטרילי. לדוגמה, אם 10 בארות יקבל את השליטה החיובי בראש, לקחת 100 μL של מראשות השנה, להעביר אותו צינור חדש, ולהוסיף 50 μL של PBS. עשה את אותו הדבר עבור השליטה השלילית.
   2. כדי להפוך את S100A7 או calprotectin מראש, לקחת 10 μL של השליטה שלילי מראשות השנה לצורך היטב, לעבור צינור חדש, ולהוסיף חצי כמות זו של 25% Zn-S100A7 או calprotectin. בתוך העיבוד הצמיחה, להשתמש 15 μL של מראשות המלך ולדלל עם 85 μL של התרבות. ריכוזי הסופי עבור העברת שיישארו זהה בשלב 8.5, עם התווסף 5 μM של Zn, TPEN, או S100A7/calprotectin.

תוצאות

בינונית מוגדרת ספציפית בהיעדר מתכות מעקב לצמיחתה של ניציסריה הרואובטיים פותחה ויושמה לאפיון הגנים המגיבים במתכת ומוצרי הגנים שלהם. בפרוטוקול הממוטב, פרופיל המתכת של המדיה נשלט על ידי הוספת מתכות בחזרה לשיקול הדעת של החוקר, ולא על ידי הכלתה של מטרה מתכת, המאפשר שליט?...

Discussion

מדיית הצמיחה משרתת מגוון תפקידים במחקר מיקרוביולוגי. מדיה מתמחה משמשים לבחירה, העשרה, ויישומים אחרים שונים עבור סוגים רבים וייחודיים של המחקר. יישום אחד כזה הוא אינדוקציה של גנים המגיבים מתכת, אשר בדרך כלל מושגת על ידי הוספת כלקטור ספציפי כי מטרות יון מתכת מסוים. שיטה זו מוגבלת, ככל שכמות ה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
125 mL sidearm flasks	Bellco	2578-S0030	Must be custom ordered
2-Mercaptoethanol	VWR	M131	Open in fume hood
3MM Paper	GE Health	3030-6461	Called "filter paper" in text
Agarose	Biolone	BIO-41025	Powder
Ammonium chloride	Sigma-Aldrich	A9434	Powder
Biotin	Sigma-Aldrich	B4501	Powder
Blotting grade blocker	Bio-Rad	170-6404	Nonfat dry milk
Bovine serum albumin	Roche	3116964001	Powder
Bovine transferrin	Sigma-Aldrich	T1428	Powder
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C5080	Powder
Calcium pantothenate	Sigma-Aldrich	C8731	Powder
Calprotectin	N/A	N/A	We are supplied with this by a collaborator
Chelex-100 Resin	Bio-Rad	142-2832	Wash with deionized water prior to use
Cotton-tipped sterile swab	Puritan	25-806	Cotton is better than polyester for this application
Deferoxamine	Sigma-Aldrich	D9533	Powder
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Powder
Dialysis cassette	Thermo	66380	Presoak in buffer prior to use
Dot blot apparatus	Schleicher & Schwell	10484138	Lock down lid as tightly as possible before sample loading
Ethanol	Koptec	V1016	Flammable liquid, store in flammables cabinet
Ferric chloride	Sigma-Aldrich	F7134	Irritant, do not inhale
Ferric nitrate nonahydrate	Sigma-Aldrich	F1143	Irritant, do not inhale
GC medium base	Difco	228950	Powder, already contains agar
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898	Powder
HEPES	Fisher	L-15694	Powder
Human transferrin	Sigma-Aldrich	T2030	Powder
Hypoxanthine	Sigma-Aldrich	H9377	Powder
Klett colorimeter	Manostat	37012-0000	Uses color transmission to assess culture density
L-alanine	Sigma-Aldrich	A7627	Powder
L-arginine	Sigma-Aldrich	A5006	Powder
L-asparagine monohydrate	Sigma-Aldrich	A8381	Powder
L-aspartate	Sigma-Aldrich	A9256	Powder
L-cysteine hydrochloride	Sigma-Aldrich	C1276	Powder
L-cystine	Sigma-Aldrich	C8755	Powder
L-glutamate	Sigma-Aldrich	G1251	Powder
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G3126	Powder
L-histidine monohydrochloride	Sigma-Aldrich	H8125	Powder
L-isoleucine	Sigma-Aldrich	I2752	Powder
L-leucine	Sigma-Aldrich	L8000	Powder
L-lysine	Sigma-Aldrich	L5501	Powder
L-methionine	Sigma-Aldrich	M9625	Powder
L-phenylalanine	Sigma-Aldrich	P2126	Powder
L-proline	Sigma-Aldrich	P0380	Powder
L-serine	Sigma-Aldrich	S4500	Powder
L-threonine	Sigma-Aldrich	T8625	Powder
L-tryptophan	Sigma-Aldrich	T0254	Powder
L-tyrosine	Sigma-Aldrich	T3754	Powder
L-valine	Sigma-Aldrich	V0500	Powder
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506	Powder
Methanol	VWR	BDH1135-4LP	Flammable liquid, store in flammables cabinet
Nitrocellulose	GE Health	10600002	Keep in protective sheath until use
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	60356	Powder
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P9791	Powder
Potassium sulfate	Sigma-Aldrich	P0772	Powder
Potato starch	Sigma-Aldrich	S4251	Powder
Reduced glutathione	Sigma-Aldrich	G4251	Handle carefully. Can oxidize easily.
S100A7	N/A	N/A	We are supplied with this by a collaborator
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	Powder
Sodium chloride	VWR	470302	Powder
Sodium citrate	Fisher	S279	Powder
Sodium hydroxide	Acros Organics	383040010	Highly hygroscopic
Thiamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	T4625	Powder
Thiamine pyrophosphate	Sigma-Aldrich	C8754	Also called cocarboxylase
TPEN	Sigma-Aldrich	P4413	Powder
Tris	VWR	497	Powder
Uracil	Sigma-Aldrich	U0750	Powder
Zinc sulfte heptahydrate	Sigma-Aldrich	204986	Irritant, do not inhale