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  • Déclarations de divulgation
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Résumé

Nous décrivons ici une méthode pour la croissance de Neisseria gonorrhoeae dans le milieu liquide métal-restreint pour faciliter l’expression des gènes pour l’apaisement de métal. Nous dénoncions également des expériences en aval pour caractériser le phénotype des gonocoques cultivés dans ces conditions. Ces méthodes peuvent être adaptées pour être adaptées à la caractérisation des gènes sensibles au métal chez d’autres bactéries.

Résumé

Les métaux traces tels que le fer et le zinc sont des nutriments vitaux connus pour jouer un rôle clé dans les processus procaryotiques, y compris la régulation des gènes, la catalyse et la structure des protéines. La séquestration du métal par les hôtes conduit souvent à une limitation du métal pour la bactérie. Cette limitation induit l’expression des gènes bactériens dont les produits protéiques permettent aux bactéries de surmonter leur environnement métallique limité. La caractérisation de ces gènes est un défi. Les bactéries doivent être cultivées dans des médias méticuleusement préparés qui permettent un accès suffisant aux métaux nutritionnels pour permettre la croissance bactérienne tout en maintenant un profil métallique propice à la réalisation de l’expression des gènes susmentionnés. En tant que tel, un équilibre délicat doit être établi pour les concentrations de ces métaux. La culture d’un organisme exigeant sur le plan nutritionnel tel que Neisseria gonorrhoeae, qui a évolué pour survivre uniquement dans l’hôte humain, ajoute un niveau supplémentaire de complexité. Ici, nous décrivons la préparation d’un milieu métallique défini limité suffisant pour permettre la croissance gonococcique et l’expression du gène désirée. Cette méthode permet à l’investigateur de chélater le fer et le zinc à partir de sources indésirables tout en complétant les médias avec des sources définies de fer ou de zinc, dont la préparation est également décrite. Enfin, nous présentons trois expériences qui utilisent ce média pour aider à caractériser les produits protéiques des gènes gonococciques régulés par les métaux.

Introduction

Neisseria gonorrhoeae provoque l’infection sexuellement transmissible commune gonorrhée. Pendant l’infection, Neisseria pathogène exprimer un répertoire de gènes métal-sensibles qui permettent aux bactéries de surmonter les efforts de restriction de métal par l’hôte humain1,2,3. Les métaux traces comme le fer et le zinc jouent un rôle clé dans de nombreux processus cellulaires, tels que la liaison aux enzymes dans les sites catalytiques, la participation aux réactions redox, et comme facteurs structurels dans diverses protéines4,5. Dans des conditions de métal limité, les loci métal-sensibles sont déprimés et leurs protéines résultantes peuvent aider à l’acquisition de ces éléments nutritifs. La caractérisation de ces gènes et protéines représente un défi technique unique pour le chercheur. Les ions métalliques doivent être retenus contre les bactéries afin d’induire la transcription de ces gènes à partir de leurs loci indigènes, mais la chélation efficace de ces ions à partir de médias chargés de métal peut être difficile à optimiser. Les différents profils métalliques de l’eau de source et la variation inhérente du lot au lot6 des ingrédients en poudre signifient que la quantité de chélateur nécessaire pour enlever un métal spécifique d’un milieu riche variera d’un endroit à l’autre, les vendeurs d’ingrédients, et même au fil du temps dans un seul laboratoire à mesure que l’inventaire chimique sera remplacé.

Pour contourner ce défi, nous décrivons la préparation d’un milieu défini qui est traité avec de la résine Chelex-100 pendant la préparation pour enlever les métaux traces de la solution. Ce milieu est suffisamment dense en nutriments pour permettre la croissance du gonocoque, qui est difficile à culture en dehors de l’hôte humain, et permet à l’investigateur d’introduire un profil métallique spécifique en additionnant leurs propres sources et concentrations définies de Métaux. La méthode d’addition contrôlée des métaux désirés au milieu appauvri augmente la consistance expérimentale et permet des expériences robustes et reproductibles indépendamment de facteurs tels que la source d’eau et le nombre de lot séchimique. En outre, ce support peut être déployé comme un liquide ou solide avec seulement des modifications mineures, ce qui le rend assez polyvalent.

Afin de démontrer l’utilité de ce milieu, nous énonçons un protocole pour son utilisation pour la croissance gonococcique et déécrivons trois expériences réussies pour caractériser les gènes de Neisseria sensibles aux métaux. Tout d’abord, nous préparons des lysates gonococciques à cellules entières à partir de cultures appauvries ou complétées par le métal et démontrons des niveaux variables de production de protéines à partir de loci sensibles au métal. Nous cifrayons alors un assay de croissance zinc-restreint dans lequel la croissance gonococcique est commandée par la supplémentation des sources spécifiques et utilisables de zinc. Enfin, nous montrons des essais de liaison qui démontrent des cellules gonococciques entières exprimant des récepteurs de surface sensibles au métal se liant à leurs ligands contenant du métal respectifs. La présentation réussie de surface de ces récepteurs exige la croissance dans le milieu métal-appauvri.

