JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы описываем здесь метод для роста Neisseria gonorrhoeae в метал-ограниченной жидкой среде для облегчения экспрессии генов для поглощения металла. Мы также наметить вниз по течению эксперименты, чтобы охарактеризовать фенотип гонококки, выращенные в этих условиях. Эти методы могут быть адаптированы, чтобы быть пригодными для характеристики металлочувствительных генов в других бактериях.

Аннотация

След металлов, таких как железо и цинк являются жизненно важными питательными веществами, как известно, играют ключевую роль в прокариотических процессов, включая регуляцию генов, катализ и структуру белка. Улавливание металла хостами часто приводит к ограничению металла для бактерии. Это ограничение индуцирует экспрессию бактериальных генов, белковые продукты которых позволяют бактериям преодолевать ограниченную металлом окружающую среду. Характеристика таких генов является сложной задачей. Бактерии должны быть выращены в тщательно подготовленных средствах массовой информации, что позволяет достаточный доступ к питательным металлам, чтобы позволить рост бактерий при сохранении металлического профиля, способствующих достижению экспрессии вышеупомянутых генов. Таким образом, необходимо установить хрупкий баланс концентраций этих металлов. Выращивание питательно примиренного организма, такого как Neisseria gonorrhoeae,который эволюционировал, чтобы выжить только у человека-хозяина, добавляет дополнительный уровень сложности. Здесь мы описываем подготовку определенной метал-ограниченной среды, достаточной для того, чтобы позволить гонококковому росту и желаемому экспрессии генов. Этот метод позволяет следователю хелат железа и цинка из нежелательных источников, дополняя средства массовой информации с определенными источниками железа или цинка, подготовка которых также описана. Наконец, мы наметили три эксперимента, которые используют это средства массовой информации, чтобы помочь охарактеризовать белковые продукты металлорегулируемых гонококковых генов.

Введение

Neisseria gonorrhoeae вызывает распространенную инфекцию, передаемую половым путем, гонореей. Во время инфекции, патогенные Neisseria выразить репертуар металл-чувствительных генов, которые позволяют бактериям преодолеть усилия ограничения металла человека хозяина1,2,3. След металлов, как железо и цинк играют ключевую роль во многих клеточных процессов, таких как связывание с ферментами в каталитических участках, участие в редокс реакции, и как структурные факторы в различных белков4,5. В метал-ограниченных условиях, металл-реагируя loci derepressed и их резцирующие протеины могут помочь присваивать эти питательные вещества. Характеристика этих генов и белков представляет собой уникальную техническую задачу для исследователя. Ионы металла должны быть удержаны от бактерий, чтобы вызвать транскрипцию этих генов из их родной локусы, но эффективное хелатора этих ионов из металлических носителей может быть трудно оптимизировать. Различные металлические профили исходной воды и присущие много-много вариации6 порошкообразных ингредиентов означает, что количество хелатора, необходимых для удаления конкретного металла из богатой среде будет варьироваться в зависимости от различных местах, ингредиент поставщиков, и даже с течением времени в рамках одной лаборатории, как химический инвентарь заменяется.

Чтобы обойти эту задачу, мы описываем подготовку определенной среды, которая обрабатывается с помощью моли chelex-100 во время подготовки к удалению следов металлов из раствора. Эта среда является достаточно питательной плотной, чтобы обеспечить рост гонококка, который трудно культуры за пределами человеческого хозяина, и позволяет следователю ввести конкретный профиль металла путем добавления своих собственных определенных источников и концентраций Металлов. Метод контролируемого дополнения желаемых металлов к истощению среды увеличивает экспериментальную консистенцию и позволяет проводить надежные, воспроизводимые эксперименты независимо от таких факторов, как источник воды и химические номера лотов. Кроме того, эти носители могут быть развернуты как жидкость или твердые только с незначительными изменениями, что делает его довольно универсальным.

Для того, чтобы продемонстрировать полезность этой среды, мы наметили протокол для его использования для гонококкового роста и описать три успешных эксперимента для характеристики металлоотвечающего генов Neisseria. Во-первых, мы готовим гонококковые цельноклеточные лизаты из истощенных металлом или дополненных культур и демонстрируем переменные уровни производства белка из металлочувствительных локусов. Затем мы наметили цинк-ограниченный обзор роста, в котором гонококковый рост контролируется добавками конкретных, пригодных для использования источников цинка. Наконец, мы показываем связывающие анализы, которые демонстрируют целые гонококковые клетки, выражающие металлореакционные поверхностные рецепторы, связывающиеся с их соответствующими металлосодержащих лигандами. Успешное поверхностное представление этих рецепторов требует роста в металло-обеденный среды.

