使用自动食物摄入量监测系统对大鼠的蔗糖偏好和新奇诱导性低吞咽测试

摘要

这里介绍的是研究大鼠抑郁症和焦虑行为的规程。它结合了两种成熟的行为方法，蔗糖偏好和新奇诱导的吞咽不足测试，与自动食品和液体摄入量监测系统，间接研究啮齿动物的行为使用代理参数。

摘要

全世界抑郁症的流行和发病率正在上升，影响到大约3.22亿人，这突出表明动物模型需要进行行为研究。在该协议中，为了研究大鼠的抑郁症状和过敏性行为，已建立的蔗糖偏好和新奇诱导的吞咽性测试与自动食物和液体摄入量监测系统相结合。在测试之前，在蔗糖偏好范式中，雄性大鼠接受至少2天的训练，除了自来水外，还食用蔗糖溶液。在测试过程中，大鼠再次暴露在水和蔗糖溶液中。消耗量由自动化系统每秒钟登记一次。蔗糖与总水摄入量的比率（蔗糖优先比）是安哈多尼亚的代用参数。在新奇引起的吞咽性测试中，雄性大鼠经过一个训练期，在训练期间，它们会接触到可口的零食。在训练期间，啮齿动物表现出稳定的基线零食摄入量。在测试日，动物们从家里的笼子里被转移到一个新鲜的空笼子里，代表一个新的未知环境，可以吃到已知的可口小吃。自动化系统记录了总摄入量及其底层的微观结构（例如，接近零食的延迟），从而深入了解焦虑和焦虑行为。这些范式与自动测量系统相结合，通过减少测量误差，提供更详细的信息，以及更高的精度。然而，测试使用代理参数，并且仅间接地描述抑郁症和焦虑症。

引言

平均而言，4.4%的世界人口受到抑郁症的影响。全世界人口3.22亿，比十年前增加了^18%。据世界卫生组织估计，抑郁症在2020年《残疾调整寿命年数》中排名第^二。为了解决情感障碍的日益流行，建立新的干预策略，有必要进一步研究这种行为。在进行人类检查之前和之前，动物研究是必要的。

已经建立了几个模型来研究抑郁症行为的组成部分（即强迫游泳测试，尾部悬浮测试，蔗糖偏好测试，和新奇诱导的吞咽^{）3，4。,4}蔗糖偏好测试（SPT）和新奇诱发的吞咽性（NIH）可以检测动物的抑郁症样行为。这些测试本身不会诱发啮齿动物的抑郁状态，而是描绘了行为的尖锐变化。SPT和NIH评估抑郁症的一个特征，即对以下项目失去兴趣:奖励活动，个人^{曾经享受的活动5，}以及处理和响应奖励6的复杂现象的一^个方面。这两项测试都研究以可口食物的形式对有益刺激的反应。消费范围用作 Anhedonia 7^{、8、97,的代理参数}。

研究性失血症的测试的价值在很大程度上取决于通过精确测量该物质的重量而得出的准确消耗。通常，此测量在测试之前和测试后手动进行一次。但是，由于多种原因，这容易产生错误的测量结果。首先，啮齿动物倾向于囤积食物，这意味着他们删除食物而不立即食用，然后将其隐藏在安全的地方。因此，这种食物损失可以包括在总消费量的计算中。其次，大鼠将食物和水溢出，导致体重减轻，无需各自食用。第三，由于将瓶子从笼子中插入并取出，液体被意外丢失。

为了减少这些误差源，我们结合了两种常见的测试，评估了安哈多尼亚（SPT^3、4,4和NIH^9），并使用自动食物和液体摄入量监测系统测量食物和水的摄入量。该程序允许准确调查可口物质的消耗，并提供有关大鼠快乐体验的信息，这是抑郁症样行为的一个特征。使用不同的方法减少了与手动测量相关的上述错误，稍后将更详细地说明这些误差。

为了提供有关微观结构的信息，本协议¹⁰ 中使用的自动进气监测系统对食物（±0.01克）进行称重。因此，一个稳定的体重被记录为"不吃"，一个不稳定的体重被记录为"吃"。"bout"定义为事件之前和之后稳定重量的变化。一餐由一种或多轮组成，其在大鼠中的最低大小定义为0.01克。一餐与大鼠的另一餐分开15分钟（标准化值）。因此，当食物摄入量在15分钟内发生，体重变化等于或大于0.01g时，食物摄入量被认为是一顿饭。在该协议中评估的膳食参数包括膳食持续时间、用餐时间、回合大小、回合持续时间、回合中花费的时间、第一回合的延迟和回合数。