Le protocole actuel a été optimisé spécifiquement pour Neisseria gonorrhoeae, mais de nombreux autres agents pathogènes bactériens utilisent des stratégies d’acquisition de métaux pendant l’infection7, de sorte que ce protocole peut être adapté pour l’étude de l’homéostasie métallique dans d’autres bactéries. L’optimisation de ce média et de ces protocoles expérimentaux pour une utilisation dans d’autres bactéries nécessitera probablement une légère modification des concentrations de chélateurs métalliques et/ou du temps de traitement avec Chelex-100, car d’autres bactéries peuvent avoir des besoins métalliques légèrement différents de ceux du gonocoque. Le fer et le zinc sont les principaux métaux préoccupants pour les enquêtes décrites, mais d’autres métaux (p. ex., le manganèse) ont été démontrés comme critiques pour les bactéries, y compris Neisseria8,9,10,11,12. En outre, des méthodes similaires ont été décrites pour les caractérisations métalliques dans le travail de culture cellulaire eucaryotique, qui peut également être considérée. 13 (en)

Protocole

1. Préparation de solutions d’actions à moyen défini (MDP) traitées par Chelex

  1. Stock solution I
    1. Combiner NaCl (233,8 g), K2SO4 (40,0 g), NH4Cl (8,8 g), K2HPO4 (13,9 g) et KH2PO4 (10,9 g) dans de l’eau déionisée à un volume final de 1 L.
    2. Filtrer stériliser la solution et aliquot en tubes coniques de 50 ml.
    3. Conserver à -20 oC.
  2. Stock solution II
    1. Mélanger la thiamine HCl (0,2 g), le pyrophosphate-Cl de thiamine (0,05 g), le pantothénate de calcium (0,19 g) et la biotine (0,3 g) dans 50 % (vol/vol) de l’éthanol jusqu’à un volume final de 1 L.
    2. Aliquot en tubes coniques de 50 ml et conserver à -20 oC.
  3. Stock solution III
    1. Combiner L-aspartate (4,0 g), L-glutamate (10,4 g), L-arginine (1,2 g), glycine (0,2 g), L-serine (0,4 g), L-leucine (0,72 g), L-isoleucine (0,24 g), L-valine (0,48 g), L-tyrosine (0,56 g), L-proline (0,4 g), L-tryptophane (0,64 g), L-tyrosine (0,56 g), L-proline (0,4 g), L-tryptophane (0,64 g), L-threonine (0,4 g), L-phénylalanine (0,2 g), L-asparagine-H2O (0,2 g), L-glutamine (0,4 g), L-histidine-HCl (0,2 g), L-méthionine (0,12 g), L-alanine (0,8 g), L-lysine (0,4 g) et glutathion réduit (0,36 g) dans 500 mL d’eau déionisée.
    2. Dissoudre la L-cystéine (0,44 g) et la L-cystine (0,28 g) dans un volume minimal (1 ml) de 1 M HCl et ajouter à la solution d’acide aminé ci-dessus.
    3. Ajuster le pH de la solution avec 10 N NaOH jusqu’à ce que toutes les particules soient dissoutes. Le pH final sera de 10,0 à 11,0.
    4. Porter le volume final à 1 L avec de l’eau déionisée.
    5. Filtrer stériliser la solution et aliquot en 250 ml de volumes.
    6. Conserver à -20 oC.
  4. Stock solution IV
    1. Dissoudre le glucose (200 g) dans l’eau déionisée à un volume final de 1 L.
      REMARQUE: La solution peut devoir être chauffée pour dissoudre le glucose.
    2. Filtrer la stérilisation et aliquot la solution dans des tubes coniques de 50 ml.
    3. Conserver à -20 oC.
  5. Stock solution V
    1. Mélanger l’hypoxanthine (5,0 g), l’uracil (5,0 g) et le NaOH (4,0 g) dans de l’eau déionisée jusqu’à un volume final de 1 L.
    2. Filtrer la stérilisation et l’aliquot dans des tubes coniques de 50 ml.
    3. Conserver à -20 oC.
  6. Solution VI
    1. Préparer une solution de 1 M CaCl2-2H2O (147 g/L) dans de l’eau déionisée. Filtrer la stérilisation et la conserver à température ambiante (RT).
  7. Stock solution VII
    1. Préparer une solution de 1 M anhydre MgSO4 dans de l’eau déionisée. Filtrer stériliser et stocker à RT.
  8. Stock solution VIII
    1. Préparer une solution de 1 M NaHCO3 dans l’eau déionisée. Filtrer stériliser et stocker à RT.