Настоящий протокол был оптимизирован специально для Neisseria gonorrhoeae, но многие другие бактериальные патогены используют стратегии приобретения металла во время инфекции7, так что этот протокол может быть адаптирован для изучения металла гомеостаза в других бактерий. Оптимизация этого носителя и этих экспериментальных протоколов для использования в других бактериях, скорее всего, потребует незначительной модификации концентрации металлического хелатора и/или времени лечения с Chelex-100, так как другие бактерии могут иметь несколько иные требования к металлу, чем у гонококка. Утюг и цинк являются основными металлами, вызывающими озабоченность в связи с описанными исследованиями, но другие металлы (например, марганец) были продемонстрированы как критические для бактерий, в том числе Neisseria8,9,10,11,12. Кроме того, аналогичные методы были описаны для характеристик металла в работе эукариотической клеточной культуры, которые также могут быть рассмотрены. 13 Год

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Подготовка Chelex-обработанных Определенных средних (CDM) Фондовые решения

  1. Акционерное решение I
    1. Комбинат NaCl (233,8 г), K2SO4 (40,0 г), NH4Cl (8,8 г), K2HPO4 (13,9 г) и KH2PO4 (10,9 г) в деионизированной воде до конечного объема 1 л.
    2. Фильтр стерилизовать раствор и aliquot в 50 мл конических труб.
    3. Хранить при -20 градусах по Цельсию.
  2. Акционерное решение II
    1. Смешайте тиамин HCl (0,2 г), тиамин пирофосфат-Cl (0,05 г), пантотенат кальция (0,19 г) и биотин (0,3 г) в 50% (vol/vol) этанола до окончательного объема 1 л.
    2. Aliquot в 50 мл конических труб и хранить при -20 градусов по Цельсию.
  3. Акционерное решение III
    1. Комбинат L-аспартат (4,0 г), L-глутамамат (10,4 г), L-аргинин (1,2 г), глицин (0,2 г), L-серин (0,4 г), L-лейцин (1,2 г), L-лецин (0,2 г) 0,72 г), L-изолеуцин (0,24 г), L-валин (0,48 г), L-тирозин (0,56 г), L-пролин (0,4 г), L-триптофан (0,64 г) L-threonine (0,4 г), L-фенилаланин (0,2 г), L-аспарагин-Н2О (0,2 г), L-глутамин (0,4 г), L-гистидин-Хл (0.2 г). 2 г), L-метионин (0,12 г), L-аланин (0,8 г), L-лизин (0,4 г) и снижение глутатиона (0,36 г) в 500 мл деионизированной воды.
    2. Растворите L-цистеин (0,44 г) и L-цистин (0,28 г) в минимальном объеме (1 мл) 1 М ЛК и добавьте к вышеупомянутому аминокислоте раствору.
    3. Отрегулируйте рН раствора с 10 N NaOH до тех пор, пока все частицы не растворятся. Окончательный рН будет 10.0-11.0.
    4. Доведите окончательный объем до 1 л с деионизированной водой.
    5. Фильтр стерилизовать раствор и aliquot в 250 мл объемов.
    6. Хранить при -20 градусах по Цельсию.
  4. Биржевое решение IV
    1. Растворите глюкозу (200 г) в деионизированной воде до конечного объема 1 л.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор, возможно, придется нагревать, чтобы растворить глюкозу.
    2. Фильтр стерилизовать и aliquot раствор в 50 мл конических труб.
    3. Хранить при -20 градусах по Цельсию.
  5. Акционерное решение V
    1. Смешайте гипоксантин (5,0 г), урацил (5,0 г) и НаОХ (4,0 г) в деионизированной воде до конечного объема 1 л.
    2. Фильтр стерилизовать и aliquot в 50 мл конических труб.
    3. Хранить при -20 градусах по Цельсию.
  6. Решение VI
    1. Приготовьте раствор 1 M CaCl2-2H2O (147 г/л) в деионизированной воде. Фильтр стерилизовать и хранить при комнатной температуре (RT).
  7. Биржевое решение VII
    1. Приготовьте раствор 1 M anhydrous MgSO4 в деионизированной воде. Фильтр стерилизовать и хранить на RT.
  8. Акционерное решение VIII
    1. Подготовьте раствор 1 M NaHCO3 в деионизированной воде. Фильтр стерилизовать и хранить на RT.