研究方案

动物护理和实验程序遵循具体的机构伦理准则，并经国家动物研究主管部门批准。

1. 自动监测系统的运作

注意:在操作自动监控系统时，在操作之前，在软件中包含的注释框中记录每个操作都至关重要。描述应键入注释框，通过按" 保存"，该说明将保存在特定时间点中。分析数据时，时间点很重要，因为系统会连续记录，并且必须指示感兴趣周期进行分析。

1. 安装、使用和维护自动监控系统
   注:此协议使用重达250~300克（约10周大）的成年雄性Sprague Dawley大鼠。建议在适应期将老鼠组在一起。环境条件应控制在以下参数:12小时/12小时暗/光循环，灯在6:00 A..M，湿度45%-65%，温度21-23°C， 并 辅助利比图姆获得水和标准啮齿动物饮食。日常处理使动物们习惯于调查人员。
   1. 分离老鼠，使每只动物都有一个单独的笼子。确保每只老鼠在协议期间保持分离。
   2. 用1~2厘米厚的薄层填充固定式床上用品。这种（减少的）量减少了微平衡物和漏斗溢出污染的可能性，从而减少了测量误差。添加塑料管（例如，一块直径为 8 厘米的 20 厘米长的塑料排水管）和啃木作为浓缩，同时省略纸组织以减少测量误差。
   3. 通过将两个带微平衡的封闭笼架安装到笼子正面的定制孔上，为自动固体和液体食物摄入量测量准备保持架。将两个空料斗放在笼子安装架上，一个用于鸡槽，一个用于瓶子。
      注:微平衡通过电缆连接到连接到计算机的录制系统，相应的软件安装在计算机上。
   4. 要开始录制，请打开"监视器"并按"开始"，然后选择保存数据的位置。
   5. 使用自动进气监控系统的校准（按"校准"）功能，通过拆下料斗并将两个不同的测量重量放在带天平的保持架支座上来校准每个平衡。定期执行（建议每周一次）。
   6. 将一个料斗完全填成周（±100克），并去除尺寸太小的周片和碎块。将水放入瓶子（±100 mL）中，并放入其他料斗中。
   7. 记录食物和水的位置（例如，平衡1:食物动物1，平衡2:水动物1）。
   8. 把老鼠放在笼子里，打开笼子安装的所有门，这样它就可以 吃喝了。
      注:为了进行准确的测量，每天需要用刷子轻轻清洁，从食品容器中清除小食物屑，从而保持平衡和漏斗。这将大大减少错误测量。在日常维护期间关闭所有闸门。
2. 实验后访问数据
   1. 在注释框中搜索需要分析的时间段的开始和结束时间点（例如，培训、测试）。
   2. 单击软件上的"查看数据"以打开数据查看器。
   3. 在"开始时间"和"结束时间"下面的框中插入时间点。按左上角的正方形，指示记录信息的平衡。
   4. 点击"PSC 总计"访问微观结构数据。按"导出PSC 表"按钮导出数据。
      注:要使用自动监控比较单个动物的微观结构（例如，无压力与有压力），可以通过按左上角的适当方块在"数据查看器" 中选择单个动物。 PSC 总计 仅显示所选动物的微观结构。无法对系统执行统计分析。数据需要提取到电子表格程序/分析软件中。

2. 蔗糖偏好测试的实施

1. 进行培训期间
   注:在测试之前，动物必须习惯于在漏斗上提供两瓶液体，而食物应从笼子的顶部提供（设置如图 1所示）。此培训期应至少持续 2 天。它在饲养动物的房间的笼子里进行。
   1. 关闭所有大门从微平衡中取出水瓶和食品容器。
   2. 将预称食物（±50克）放在笼子顶部，每天用常规平衡记录其重量，以评估日常食物消耗量。如有必要，重新填充。
   3. 用清水清洁瓶子，再加注约100毫升的水。放回料斗上。
   4. 将第二个清洁瓶中装满 100 mL 新鲜制作的 1% 蔗糖溶液。放在料斗上。
      注:仔细标记瓶子并记录其位置（例如，平衡1:水动物1，平衡2:蔗糖溶液动物1）。
   5. 打开所有大门。记录监控系统中培训的开始。使门打开 24 小时，从而 获得两 个瓶子。24 天后，关闭大门并记录训练结束。24小时间隔的数据可以通过插入"开始时间"和"结束时间"来使用自动监控系统进行评估。评估 1 小时测试间隔时，这些过程是相同的。
   6. 每24小时清洁一次奶瓶并重新灌装。每天准备新鲜的 1% 蔗糖溶液。每天切换水和蔗糖溶液瓶的位置，避免习惯性影响。
      注:在所有动物中至少进行48小时的培训，直到偏好比率达到+1。使用"数据查看器"在训练后直接评估蔗糖偏好比。计算为蔗糖摄入量与总摄入量之比（水加蔗糖摄入量）。
   7. 在测试前 24 小时，用蔗糖溶液取出瓶子，这样大鼠只能获得标准周和水。
   8. 准备一个装满自来水的新鲜瓶子和一个装满 1% 蔗糖溶液的瓶子，两者均有 ±100 mL。
   9. 测试前，关闭所有闸门。
   10. 从料斗上取出装满自来水的瓶子，将两个装满自来水的新鲜瓶子放在料斗上，一个装满自来水，另一个装满 1% 蔗糖溶液。
   11. 打开所有门，记录监控系统中测试的开始。使大门打开 60 分钟。60 分钟后关闭闸门并记录测试结束。
   12. 评估数据（例如，蔗糖/总液体进气比）。
       注:测试可以重复多次，间隔训练（至少 2 天）。