2. Préparation de 4x concentré stérile et 1x CDM

REMARQUE : Cette procédure doit être exécutée dans la verrerie stérile ou en plastique traitée à l’acide pour empêcher le lixiviation des métaux dans les solutions.

  1. Combinez les solutions de stock I (50 mL), II (20 mL), III (250 mL), IV (50 ml) et V (20 ml) avec 20,0 g de HEPES et remuer pour mélanger.
  2. Ajuster le pH à 7,4, puis porter le volume final à 500 ml avec de l’eau déionisée.
  3. Laver la résine Chelex-100 dans 1 L dionized eau pour enlever les agents de conservation avant de l’ajouter au concentré stérile 4x. Pour ce faire, en ajoutant 50 g de résine à 1 L d’eau déionisée et en remuant pendant au moins 1 h. Retirez l’eau par filtration sous vide et utilisez cette résine lavée pour l’étape 2.4.
  4. Ajouter 50 g de résine et remuer lentement pendant exactement 90 min.
  5. Retirer la résine par stérilisation du filtre et conserver le concentré stérile 4x à 4 oC.
  6. Pour préparer une concentration de 1x de MDP, diluer d’abord le concentré 4x avec de l’eau déionisée stérile, puis ajouter la solution VI (125 L par 500 mL de solution 1x), la solution VII (535 l par 500 mL) et la solution VIII (10 ml par 500 ml).
    REMARQUE : Bien que toutes les solutions de stock aient déjà été stérilisées, il est recommandé de filtrer la stérilisation de la solution 1x à nouveau après la préparation.

3. Préparation des plaques MDP

REMARQUE: La recette ci-dessous fait 1 L médias pour les assiettes, mais il est préférable de les préparer en plus petits volumes. Tout s’abaisse proportionnellement.

  1. Agarose lavée
    1. Dissoudre 50 g d’agarose dans 1 L d’eau déionisée, en remuant pendant 1 h.
    2. Transférer la solution sur une bouteille de centrifugeuse et une centrifugeuse à 1 200 x g pendant 15 min à RT. Verser soigneusement le supernatant et jeter.
    3. Ajouter suffisamment d’eau déionisée pour suspendre à nouveau le granule d’agarose, puis transférer dans un flacon de 1 L. Porter à un volume final de 1 L avec de l’eau déionisée, puis remuer et centrifuger comme à l’étape 3.1.2. Jetez le supernatant.
    4. Ajouter suffisamment d’éthanol à 100 % pour suspendre à nouveau le granule, puis transférer dans un nouveau flacon de 1 L. Porter à un volume final de 1 L avec de l’éthanol. Remuer et centrifugeuse comme à l’étape 3.1.2.
    5. Répétez l’étape 3.1.4.
    6. Ajouter le méthanol à la granule d’agarose pour le resuspendre, puis transférer dans un flacon de 1 L. Porter à un volume final de 1 L avec du méthanol. Remuer et centrifugeuse comme à l’étape 3.1.2.
    7. Répétez l’étape 3.1.6.
    8. Transférer l’agarose lavée sur un plateau recouvert de papier d’aluminium et laisser sécher dans une hotte à fumée. Une fois sec, transférer dans un contenant sans métal pour un stockage à long terme.
  2. Ajouter 10 g d’agarose lavée et 5 g d’amidon de pomme de terre à 750 ml d’eau déionisée.
  3. Autoclave pendant 30 min à 121 oC, 100 kPa au-dessus de la pression atmosphérique.
  4. Laisser refroidir les supports à 65 oC, puis ajouter 250 ml de 4X MDC, 250 oL de solution VI, 1,07 ml de solution VII et 20 ml de solution VIII.
  5. Si désiré, ajouter les métaux de choix avant de verser les assiettes. L’ajout de chélateurs n’est pas nécessaire pour maintenir des conditions sans métal.
  6. Verser dans la vaisselle Petri et laisser se solidifier.

4. Croissance limitée en métaux de Neisseria gonorrhoeae

REMARQUE : Pour la plupart des applications, il n’est pas nécessaire de stresser les bactéries avant l’inoculation du MDP. L’étape initiale de doublement du MDP et la dilution subséquente sont suffisantes pour épuiser les gonocoques de leurs réserves internes de fer et de zinc. En tant que tel, les deux premières étapes de la procédure suivante sont effectuées à l’aide de plaques d’agar fabriqués à partir de base moyenne GC qui ont été complétés par le supplément de Kellogg I14 et 12,5 M Fe (NO3)3. Si l’on désire un stress métallique précoce, nous recommandons de préparer des plaques de base moyennes GC sans Fe (NO3)3 et avec 5 M TPEN (N,N',N',N',netrakis (2-pyridylmethyl) ethylenediamine) pour la chélation de zinc ou 10 M deferoxamine pour la chélation de fer. Toute l’incubation est menée à 37 oC avec 5 % de CO2.