2. Приготовление 4x стерильного концентрата и 1x CDM

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура должна быть выполнена в любом кислоты обработанной стерильной стеклянной посуды или пластика, чтобы предотвратить выщелачивание металлов в растворы.

  1. Объедините фондовые растворы I (50 мл), II (20 мл), III (250 мл), IV (50 мл) и V (20 мл) с 20,0 г HEPES и перемешайте для смешивания.
  2. Отрегулируйте рН до 7,4, затем доведите окончательный объем до 500 мл с деионизированной водой.
  3. Вымойте сетельную Chelex-100 в 1 л деионизированной воды, чтобы удалить консерванты до добавления ее в стерильный концентрат 4x. Сделайте это, добавив 50 г мисы в 1 л деионизированной воды и помешивая, по крайней мере 1 ч. Удалите воду вакуумной фильтрацией и используйте эту промытую мизину для шага 2.4.
  4. Добавьте 50 г мишеки и медленно перемешайте ровно 90 мин.
  5. Удалите сброс ыватки путем стерилизации фильтра и храните 4x стерильный концентрат при 4 c.
  6. Для подготовки 1x рабочей концентрации CDM сначала разбавить 4x концентрат со стерильной деионизированной водой, затем добавьте раствор VI (125 л на 500 мл 1x раствора), раствор VII (535 л на 500 мл) и раствор VIII (10 мл на 500 мл).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя все биржевые решения уже стерилизованы, рекомендуется фильтровать стерилизовать раствор 1x снова после приготовления.

3. Подготовка CDM пластин

ПРИМЕЧАНИЕ: Рецепт ниже делает 1 L средств массовой информации для пластин, но лучше всего подготовить их в меньших объемах. Все сокращается пропорционально.

  1. Вымытая агароза
    1. Растворите 50 г агарозы в 1 л деионизированной воды, помешивая в течение 1 ч.
    2. Перенесите раствор в центрифугу и центрифугу на 1200 х г в течение 15 мин на RT. Осторожно вылейте супернатант и отбросьте.
    3. Добавьте достаточно деионизированной воды, чтобы повторно приостановить гранулы агарозы, затем перенесите в колбу 1 л. Довести до окончательного объема 1 л с деионизированной водой, а затем перемешать и центрифуги, как в шаге 3.1.2. Отбросьте супернатант.
    4. Добавьте достаточно 100% этанола, чтобы переприимить гранулы, затем перенесите в новую колбу 1 л. Довести до окончательного тома 1 л с этанолом. Перемешать и центрифуги, как в шаге 3.1.2.
    5. Повторите шаг 3.1.4.
    6. Добавить метанол в гранулы агарозы, чтобы переоставить, а затем передать в колбу 1 л. Довести до окончательного объема 1 л с метанолом. Перемешать и центрифуги, как в шаге 3.1.2.
    7. Повторите шаг 3.1.6.
    8. Передача промытой агарозы в лоток, облицованная алюминиевой фольгой, и дайте высохнуть в дымовом капюшоне. При сухом состоянии перенесите в контейнер без металла для длительного хранения.
  2. Добавьте 10 г промытой агарозы и 5 г картофельного крахмала до 750 мл деионированной воды.
  3. Автоклав в течение 30 мин при температуре 121 градуса По Цельсию, 100 кПа выше атмосферного давления.
  4. Дайте носителям остыть до 65 градусов по Цельсию, затем добавьте 250 мл 4X CDM, 250 л раствора VI, 1,07 мл раствора VII и 20 мл раствора VIII.
  5. При желании добавьте металлы выбора перед заливкой пластин. Добавление хелаторов не обязательно для поддержания условий без металла.
  6. Налейте в Петри блюда и дайте затвердеть.

4. Металл ограниченный рост Neisseria гонореи

ПРИМЕЧАНИЕ: Для большинства приложений, это не обязательно металла стресса бактерий до прививки CDM. Первоначальный шаг удвоения в CDM и последующее разбавление достаточно, чтобы истощить gonococci их внутренних магазинов железа и цинка. Таким образом, первые два шага следующей процедуры проводятся с использованием агар пластин из GC средней базы, которые были дополнены дополнением Kellogg I14 и 12,5 мкм Fe (NO3)3. При желании раннего металлического стресса мы рекомендуем готовить гК средних базовых пластин без Фе (NO3)3 и с 5 мкм TPEN (N,N,N',N',N'-tetrakis (2-пиридилметил) этиленедиамин) для цинковой челациации или 10 мкм дефероксамина для чул-железа. Вся инкубация проводится при 37 градусах Цельсия с 5% CO2.