3. 实施新奇诱发的吞咽性测试

1. 进行培训期间
   注:在测试之前，建议每天 30 分钟的训练期为 5 天（设置如图 2 所示）。目的是在实验前达到可口零食摄入量的稳定基线。它在饲养动物的房间的笼子里进行。
   1. 关闭所有门，用标准周拆下料斗。
   2. 用可口的零食（约50克）填充新鲜的料料。小心地将饼干插入料斗中，以防止碎裂。将料斗放在微平衡顶部的笼子上。
   3. 打开大门30分钟，使老鼠 有广告接触 小吃和水。记录监控系统中培训的开始。
      注:在训练期间，大鼠应无法获得标准周。
   4. 30 分钟后关闭大门，并在监控系统中记录训练结束。用标准菜代替零食。
   5. 每天重复这一点，直到达到 1） 稳定的基线可口零食摄入量（例如，1.5~2.0 g/30 分钟）和 2）摄入量在训练日之间没有统计上差异。
2. 执行新奇诱发的吞咽性测试
   1. 准备一个空的、刚清洗的笼子，没有床上用品或浓缩剂附在自动食物摄入量监测系统上。将一个带一瓶自来水的料斗放在笼子上，在笼子上放置一个可口的小吃。
      注:新奇的笼子应放在同一个房间，在那里举行和训练老鼠。关门
   2. 把老鼠从家里的笼子里取出，放在新奇的笼子里。
   3. 打开所有大门 30 分钟。记录监控系统中测试的开始。
      注:在获得零食的30分钟内，使用自动食物摄入量监测系统记录零食摄入量的大小和潜在的微观结构参数（例如，第一餐的延迟）。
   4. 30 分钟后关闭大门并记录测试结束。把老鼠放回家里的笼子里。
      注:测试可以重复多次，间隔训练（至少5天）。

结果

为了测试数据分布，使用了科尔莫戈罗夫-斯米尔诺夫测试。当数据被等向分布，使用曼-惠特尼-U测试时，使用T-测试，如果不是的话。将双向ANOVA和Tukey后期测试用于正向分布的多个组比较。在非正态分布的情况下，使用双向 ANOVA 和 Dunn 的多重比较测试。当 p < 0.05 时，组之间的差异被认为是显著的。

在这项研究中，SPT对天真的老鼠进行了检查。在培训期间，蔗糖溶液?...

讨论

蔗糖偏好和新奇诱发的吞咽性测试是评估大鼠性脑炎的两种既定技术。它们与自动食物摄入量监测系统相结合，可以对不受干扰的大鼠进行更详细的分析，并减少错误测量。

错误发生率通过不同的方法减少。首先，为了解决由于溢出而导致的错误，食品料斗和门之间的间隙允许啃食过程中产生的面包屑落到集成托盘上。通过将这种溢出物收集到笼式支架上，它们包含在测量?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Assembly LH Cage Mount - RAT-FOOD - includes Stainless cage mount, hopper, blocker, coupling	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BCMPRF01
Assembly LH Cage Mount unplugged - RAT - FOOD includes stainless steel cage mount, hopper, blocker, unplugged adapter, coupling	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BCMUPRF01
cage w/ 2 openings - RAT - costum modified cage - includes cage top and standard water bottle	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BCR02	single housing
Data collection Laptop Windows - Configured w/ BioDAQ Software	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BLT003
enrichment (plastic tubes, gnawing wood)			distributed by the animal facility
HoneyMaid Graham Cracker Crumbs	Nabisco, East Hanover, NJ, USA	ASIN: B01COWTA98	palatable snack for NIH test
low vibration polymer rack	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BRACKR
male Sprague Dawley rats	Envigo	Order Code: 002
Model #2210 32x Port BioDAQ Central Controller - includes cables, and calibration kit	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BCC32_03
Peripheral sensor Controller - includes cable	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BPSC01
SigmaStat 3.1	Systat Software, San Jose, CA, USA		statistical analysis
Stainless steel blocker	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BBLKR
standard rodent diet with 10 kcal% fat	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	D12450B
sucrose powder	Roth	4621.1	for SPT