  1. Deux jours avant l’expérience, le jour -2, les gonocoques de stries des stocks de congélateur sur les plaques moyennes GC et incuber pendant pas plus de 24 h.
  2. Le jour -1, stries colonies simples sur des plaques fraîches GC moyen. Essayez de le faire 14-16 h avant l’expérience de croissance.
  3. Le jour de l’expérience, ajouter 5 à 10 mL 1x MDP à un flacon d’arme de poing déconcerté de 125 ml d’acide(figure supplémentaire 1) et l’utiliser pour vider un colorimètre Klett.
  4. Utilisez un écouvillon stérile à pointe de coton pour inoculer le MDP provenant de colonies saines et simples. Visez 20 unités Klett.
    REMARQUE : Si un colorimètre Klett n’est pas disponible, un spectrophotomètre convient également. Il n’y a pas de formule de conversion universelle pour les unités Klett à OD, mais un guide approximatif est disponible (https://support.hunterlab.com/hc/en-us/articles/214490283-Klett-Color-Scales).
  5. Incuber en secouant à 250 tr/min jusqu’à ce qu’environ un doublement de masse (40 unités Klett). Cela devrait prendre entre 1 h et 2 h.
  6. À ce stade, les cultures sont de retour dilué par l’ajout d’un volume suffisant de MDP pour atteindre la moitié de la densité de culture initiale (par exemple, si 5 mL de culture est passé de 20 à 40 unités Klett, 15 mL de MDP le ramènera à 10 unités Klett) et la croissance se poursuivra comme à l’étape 4.5. La quantité spécifique de dilution du dos, de traitements métalliques, etc. dépend des applications en aval. Nous donnons trois exemples ci-dessous (sections 5, 6 ou 7).

5. Analyse occidentale des produits géniques sensibles au métal

  1. À partir de l’étape 4.6, le dos dilue les cultures avec trois volumes de MDP (p. ex., 15 mL de MDP si le début avec 5 mL). À ce stade, ajouter des traitements métalliques si désiré.
    1. Les gènes de détection du fer peuvent être déprimés avec 12,5 M Fe (NO3)3. Les gènes sensibles au zinc peuvent être déprimés avec 10 M ZnSO4.
    2. Le stress supplémentaire en fer ou en zinc n’est pas nécessaire, car les médias sont déjà épuisés, de sorte que des gènes réactifs seront déjà exprimés. Si d’autres stress sont souhaités, nous ne recommandons pas plus de 1 à 2 millions de déferoxamine ou de TPEN, car un stress excessif empêchera les cultures de croître.
  2. Cultivez des cultures comme dans l’étape 4.5 pour 4 h et enregistrez la densité cellulaire finale des échantillons. Les cultures moins résistantes aux métaux aciduront à des densités finales plus élevées.
  3. Normaliser les cultures à une densité appropriée et préparer des lysates.
    1. Normaliser les lysates à cellules entières à une densité équivalente à 100 unités Klett dans 1 ml de culture. Pour ce faire, divisez 100 par la densité de l’unité Klett de votre échantillon. Le nombre que vous obtenez est le volume, en mL, de la culture qui sera utilisé pour faire le granule de cellules.
  4. Suivez les procédures standard de SDS-PAGE et de ballonnement occidental15 pour sonder les protéines d’intérêt.

6. Essais de croissance limités dans le métal

REMARQUE : Ces essais décrivent les prémélanges de croissance préfabriqués. La préparation de ces mélanges est décrite à la section 8.

  1. Pendant le doublement de masse dans l’étape 4.5, pretreat les puits d’une microplaque de puits 96 avec 10x prémélanges. En outre, désignez trois puits pour servir de blancs. À ces puits, ajouter 10 oL de prémélange 10x et 90 oL de MDP.
  2. Une fois que les cultures dans les flacons d’arme de poing ont doublé, ajouter 100 L de chaque culture à un puits inutilisé dans la microplaque et mesurer la densité optique à 600 nm (OD600). Cela peut être fait avec des cuvettes dans un spectrophotomètre, mais avec un plus grand nombre de souches dans un essai cela peut devenir lourd et n’est généralement pas conseillé à moins que votre spectrophotomètre peut mesurer directement à partir du bras latéral flasque (Figure supplémentaire 2).
    1. Tout en mesurant l’OD, placez les flacons dans l’incubateur pour s’assurer que les gonocoques restent viables.
  3. Calculez la quantité correcte de dilution nécessaire pour amener les cultures àLO 600 à 0,02. Les prémélanges 10x ont un effet négligeable sur l’OD et peuvent être omis du calcul.
  4. Diluer les cultures avec le MDP dans de petits tubes de culture et ajouter suffisamment de volume pour diluer les prémélanges 10x à 1x dans l’assiette. Si un chauffe-assiette est disponible, gardez la plaque à 37 oC pendant le travail.
  5. Incuber la plaque pendant 8 à 12 h en secouant dans un lecteur de plaque, en prenant des mesures OD600 à intervalles désirés.