  1. За два дня до эксперимента, в день -2, полоса gonococci из морозильной камеры запасов на ГК средних пластин и инкубировать не более 24 ч.
  2. На день -1, полоса одиночных колоний на свежие средние плиты GC. Попробуйте сделать это 14-16 ч до эксперимента роста.
  3. В день эксперимента добавьте 5-10 мл 1x CDM к кислотной промытой 125 мл озадачитой колбы для боковых рук(Дополнительная череска 1) и используйте это для того, чтобы очистить колориметр Klett.
  4. Используйте стерильный, хлопчатобумажный мазок, чтобы привить CDM от здоровых, одиноких колоний. Цель для 20 единиц Клетт.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если колориметр Klett недоступен, то подойдет и спектрофотометр. Универсальной формулы преобразования для единиц Klett для OD не существует, но имеется грубое руководство(https://support.hunterlab.com/hc/en-us/articles/214490283-Klett-Color-Scales).
  5. Инкубировать с тряской при 250 об/мин примерно до одного удвоения массы (40 единиц Klett). Это должно занять от 1 до 2 ч.
  6. На данный момент, культуры обратно разбавленной путем добавления достаточного объема CDM достичь половины первоначальной плотности культуры (например, если 5 мл культуры пошел от 20 до 40 Единиц Klett, 15 мл CDM принесет его обратно до 10 единиц Klett) и рост будет продолжаться как в шаге 4.5. Конкретное количество обратно разбавления, обработки металла и т.д. зависит от вниз по течению приложений. Ниже приведены три примера (разделы 5, 6 или 7).

5. Западный анализ металлических ответственных генных продуктов

  1. Начиная с шага 4.6, задняя разбавляет культуры тремя томами CDM (например, 15 мл CDM, если начиная с 5 мл). В этот момент, добавить металлические обработки при желании.
    1. Гены, чувствительные к железу, могут быть подавлены с помощью 12,5 км ММ Фе (NO3)3. Цинк-ответные гены могут быть подавлены с 10 мкм NSO4.
    2. Дополнительный утюг или цинк стресс не является необходимым, так как средства массовой информации уже исчерпаны, так что отзывчивые гены уже будут выражены. При желании дальнейшего стресса мы рекомендуем не более 1-2 км от дефероксамина или TPEN, так как чрезмерное напряжение предотвратит рост культур.
  2. Выращивайте культуры в шаге 4,5 на 4 ч и записывайте окончательную плотность клеток образцов. Меньше металл-напряженных культур вырастет до более высокой конечной плотности.
  3. Стандартизуируй культурдой до подходящей плотности и приготовьте лизата.
    1. Стандартизуизировать цельноклеточные лизаты с плотностью, эквивалентной 100 единицк Клетта в 1 мл культуры. Для достижения этой цели разделите 100 на плотность единицы Klett в выборке. Номер, который вы получаете, это объем, в мЛ, культуры, которая будет использоваться для изготовления клеточных гранул.
  4. Следуйте стандартным SDS-PAGE и западным процедурам промотирования15 для проверки белков, представляющих интерес.

6. Металлические анализы роста

ПРИМЕЧАНИЕ: Эти анализы описывают заранее сделанные примики роста. Подготовка этих смесей описана в разделе 8.

  1. Во время массового удвоения в шаге 4.5, pretreat скважины 96 хорошо микроплиты с 10x premixes. Кроме того, обозначьте три скважины в качестве заготовок. К этим скважинам добавьте 10 кЛ 10-x примикш и 90 КЛ CDM.
  2. После того, как культуры в боковых колбах удвоились, добавьте 100 кЛ каждой культуры к неиспользованной скважине в микроплите и измерьте оптическую плотность на уровне 600 нм (OD600). Это может быть сделано с кюветами в спектрофотометр, но с большим количеством штаммов в рамках анализа это может стать громоздким и, как правило, не рекомендуется, если ваш спектрофотометр может измерять непосредственно из руки колбы стороны руки (Дополнительная рисунок 2).
    1. При измерении OD, место фляги обратно в инкубатор для обеспечения gonococci остаются жизнеспособными.
  3. Рассчитайте правильное количество разбавления, необходимое для доведения культур доOd 600 и 0,02. 10x premixes имеют незначительное влияние на OD и могут быть исключены из расчета.
  4. Разбавить культуры с CDM в небольших трубах культуры и добавить достаточный объем, чтобы разбавить 10x premixs до 1x в пластине. Если тарелка теплее доступна, держать пластину на 37 градусов по Цельсию во время работы.
  5. Инкубировать пластину для 8-12 ч с встряхиванием в плите читателя, принимая OD600 измерений с желаемыми интервалами.