7. Détection de la liaison Ligand par les transporteurs métalliques de membrane externe

  1. Traiter les cultures comme vous le souhaitez à l’étape 5.1, puis couver en secouant pendant 4 h.
  2. Peu de temps avant la marque de 4 h, couper trois morceaux de papier filtre et un morceau de nitrocellulose à la taille approximative nécessaire pour s’adapter à un appareil à points tache (Figure supplémentaire 3). Présapez la nitrocellulose dans de l’eau déionisée, puis assemblez l’appareil avec du papier filtre sous la nitrocellulose.
  3. À 4 h, enregistrez les densités cellulaires et normalisez à une densité finale appropriée. Il est recommandé d’utiliser 10 % de la densité utilisée pour la préparation des lysates cellulaires à l’étape 5. Par exemple, si vous utilisez 100 KU en 1 ml pour les lysates, cela signifie 10 KU en 1 ml pour ces taches. Le calcul est par ailleurs le même que décrit dans 5.3.1, et les cultures sont ajoutées directement à la nitrocellulose dans les volumes calculés plutôt que transformés en lysates.
  4. Les cultures de cellules pipet sur la nitrocellulose et laisser suffisamment de temps pour le papier filtre pour absorber tout le liquide.
  5. Démonter l’appareil, laisser sécher la tache et bloquer la membrane de nitrocellulose pendant 1 h dans 5 % d’albumine bovine bovine ou de lait non gras (w/v) dans la saline tamponnée Tris.
  6. Remonter l’appareil à points, en remplaçant le papier filtre par du film de paraffine pour créer un joint étanche sous la nitrocellulose.
  7. Diluer le ligand métallique d’intérêt à 0,2 M dans les cellules de bloqueur et de sonde pendant 1 h.
  8. Siphonner le liquide avec un aspirateur, laver la tache, puis suivre les procédures immunologiques standard pour développer le signal16. Les étapes de lavage peuvent être faites dans ou hors de l’appareil.

8. Chargement métallique de Transferin, S100A7, et Calprotectin, et préparation de 10x Premixes

REMARQUE : Comme pour la préparation du MDP, utilisez du verre lavé à l’acide ou du plastique pour la préparation des solutions.

  1. Dissoudre le transfert humain à 10 mg/mL (125 m) dans le tampon initial (100 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 mM NaHCO3, pH - 8,4). S100A7 et calprotectin sont suspendus dans un tampon composé de 20 mM Tris, 100 mM NaCl, 10 mM 2-Mercaptoethanol, et 1 mM CaCl2, pH - 8,0).
    1. Ajouter la solution de ferration (100 mM de citrate de sodium, 100 mM NaHCO3, 5 mM FeCl3-6H2O, pH - 8,4) à la solution de transferrine pour atteindre une saturation en fer de 30 % (p. ex., 75 l de solution de ferration convient à la transferrine de 5 ml si elle est fabriquée à 10 mg/mL).
    2. Ajouter ZnSO4 à S100A7 ou calprotectine à un rapport de 50% molaire à la protéine pour créer 25% de saturation (chaque molécule de protéine a deux sites de liaison métallique). Les préparations de 100 M S100A7 ou calprotectine avec 50 M ZnSO4 peuvent être utilisées.
    3. Dans les deux cas, laisser le mélange de bout en bout pendant au moins 1 h pour le chargement du métal.
  2. Préparer 4 L de tampon de dialyse (40 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 mM NaHCO3, pH 7,4). Divisez-le en deux volumes distincts de 2 L et placez-le à 4 oC.
  3. Ajouter les protéines chargées en métal à une cassette de dialyse à l’aide d’une seringue et dialyser contre le premier volume tampon pendant 4 h à RT.
  4. Déplacez la cassette vers le deuxième volume tampon et dialyser pendant la nuit à 4 oC. Après ces étapes, tous les métaux non liés doivent être enlevés.
    REMARQUE : Nous conseillons un test d’acide bicinchoninique pour déterminer des concentrations de protéine après dialyse.
  5. Utilisez un prémélange de transferrine 10x pour l’utilisation de la transferrine comme source de fer seule.
    1. Préparer ce prémélange en diluant 30% de Fe-transferin humain et d’apo-transferin bovin (préparé à 125 M comme décrit pour le transferrine humain, sans l’étape de chargement du fer) à 75 et 30 M, respectivement, en PBS. Un prémélange de contrôle positif remplace 30 % de Fe-transferin par 75 M Fe (NO3)3, et un prémix de contrôle négatif omet tout fer ajouté, ne conservant que l’apo-transferin bovin. Dans l’exemple de croissance, diluer 10 l de ces concentrés avec 90 l de culture. Les concentrations finales sont de 7,5 M M 30% de Fe-transferin humain et de 3 millions d’apo-transferin bovin.
  6. Utilisez une version modifiée du prémélange transferrine 10x pour l’utilisation de S100A7 ou de calprotectine comme seule source de zinc.
    1. Pour un prémélange de contrôle positif, incorporer 50 M ZnSO4 dans le prémix transferin. Pour un contrôle négatif, incorporer 50 M TPEN et omettre le zinc. Ensuite, prenez 10 L de chacun de ces échantillons pour chaque échantillon bien nécessaire, et déplacez ce volume vers un nouveau tube. Ajoutez à cela la moitié autant de volume de PBS stérile. Par exemple, si 10 puits recevront le prémélange de contrôle positif, prenez 100 l de prémélange, déplacez-le vers un nouveau tube et ajoutez 50 L de PBS. Faites de même pour le contrôle négatif.
    2. Pour faire le prémélange S100A7 ou calprotectin, prendre 10 l de la commande négative prémix par bien nécessaire, passer à un nouveau tube, et ajouter la moitié de ce volume de la 25% Zn-S100A7 ou calprotectin. Dans l’exemple de croissance, utilisez 15 l de prémélange et diluez avec 85 l de culture. Les concentrations finales pour les transferins restent les mêmes que dans l’étape 8.5, avec un ajout de 5 m de Zn, TPEN, ou S100A7/calprotectin.

Résultats

Un milieu spécifique défini en l’absence de métaux traces pour la croissance de Neisseria gonorrhoeae a été développé et mis en œuvre pour la caractérisation des gènes sensibles aux métaux et de leurs produits géniques. Dans le protocole optimisé, le profil métallique des médias est contrôlé en ajoutant des métaux à la discrétion de l’enquêteur, plutôt que par la chélation titrée d’une cible métallique, ce qui permet un contrôle et une consistance ...

Discussion

Les médias de croissance joue un rôle varié dans la recherche microbiologique. Les médias spécialisés sont utilisés pour la sélection, l’enrichissement et diverses autres applications pour de nombreux types d’études uniques. Une telle application est l’induction de gènes métal-sensibles, qui est typiquement accompli par l’addition d’un chélateur spécifique qui cible un ion métallique particulier. Cette méthode est limitée, car la quantité de chélation nécessaire pour divers métaux traces est...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à déclarer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par les subventions des NIH R01 AI125421, R01 AI127793 et U19 AI144182. L’auteur de l’écriture tient à remercier tous les membres du laboratoire qui ont contribué à la relecture et à l’examen de cette méthode.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
125 mL sidearm flasksBellco2578-S0030Must be custom ordered
2-MercaptoethanolVWRM131Open in fume hood
3MM PaperGE Health3030-6461Called "filter paper" in text
AgaroseBioloneBIO-41025Powder
Ammonium chlorideSigma-AldrichA9434Powder
BiotinSigma-AldrichB4501Powder
Blotting grade blockerBio-Rad170-6404Nonfat dry milk
Bovine serum albuminRoche3116964001Powder
Bovine transferrinSigma-AldrichT1428Powder
Calcium chloride dihydrateSigma-AldrichC5080Powder
Calcium pantothenateSigma-AldrichC8731Powder
CalprotectinN/AN/AWe are supplied with this by a collaborator
Chelex-100 ResinBio-Rad142-2832Wash with deionized water prior to use
Cotton-tipped sterile swabPuritan25-806Cotton is better than polyester for this application
DeferoxamineSigma-AldrichD9533Powder
D-glucoseSigma-AldrichG8270Powder
Dialysis cassetteThermo66380Presoak in buffer prior to use
Dot blot apparatusSchleicher & Schwell10484138Lock down lid as tightly as possible before sample loading
EthanolKoptecV1016Flammable liquid, store in flammables cabinet
Ferric chlorideSigma-AldrichF7134Irritant, do not inhale
Ferric nitrate nonahydrateSigma-AldrichF1143Irritant, do not inhale
GC medium baseDifco228950Powder, already contains agar
GlycineSigma-AldrichG8898Powder
HEPESFisherL-15694Powder
Human transferrinSigma-AldrichT2030Powder
HypoxanthineSigma-AldrichH9377Powder
Klett colorimeterManostat37012-0000Uses color transmission to assess culture density
L-alanineSigma-AldrichA7627Powder
L-arginineSigma-AldrichA5006Powder
L-asparagine monohydrateSigma-AldrichA8381Powder
L-aspartateSigma-AldrichA9256Powder
L-cysteine hydrochlorideSigma-AldrichC1276Powder
L-cystineSigma-AldrichC8755Powder
L-glutamateSigma-AldrichG1251Powder
L-glutamineSigma-AldrichG3126Powder
L-histidine monohydrochlorideSigma-AldrichH8125Powder
L-isoleucineSigma-AldrichI2752Powder
L-leucineSigma-AldrichL8000Powder
L-lysineSigma-AldrichL5501Powder
L-methionineSigma-AldrichM9625Powder
L-phenylalanineSigma-AldrichP2126Powder
L-prolineSigma-AldrichP0380Powder
L-serineSigma-AldrichS4500Powder
L-threonineSigma-AldrichT8625Powder
L-tryptophanSigma-AldrichT0254Powder
L-tyrosineSigma-AldrichT3754Powder
L-valineSigma-AldrichV0500Powder
Magnesium sulfateSigma-AldrichM7506Powder
MethanolVWRBDH1135-4LPFlammable liquid, store in flammables cabinet
NitrocelluloseGE Health10600002Keep in protective sheath until use
Potassium phosphate dibasicSigma-Aldrich60356Powder
Potassium phosphate monobasicSigma-AldrichP9791Powder
Potassium sulfateSigma-AldrichP0772Powder
Potato starchSigma-AldrichS4251Powder
Reduced glutathioneSigma-AldrichG4251Handle carefully. Can oxidize easily.
S100A7N/AN/AWe are supplied with this by a collaborator
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS5761Powder
Sodium chlorideVWR470302Powder
Sodium citrateFisherS279Powder
Sodium hydroxideAcros Organics383040010Highly hygroscopic
Thiamine hydrochlorideSigma-AldrichT4625Powder
Thiamine pyrophosphateSigma-AldrichC8754Also called cocarboxylase
TPENSigma-AldrichP4413Powder
TrisVWR497Powder
UracilSigma-AldrichU0750Powder
Zinc sulfte heptahydrateSigma-Aldrich204986Irritant, do not inhale

Références

  1. Cornelissen, C. N. Subversion of nutritional immunity by the pathogenic Neisseriae. Pathogens and Disease. 76 (1), (2018).
  2. Ducey, T. F., Carson, M. B., Orvis, J., Stintzi, A. P., Dyer, D. W. Identification of the iron-responsive genes of Neisseria gonorrhoeae by microarray analysis in defined medium. Journal of Bacteriology. 187 (14), 4865-4874 (2005).
  3. Pawlik, M. C., et al. The zinc-responsive regulon of Neisseria meningitidis comprises 17 genes under control of a Zur element. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6594-6603 (2012).
  4. Andreini, C., Banci, L., Bertini, I., Rosato, A. Zinc through the three domains of life. Journal of Proteome Research. 5 (11), 3173-3178 (2006).
  5. Frawley, E. R., Fang, F. C. The ins and outs of bacterial iron metabolism. Molecular Microbiology. 93 (4), 609-616 (2014).
  6. Thompson, S., Chesher, D. Lot-to-Lot Variation. The Clinical Biochemist Reviews. 39 (2), 51-60 (2018).
  7. Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nature Reviews Microbiology. 10 (8), 525-537 (2012).
  8. Lopez, C. A., Skaar, E. P. The Impact of Dietary Transition Metals on Host-Bacterial Interactions. Cell Host Microbe. 23 (6), 737-748 (2018).
  9. Kehl-Fie, T. E., et al. MntABC and MntH contribute to systemic Staphylococcus aureus infection by competing with calprotectin for nutrient manganese. Infection and Immunity. 81 (9), 3395-3405 (2013).
  10. Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (2), 218-224 (2010).
  11. Seib, K. L., et al. Defenses against oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae: a system tailored for a challenging environment. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70 (2), 344-361 (2006).
  12. Wu, H. J., et al. PerR controls Mn-dependent resistance to oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae. Molecular Microbiology. 60 (2), 401-416 (2006).
  13. Rayner, M. H., Suzuki, K. T. A simple and effective method for the removal of trace metal cations from a mammalian culture medium supplemented with 10% fetal calf serum. Biometals. 8 (3), 188-192 (1995).
  14. Kellogg, D. S., Peacock, W. L., Deacon, W. E., Brown, L., Pirkle, D. I. Neisseria Gonorrhoeae. I. Virulence Genetically Linked to Clonal Variation. Journal of Bacteriology. 85, 1274-1279 (1963).
  15. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  16. Heinicke, E., Kumar, U., Munoz, D. G. Quantitative dot-blot assay for proteins using enhanced chemiluminescence. Journal of Immunological Methods. 152 (2), 227-236 (1992).
  17. Jean, S., Juneau, R. A., Criss, A. K., Cornelissen, C. N. Neisseria gonorrhoeae Evades Calprotectin-Mediated Nutritional Immunity and Survives Neutrophil Extracellular Traps by Production of TdfH. Infection and Immunity. 84 (10), 2982-2994 (2016).
  18. Stork, M., et al. Zinc piracy as a mechanism of Neisseria meningitidis for evasion of nutritional immunity. PLoS Pathogens. 9 (10), 1003733 (2013).
  19. Maurakis, S., et al. The novel interaction between Neisseria gonorrhoeae TdfJ and human S100A7 allows gonococci to subvert host zinc restriction. PLoS Pathogens. 15 (8), 1007937 (2019).
  20. Cornelissen, C. N., Sparling, P. F. Iron piracy: acquisition of transferrin-bound iron by bacterial pathogens. Molecular Microbiology. 14 (5), 843-850 (1994).
  21. Quillin, S. J., Seifert, H. S. Neisseria gonorrhoeae host adaptation and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 16 (4), 226-240 (2018).
  22. Platt, D. J. Carbon dioxide requirement of Neisseria gonorrhoeae growing on a solid medium. Journal of Clinical Microbiology. 4 (2), 129-132 (1976).
  23. Grim, K. P., et al. The Metallophore Staphylopine Enables Staphylococcus aureus To Compete with the Host for Zinc and Overcome Nutritional Immunity. MBio. 8 (5), 01281-01317 (2017).
  24. Helbig, K., Bleuel, C., Krauss, G. J., Nies, D. H. Glutathione and transition-metal homeostasis in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 190 (15), 5431-5438 (2008).
  25. Calmettes, C., et al. The molecular mechanism of Zinc acquisition by the neisserial outer-membrane transporter ZnuD. Nature Communications. 6, 7996 (2015).
  26. Hubert, K., et al. ZnuD, a potential candidate for a simple and universal Neisseria meningitidis vaccine. Infection and Immunity. 81 (6), 1915-1927 (2013).
  27. Kumar, P., Sannigrahi, S., Tzeng, Y. L. The Neisseria meningitidis ZnuD zinc receptor contributes to interactions with epithelial cells and supports heme utilization when expressed in Escherichia coli. Infection and Immunity. 80 (2), 657-667 (2012).
  28. Stork, M., et al. An outer membrane receptor of Neisseria meningitidis involved in zinc acquisition with vaccine potential. PLoS Pathogens. 6, 1000969 (2010).
  29. Rosadini, C. V., Gawronski, J. D., Raimunda, D., Argüello, J. M., Akerley, B. J. A novel zinc binding system, ZevAB, is critical for survival of nontypeable Haemophilus influenzae in a murine lung infection model. Infection and Immunity. 79 (8), 3366-3376 (2011).
  30. Ammendola, S., et al. High-affinity Zn2+ uptake system ZnuABC is required for bacterial zinc homeostasis in intracellular environments and contributes to the virulence of Salmonella enterica. Infection and Immunity. 75 (12), 5867-5876 (2007).
  31. Gabbianelli, R., et al. Role of ZnuABC and ZinT in Escherichia coli O157:H7 zinc acquisition and interaction with epithelial cells. BMC Microbiology. 11, 36 (2011).
  32. Biswas, G. D., Anderson, J. E., Chen, C. J., Cornelissen, C. N., Sparling, P. F. Identification and functional characterization of the Neisseria gonorrhoeae lbpB gene product. Infection and Immunity. 67 (1), 455-459 (1999).
  33. Biswas, G. D., Sparling, P. F. Characterization of lbpA, the structural gene for a lactoferrin receptor in Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 63 (8), 2958-2967 (1995).
  34. Chen, C. J., Sparling, P. F., Lewis, L. A., Dyer, D. W., Elkins, C. Identification and purification of a hemoglobin-binding outer membrane protein from Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 64 (12), 5008-5014 (1996).
  35. Wong, C. T., et al. Structural analysis of haemoglobin binding by HpuA from the Neisseriaceae family. Nature Communications. 6, 10172 (2015).
  36. Carson, S. D., Klebba, P. E., Newton, S. M., Sparling, P. F. Ferric enterobactin binding and utilization by Neisseria gonorrhoeae. Journal of Bacteriology. 181 (9), 2895-2901 (1999).
  37. Tseng, H. J., Srikhanta, Y., McEwan, A. G., Jennings, M. P. Accumulation of manganese in Neisseria gonorrhoeae correlates with resistance to oxidative killing by superoxide anion and is independent of superoxide dismutase activity. Molecular Microbiology. 40 (5), 1175-1186 (2001).

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