7. Обнаружение Лиганда Связывания внешними переносчиками металла Membrane

  1. Лечить культуры как желаемое, как в шаге 5.1, затем инкубировать с встряхивания в течение 4 ч.
  2. Незадолго до 4 ч знак, вырезать три куска фильтровальной бумаги и кусок нитроцеллюлозы до приблизительного размера, необходимого для вписываются в точка пятно прибора(Дополнительный рисунок 3). Предварительно замочите нитроцеллюлозу в деионизированной воде, затем соберите аппарат с фильтровальной бумагой ниже нитроцеллюлозы.
  3. На 4 ч запишите плотность клеток и стандартизируем соответствующую конечную плотность. Рекомендуется использовать 10% плотности, используемой для подготовки клеточных лисатов в шаге 5. Например, если использовать 100 KU в 1 мл для lysates, это означает, что 10 КУБ в 1 мл для этих помарки. Расчет в противном случае такой же, как описано в 5.3.1, и культуры добавляются непосредственно к нитроцеллюлозы в расчетных объемах, а не сделаны в lysates.
  4. Пиперт клеток культур на нитроцеллюлозы и позволяют достаточно времени для фильтровальной бумаги, чтобы поглотить всю жидкость.
  5. Разобрать аппарат, дать пятно высохнуть, и блокировать мембрану нитроцеллюлозы в течение 1 ч в 5% бычьего сыворотки альбумина или обезжиренного молока (w/v) в Tris-буферированный солен.
  6. Соберите точечный аппарат, заменив фильтровальную бумагу парафиновой пленкой для создания герметичного уплотнения под нитроцеллюлоза.
  7. Разбавить металлосвязывающую лиганд, представляющий интерес, до 0,2 мкм блокатором и зондными ячейками на 1 ч.
  8. Сифон с жидкости с вакуумом, мыть пятно, а затем следовать стандартным иммунологических процедур для разработки сигнала16. Шаги мытья могут быть сделаны в или из аппарата.

8. Металлическая загрузка Трансферрин, S100A7 и Calprotectin, и подготовка 10x Премиксов

ПРИМЕЧАНИЕ: Как и в подготовке CDM, используйте кислотно-промытое стекло или пластик для приготовления раствора.

  1. Растворите трансферрин человека при 10 мг/мл (125 мл) в исходном буфере (100 мм, 150 мм NaCl, 20 мм NaHCO3,рН 8,4). S100A7 и calprotectin подвешены в буфере, состоящем из 20 мм Трис, 100 мМ NaCl, 10 мМ 2-Mercaptoethanol, и 1 мМ CaCl2, рН 8,0).
    1. Добавьте раствор феррации (100 мМ цитрат натрия, 100 мм NAHCO3,5 мМ FeCl3-6H2O, рН no 8.4) к раствору трансфертина для достижения 30% насыщения железа (например, 75 л раствора феррации подходит для 5 мл трансфертина, если он сделан при 10 мг/мл).
    2. Добавьте snSO4 к S100A7 или calprotectin в соотношении 50% моляров к белку, чтобы создать 25% насыщения (каждая молекула белка имеет два места связывания металла). Можно использовать препараты 100 мкм S100A7 или калпротекин с 50 мкм «NSO4».
    3. В обоих случаях допускайте перемешивание по крайней мере на 1 ч для погрузки металла.
  2. Подготовьте 4 l диализного буфера (40 мм Трис, 150 мм NaCl, 20 мМ NaHCO3,рН 7,4). Разделите это на два отдельных 2 L тома и поместите один на 4 градуса По Цельсию.
  3. Добавьте металлические нагруженные белки в кассету диализа с помощью шприца и диализировать против первого объема буфера в течение 4 ч на RT.
  4. Переместите кассету на второй объем буфера и диализ на ночь при 4 градусах Цельсия. После этих шагов, любые несвязанные металлы должны быть удалены.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы советуем анализ bicinchoninic кислоты для определения концентрации белка после диализа.
  5. Используйте 10-x трансферрин-премикс для использования трансферрина в качестве единственного источника железа.
    1. Подготовьте этот премикс, разбавив 30% человека Fe-трансферрин и бычьей апо-трансферрин (подготовлен на 125 мкм, как описано для человека трансферрин, без шага загрузки железа) до 75 мкм и 30 мкм, соответственно, в PBS. Положительный контрольный примикс заменяет 30% Фе-трансферрин на 75 мкм Fe (NO3)3, а отрицательный контрольный премикс опускает любое добавленное железо, сохраняя только бычьего апо-трансферрин. В оценке роста разбавьте 10 концентратов с 90 зл культуры. Окончательные концентрации 7,5 мкм 30% человека Fe-трансферрин и 3 мКМ бычьего апо-трансферрин.
  6. Используйте модифицированную версию трансферрина 10x-премикса для использования S100A7 или кальпротецина в качестве единственного источника цинка.
    1. Для положительного контрольного премикса, включите 50 км знСО4 в трансферин-премикс. Для отрицательного контроля, включить 50 км TPEN и опустить цинка. Затем возьмите по 10 кЛ каждого из них для каждого хорошо необходимого образца и переместите этот объем в новую трубку. Добавьте к этому вдва меньше объема стерильных PBS. Например, если 10 скважин получат положительный контрольный премикс, возьмите 100 кЛ примикса, переместите его в новую трубку и добавьте 50 Л Л PBS. Сделайте то же самое для отрицательного контроля.
    2. Чтобы сделать S100A7 или calprotectin premix, возьмите 10 зЛ отрицательного контрольного примикса на нужную, перейдите на новую трубку и добавьте половину этого объема 25% n-S100A7 или калпротецина. В оценке роста используйте 15 л примиксов и разбавьте с 85 л культуры. Окончательные концентрации для трансферрин остаются такими же, как и в шаге 8.5, с добавлением 5 мкм из N, TPEN или S100A7/calprotectin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Для характеристики металлочувствительных генов и их генных продуктов была разработана и внедрена специальная определенная среда при отсутствии микроэлементов для роста гонореи Neisseria. В оптимизированном протоколе металлический профиль носителей контролируетс...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Средства роста играют различные роли в микробиологических исследованиях. Специализированные средства массовой информации используются для отбора, обогащения и различных других приложений для многих уникальных типов исследований. Одним из таких применений является индукция металло...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторам нечего декларировать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами NIH R01 AI125421, R01 AI127793 и U19 AI144182. Автор письма хотел бы поблагодарить всех членов лаборатории, которые внесли свой вклад в корректуру и обзор этого метода.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
125 mL sidearm flasksBellco2578-S0030Must be custom ordered
2-MercaptoethanolVWRM131Open in fume hood
3MM PaperGE Health3030-6461Called "filter paper" in text
AgaroseBioloneBIO-41025Powder
Ammonium chlorideSigma-AldrichA9434Powder
BiotinSigma-AldrichB4501Powder
Blotting grade blockerBio-Rad170-6404Nonfat dry milk
Bovine serum albuminRoche3116964001Powder
Bovine transferrinSigma-AldrichT1428Powder
Calcium chloride dihydrateSigma-AldrichC5080Powder
Calcium pantothenateSigma-AldrichC8731Powder
CalprotectinN/AN/AWe are supplied with this by a collaborator
Chelex-100 ResinBio-Rad142-2832Wash with deionized water prior to use
Cotton-tipped sterile swabPuritan25-806Cotton is better than polyester for this application
DeferoxamineSigma-AldrichD9533Powder
D-glucoseSigma-AldrichG8270Powder
Dialysis cassetteThermo66380Presoak in buffer prior to use
Dot blot apparatusSchleicher & Schwell10484138Lock down lid as tightly as possible before sample loading
EthanolKoptecV1016Flammable liquid, store in flammables cabinet
Ferric chlorideSigma-AldrichF7134Irritant, do not inhale
Ferric nitrate nonahydrateSigma-AldrichF1143Irritant, do not inhale
GC medium baseDifco228950Powder, already contains agar
GlycineSigma-AldrichG8898Powder
HEPESFisherL-15694Powder
Human transferrinSigma-AldrichT2030Powder
HypoxanthineSigma-AldrichH9377Powder
Klett colorimeterManostat37012-0000Uses color transmission to assess culture density
L-alanineSigma-AldrichA7627Powder
L-arginineSigma-AldrichA5006Powder
L-asparagine monohydrateSigma-AldrichA8381Powder
L-aspartateSigma-AldrichA9256Powder
L-cysteine hydrochlorideSigma-AldrichC1276Powder
L-cystineSigma-AldrichC8755Powder
L-glutamateSigma-AldrichG1251Powder
L-glutamineSigma-AldrichG3126Powder
L-histidine monohydrochlorideSigma-AldrichH8125Powder
L-isoleucineSigma-AldrichI2752Powder
L-leucineSigma-AldrichL8000Powder
L-lysineSigma-AldrichL5501Powder
L-methionineSigma-AldrichM9625Powder
L-phenylalanineSigma-AldrichP2126Powder
L-prolineSigma-AldrichP0380Powder
L-serineSigma-AldrichS4500Powder
L-threonineSigma-AldrichT8625Powder
L-tryptophanSigma-AldrichT0254Powder
L-tyrosineSigma-AldrichT3754Powder
L-valineSigma-AldrichV0500Powder
Magnesium sulfateSigma-AldrichM7506Powder
MethanolVWRBDH1135-4LPFlammable liquid, store in flammables cabinet
NitrocelluloseGE Health10600002Keep in protective sheath until use
Potassium phosphate dibasicSigma-Aldrich60356Powder
Potassium phosphate monobasicSigma-AldrichP9791Powder
Potassium sulfateSigma-AldrichP0772Powder
Potato starchSigma-AldrichS4251Powder
Reduced glutathioneSigma-AldrichG4251Handle carefully. Can oxidize easily.
S100A7N/AN/AWe are supplied with this by a collaborator
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS5761Powder
Sodium chlorideVWR470302Powder
Sodium citrateFisherS279Powder
Sodium hydroxideAcros Organics383040010Highly hygroscopic
Thiamine hydrochlorideSigma-AldrichT4625Powder
Thiamine pyrophosphateSigma-AldrichC8754Also called cocarboxylase
TPENSigma-AldrichP4413Powder
TrisVWR497Powder
UracilSigma-AldrichU0750Powder
Zinc sulfte heptahydrateSigma-Aldrich204986Irritant, do not inhale

Ссылки

  1. Cornelissen, C. N. Subversion of nutritional immunity by the pathogenic Neisseriae. Pathogens and Disease. 76 (1), (2018).
  2. Ducey, T. F., Carson, M. B., Orvis, J., Stintzi, A. P., Dyer, D. W. Identification of the iron-responsive genes of Neisseria gonorrhoeae by microarray analysis in defined medium. Journal of Bacteriology. 187 (14), 4865-4874 (2005).
  3. Pawlik, M. C., et al. The zinc-responsive regulon of Neisseria meningitidis comprises 17 genes under control of a Zur element. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6594-6603 (2012).
  4. Andreini, C., Banci, L., Bertini, I., Rosato, A. Zinc through the three domains of life. Journal of Proteome Research. 5 (11), 3173-3178 (2006).
  5. Frawley, E. R., Fang, F. C. The ins and outs of bacterial iron metabolism. Molecular Microbiology. 93 (4), 609-616 (2014).
  6. Thompson, S., Chesher, D. Lot-to-Lot Variation. The Clinical Biochemist Reviews. 39 (2), 51-60 (2018).
  7. Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nature Reviews Microbiology. 10 (8), 525-537 (2012).
  8. Lopez, C. A., Skaar, E. P. The Impact of Dietary Transition Metals on Host-Bacterial Interactions. Cell Host Microbe. 23 (6), 737-748 (2018).
  9. Kehl-Fie, T. E., et al. MntABC and MntH contribute to systemic Staphylococcus aureus infection by competing with calprotectin for nutrient manganese. Infection and Immunity. 81 (9), 3395-3405 (2013).
  10. Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (2), 218-224 (2010).
  11. Seib, K. L., et al. Defenses against oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae: a system tailored for a challenging environment. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70 (2), 344-361 (2006).
  12. Wu, H. J., et al. PerR controls Mn-dependent resistance to oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae. Molecular Microbiology. 60 (2), 401-416 (2006).
  13. Rayner, M. H., Suzuki, K. T. A simple and effective method for the removal of trace metal cations from a mammalian culture medium supplemented with 10% fetal calf serum. Biometals. 8 (3), 188-192 (1995).
  14. Kellogg, D. S., Peacock, W. L., Deacon, W. E., Brown, L., Pirkle, D. I. Neisseria Gonorrhoeae. I. Virulence Genetically Linked to Clonal Variation. Journal of Bacteriology. 85, 1274-1279 (1963).
  15. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  16. Heinicke, E., Kumar, U., Munoz, D. G. Quantitative dot-blot assay for proteins using enhanced chemiluminescence. Journal of Immunological Methods. 152 (2), 227-236 (1992).
  17. Jean, S., Juneau, R. A., Criss, A. K., Cornelissen, C. N. Neisseria gonorrhoeae Evades Calprotectin-Mediated Nutritional Immunity and Survives Neutrophil Extracellular Traps by Production of TdfH. Infection and Immunity. 84 (10), 2982-2994 (2016).
  18. Stork, M., et al. Zinc piracy as a mechanism of Neisseria meningitidis for evasion of nutritional immunity. PLoS Pathogens. 9 (10), 1003733(2013).
  19. Maurakis, S., et al. The novel interaction between Neisseria gonorrhoeae TdfJ and human S100A7 allows gonococci to subvert host zinc restriction. PLoS Pathogens. 15 (8), 1007937(2019).
  20. Cornelissen, C. N., Sparling, P. F. Iron piracy: acquisition of transferrin-bound iron by bacterial pathogens. Molecular Microbiology. 14 (5), 843-850 (1994).
  21. Quillin, S. J., Seifert, H. S. Neisseria gonorrhoeae host adaptation and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 16 (4), 226-240 (2018).
  22. Platt, D. J. Carbon dioxide requirement of Neisseria gonorrhoeae growing on a solid medium. Journal of Clinical Microbiology. 4 (2), 129-132 (1976).
  23. Grim, K. P., et al. The Metallophore Staphylopine Enables Staphylococcus aureus To Compete with the Host for Zinc and Overcome Nutritional Immunity. MBio. 8 (5), 01281-01317 (2017).
  24. Helbig, K., Bleuel, C., Krauss, G. J., Nies, D. H. Glutathione and transition-metal homeostasis in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 190 (15), 5431-5438 (2008).
  25. Calmettes, C., et al. The molecular mechanism of Zinc acquisition by the neisserial outer-membrane transporter ZnuD. Nature Communications. 6, 7996(2015).
  26. Hubert, K., et al. ZnuD, a potential candidate for a simple and universal Neisseria meningitidis vaccine. Infection and Immunity. 81 (6), 1915-1927 (2013).
  27. Kumar, P., Sannigrahi, S., Tzeng, Y. L. The Neisseria meningitidis ZnuD zinc receptor contributes to interactions with epithelial cells and supports heme utilization when expressed in Escherichia coli. Infection and Immunity. 80 (2), 657-667 (2012).
  28. Stork, M., et al. An outer membrane receptor of Neisseria meningitidis involved in zinc acquisition with vaccine potential. PLoS Pathogens. 6, 1000969(2010).
  29. Rosadini, C. V., Gawronski, J. D., Raimunda, D., Argüello, J. M., Akerley, B. J. A novel zinc binding system, ZevAB, is critical for survival of nontypeable Haemophilus influenzae in a murine lung infection model. Infection and Immunity. 79 (8), 3366-3376 (2011).
  30. Ammendola, S., et al. High-affinity Zn2+ uptake system ZnuABC is required for bacterial zinc homeostasis in intracellular environments and contributes to the virulence of Salmonella enterica. Infection and Immunity. 75 (12), 5867-5876 (2007).
  31. Gabbianelli, R., et al. Role of ZnuABC and ZinT in Escherichia coli O157:H7 zinc acquisition and interaction with epithelial cells. BMC Microbiology. 11, 36(2011).
  32. Biswas, G. D., Anderson, J. E., Chen, C. J., Cornelissen, C. N., Sparling, P. F. Identification and functional characterization of the Neisseria gonorrhoeae lbpB gene product. Infection and Immunity. 67 (1), 455-459 (1999).
  33. Biswas, G. D., Sparling, P. F. Characterization of lbpA, the structural gene for a lactoferrin receptor in Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 63 (8), 2958-2967 (1995).
  34. Chen, C. J., Sparling, P. F., Lewis, L. A., Dyer, D. W., Elkins, C. Identification and purification of a hemoglobin-binding outer membrane protein from Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 64 (12), 5008-5014 (1996).
  35. Wong, C. T., et al. Structural analysis of haemoglobin binding by HpuA from the Neisseriaceae family. Nature Communications. 6, 10172(2015).
  36. Carson, S. D., Klebba, P. E., Newton, S. M., Sparling, P. F. Ferric enterobactin binding and utilization by Neisseria gonorrhoeae. Journal of Bacteriology. 181 (9), 2895-2901 (1999).
  37. Tseng, H. J., Srikhanta, Y., McEwan, A. G., Jennings, M. P. Accumulation of manganese in Neisseria gonorrhoeae correlates with resistance to oxidative killing by superoxide anion and is independent of superoxide dismutase activity. Molecular Microbiology. 40 (5), 1175-1186 (2001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

157Neisseria gonorrhoeae

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены