자동 식품 섭취 모니터링 시스템을 사용하여 쥐에서 자당 선호 및 참신 유도 Hypophagia 테스트

요약

여기에 제시 된 쥐에서 우울증과 같은 과금 행동을 연구하는 프로토콜입니다. 그것은 두 개의 잘 확립 된 행동 방법, 자당 환경 설정 및 참신 유도 hypophagia 테스트, 자동화 된 식품 및 액체 섭취 모니터링 시스템을 결합, 간접적으로 대리 매개 변수를 사용 하 여 설치류 행동을 조사.

초록

우울 장애의 보급 그리고 부각은 동물 모형에 있는 행동 연구 결과를 위한 필요를 밑줄, 대략 3억 2,200만 명의 개별에 영향을 미치는 전 세계적으로 상승하고 있습니다. 이 프로토콜에서, 쥐에 있는 불경기 같이 그리고 anhedonic 행동을 공부하기 위하여는, 확립된 자당 선호도 및 참신유도한 hypophagia 시험은 자동화한 음식 및 액체 섭취 감시 시스템과 결합됩니다. 테스트 하기 전에, 자당 선호 패러다임에서, 남성 쥐는 수돗물 이외에 자당 용액을 소비 하기 위해 적어도 2 일 동안 훈련. 시험 도중, 쥐는 다시 물과 자당 용액에 드러난다. 소비는 자동화된 시스템에 의해 매 초마다 등록됩니다. 총 수분 섭취량(자당 선호도 비율)에 대한 자당비율(자당 선호도 비율)은 안도니아에 대한 대리 매개변수이다. 참신유도 hypophagia 시험에서, 남성 쥐는 맛있는 간식에 드러내는 훈련 기간을 겪습니다. 훈련 하는 동안, 설치류는 안정적인 기준 간식 섭취를 보여줍니다. 테스트 당일, 동물들은 홈 케이지에서 알려진 맛있는 간식에 접근할 수 있는 새로운 알려지지 않은 환경을 나타내는 신선하고 빈 케이지로 옮겨갑니다. 자동화된 시스템은 총 섭취량과 기본 미세 구조(예: 간식에 접근하는 대기 시간)를 기록하여 무증하고 불안한 행동에 대한 통찰력을 제공합니다. 이러한 패러다임과 자동화된 측정 시스템의 조합은 측정 오류를 줄임으로써 더 높은 정확도와 함께 보다 자세한 정보를 제공합니다. 그러나, 테스트는 대리 매개 변수를 사용 하 고 간접적인 방식으로 우울증과 anhedonia를 묘사.

서문

평균적으로, 세계 인구의 4.4%는 불경기의 영향을 받습니다. 이는 전 세계적으로 3억 2,200만 명으로 10년 전대비 18% 증가한^{수치입니다.} 세계보건기구(WHO)의 추정에 따르면, 우울증은 2020년 장애조정생활 순위에서^2위를차지하게 됩니다. 정서적 장애의 상승 보급을 해결하고 새로운 중재 전략을 수립하기 위해,이 행동을 더 연구 할 필요가있다. 인간에서 검사하기 위해서는 동물 연구가 필요합니다.

몇몇 모형은 우울한 행동 (즉, 강제 수영 시험, 꼬리 정지 시험, 자당 특혜 시험 및 참신 유도 hypophagia)^3,4의구성 요소를 연구하기 위하여 설치되었습니다. 자당 선호도 테스트 (SPT) 및 참신 유도 hypophagia (NIH) 동물에서 우울증 같은 행동을 감지할 수 있습니다. 이러한 테스트 자체는 설치류에 있는 불경기의 상태를 유도하지 않습니다 그러나 행동에 있는 심각한 변경을 묘사합니다. SPT와 NIH 는 모두 안에도니아로 알려진 우울증의 특성을 평가하며, 이는 보람있는 활동, 한때 개인이 즐겼던 활동^5,그리고 보상^6에대한 복잡한 현상의 한 측면입니다. 두 테스트 모두 맛있는 음식의 형태로 보람있는 자극에 대한 반응을 연구합니다. 소비의 범위는 anhedonia^,7,8,89에대한 대리 매개 변수 역할을한다.

anhedonia를 조사하는 테스트의 가치는 물질의 무게를 정밀하게 측정하여 발생하는 정확한 소비 측정에 크게 의존합니다. 종래, 이 측정은 시험 전후에 한 번 수동으로 수행됩니다. 그러나 이것은 여러 가지 이유로 잘못된 측정을 하는 경향이 있습니다. 첫째, 설치류는 음식을 비축하는 경향이, 그들은 즉시 소비하지 않고 음식을 제거 한 다음 안전한 장소에 숨길 것을 의미. 따라서, 이러한 식품 손실은 총 소비량의 계산에 포함될 수 있다. 둘째, 쥐는 음식과 물을 유출, 각 소비없이 체중 감소의 결과. 셋째, 의도하지 않은 액체 손실은 병을 케이지에서 삽입하고 제거하여 병을 취급하기 때문에 발생합니다.

이러한 오류 원인을 줄이기 위한 접근 방식에서, 우리는 자동 식품 및 액체 섭취 모니터링 시스템을 사용하여 음식과 물 섭취량을 측정하여 anhedonia (SPT^3,,4 및 NIH^9)를평가하는 두 가지 일반적인 테스트를 결합했습니다. 이 절차는 맛있는 물질의 소비에 대한 정확한 조사를 허용하고 우울증과 같은 행동의 특징으로 쥐의 즐거움경험에 대한 정보를 제공합니다. 수동 측정과 관련된 위에서 언급한 오류는 나중에 자세히 설명되는 다른 접근 방식을 사용하여 감소됩니다.

미세 구조에 대한 정보를 제공하기 위해 이^{프로토콜(10)에} 사용되는 자동화된 섭취 모니터링 시스템은 초당 식품(±0.01g)의 무게를 측정합니다. 따라서 안정된 체중은 "먹지 않음"으로 문서화되고 불안정한 체중은 "먹기"로 기록됩니다. "시합"은 이벤트 전후의 안정적인 중량 의 변화로 정의됩니다. 식사는 하나 이상의 시합으로 구성되며 쥐의 최소 크기는 0.01 g로 정의되었습니다. 식사는 쥐의 다른 식사와 15 분 (표준화 된 값)으로 분리됩니다. 따라서, 음식 섭취량은 시합이 15 분 이내에 발생하고 체중 변화가 0.01 g보다 크거나 클 때 하나의 식사로 간주됩니다. 이 프로토콜에서 평가된 식사 매개 변수에는 식사 시간, 식사 시간, 시합 크기, 시합 시간, 시합 시간, 시합에 소요된 시간, 첫 시합에 대한 대기 시간 및 시합 횟수가 포함됩니다.

프로토콜

동물 관리 및 실험 절차는 특정 기관 윤리 지침을 따르고 동물 연구를위한 국가 당국의 승인을 받았습니다.

1. 자동 모니터링 시스템 운영

참고: 자동화된 모니터링 시스템을 작동할 때는 작업 직전에 소프트웨어에 포함된 주석 상자의 모든 작업을 문서화하는 것이 중요합니다. 설명은 주석 상자에 입력해야 하며 저장을누르면 특정 시간점으로 저장됩니다. 시스템 레코드가 지속적으로 기록되고 분석을 위해 관심 기간을 표시해야 하므로 데이터를 분석할 때 시간포인트가 중요합니다.

1. 자동화된 모니터링 시스템 설치, 사용 및 유지 관리
   참고 : 이 프로토콜은 250-300 g (~10 주 된)의 성인 남성 스프라그 Dawley 쥐를 사용합니다. 적응 기간 동안 그룹으로 쥐를 수용하는 것이 좋습니다. 환경 조건은 다음과 같은 매개 변수로 제어되어야한다 : 6:00 A.M., 습도 45 %-65 %, 21-23 ° C의 온도, 물과 표준 설치류 다이어트에 대한 광고 리비툼 액세스 : 12 h/ 12 h 어두운 / 빛 주기. 매일 취급하면 동물이 수사관에게 익숙해질 수 있습니다.
   1. 쥐를 분리하여 모든 동물에게 개별 케이지가 있습니다. 프로토콜 중에 모든 쥐가 분리되어 있는지 확인합니다.
   2. 하우징 케이지를 1-2cm 두께의 일반 침구로 채웁니다. 이 (감소) 양은 유출과 함께 마이크로 밸런스와 호퍼의 오염 가능성을 감소시켜 측정 오류를 줄입니다. 플라스틱 튜브(예: 직경 8cm의 플라스틱 배수관 20cm 길이)를 추가하고 나무를 농축으로 넣고 측정 오류를 줄이기 위해 종이 조직을 생략합니다.
   3. 마이크로 밸런스가 있는 두 개의 밀폐케이지 마운트를 케이지 앞면에 맞춤 제작된 구멍에 부착하여 자동화된 고체 및 액체 식품 섭취 측정을 위해 케이지를 준비합니다. 케이지 마운트에 빈 호퍼 2개, 차우용호, 병용 호퍼 2개를 놓습니다.
      참고: 마이크로저울은 케이블을 통해 컴퓨터에 연결된 레코딩 시스템에 연결되며 각 소프트웨어가 컴퓨터에 설치됩니다.
   4. 녹음을 시작하려면"모니터"를열고"시작"을누릅니다.
   5. 자동화된 섭취 모니터링 시스템의 교정(press"calibrate"기능을 사용하여 호퍼를 제거하고 케이지 마운트에 두 개의 서로 다른 게이지 가중치를 균형으로 배치하여 모든 균형을 보정합니다. 정규 시간 간격으로 이 작업을 수행합니다(매주 권장).
   6. 한 호퍼를 차우(~100g)로 완전히 채우고, 크기가 너무 작은 차우 조각과 부스러기를 제거합니다. 병에 물을 채우고 (~100mL) 다른 호퍼에 넣습니다.
   7. 음식과 물의 위치를 문서화하십시오(예: 균형 1: 식품 동물 1, 균형 2: 물 동물 1).
   8. 쥐를 케이지에 넣고 케이지 마운트의 모든 문을 열어 광고 리비도를먹고 마실 수 있습니다.
      참고: 정확한 측정을 위해서는 유출로 브러시로 부드럽게 청소하고 식품 용기에서 작은 음식 부스러기를 제거하여 매일 균형과 호퍼를 유지해야 합니다. 이렇게 하면 잘못된 측정이 크게 줄어듭니다. 매일 유지 보수 하는 동안 모든 게이트를 닫습니다.
2. 실험 후 데이터에 액세스
   1. 분석해야 하는 기간(예: 교육, 테스트)의 시작 및 종료 시간점에 대한 주석 상자에서 검색합니다.
   2. 소프트웨어에서"데이터 보기"를클릭하여 데이터 뷰어를 엽니다.
   3. 아래 상자에 시간점을 삽입 "시간 시작" 및"종료 시간". 정보를 기록한 잔액을 나타내는 왼쪽 위 모서리의 사각형을 누릅니다.
   4. 미세 구조 데이터에 액세스하려면"PSC 합계"를 클릭합니다. 버튼을 누르면"PSC 테이블 내보내기"를눌러 데이터를 내보냅니다.
      참고: 자동화된 모니터링을 사용하여 개별 동물의 미세구조(예: 스트레스가 없는 대 스트레스)를 비교하기 위해 왼쪽 상단 모서리에 적절한 사각형을 눌러 개별 동물을"데이터 뷰어"에서 선택할 수 있습니다. PSC 합계는 선택한 동물의 미세 구조만 을 보여줍니다. 시스템에서통계 분석을 수행할 수 없습니다. 데이터를 스프레드시트 프로그램/분석 소프트웨어로 추출해야 합니다.

2. 자당 특혜 시험의 구현

1. 훈련 기간 실시
   참고 : 테스트 전에, 동물은 게이트를 통해 호퍼에 액체에 대한 두 병의 가용성에 익숙해져야하며, 음식은 케이지의 꼭대기에서 제공되어야한다 (설정은 그림 1에표시됩니다). 이 훈련 기간은 적어도 2 일 동안 지속되어야합니다. 그것은 동물이 개최되는 방에있는 홈 케이지에서 수행됩니다.
   1. 모든 게이트를 닫습니다. 마이크로 저울에서 물병과 식품 용기를 제거합니다.
   2. 미리 계량된 식품(~50g)을 케이지 위에 놓고 정기적인 균형을 사용하여 매일 체중을 기록하여 일일 음식 소비를 평가합니다. 필요한 경우 리필하십시오.
   3. 깨끗한 물로 병을 청소하고 약 100mL의 물로 리필하십시오. 호퍼에 다시 놓습니다.
   4. 갓 만든 1% 자당 용액 100mL로 두 번째 깨끗한 병을 채웁니다. 호퍼에 놓습니다.
      참고: 병을 주의 깊게 표시하고 위치를 문서화하십시오(예: 균형 1: 물 동물 1, 균형 2: 자당 용액 동물 1).
   5. 모든 게이트를 엽니다. 모니터링 시스템에서 교육의 시작을 문서화합니다. 게이트를 24시간 동안 열어 두 어드시브 를 모두 사용할 수 있습니다. 24 시간 후, 게이트를 닫고 훈련의 끝을 문서화합니다. 24h 간격의 데이터는"시작 시간"과"종료 시간"을삽입하여 자동화된 모니터링 시스템을 사용하여 평가될 수 있다. 프로시저는 1h 테스트 간격을 평가할 때 동일합니다.
   6. 24시간마다 병을 청소하고 리필하십시오. 매일 신선한 1% 자당 용액을 준비하십시오. 습관효과를 피하기 위해 매일 물과 자당액병의 위치를 전환합니다.
      참고: 기본 설정 비율이 ~1에 도달할 때까지 모든 동물에서 최소 48시간 동안 훈련을 실시합니다. 자당 선호도 비율은"데이터 뷰어"를사용하여 교육 후 직접 평가됩니다. 그것은 전체 섭취량 (물 플러스 자당 섭취)에 대한 자당 섭취의 비율로 계산됩니다.
   7. 시험 전에 24 시간, 쥐가 표준 차우와 물에 만 액세스 할 수 있도록 자당 용액병을 제거합니다.
   8. 수돗물로 채워진 신선한 병 1개와 1% 자당 용액으로 채워진 신선한 병을 ~100mL로 준비합니다.
   9. 테스트 하기 전에 모든 게이트를 닫습니다.
   10. 호퍼에서 수돗물로 채워진 병을 제거하고 두 개의 신선한 병을 두개, 하나는 수돗물로 채워진 병과 1 % 자당 용액으로 채워진 병을 호퍼에 놓습니다.
   11. 모든 게이트를 열고 모니터링 시스템에서 테스트의 시작을 문서화합니다. 60분 동안 문을 열어 둡니다. 60분 후에 게이트를 닫고 테스트의 끝을 문서화합니다.
   12. 데이터(예: 자당/총 유체 섭취 비율)를 평가합니다.
       참고: 테스트는 그 사이에 훈련 간격(최소 2일)으로 여러 번 반복될 수 있습니다.

3. 참신 유도 hypophagia 테스트의 구현

1. 훈련 기간 실시
   참고: 테스트 전에 는 5일간의 일일 30분 훈련 기간이 권장됩니다(설정은 그림 2에표시됨). 목표는 실험 전에 맛있는 스낵 섭취의 안정적인 기준을 달성하는 것입니다. 그것은 동물이 개최되는 방에있는 홈 케이지에서 수행됩니다.
   1. 모든 게이트를 닫고 표준 차우로 호퍼를 제거합니다.
   2. 신선한 호퍼를 맛있는 스낵(~50g)으로 채우십시오. 크래커를 호퍼에 조심스럽게 삽입하여 무너지는 것을 방지합니다. 호퍼를 케이지 마운트 위에 미세 잔액 위에 놓습니다.
   3. 쥐가 간식과 물에 대한 광고 리비도 액세스를 할 수 있도록 30 분 동안 게이트를 엽니 다. 모니터링 시스템에서 교육의 시작을 문서화합니다.
      참고: 쥐는 훈련 기간 동안 표준 차우에 접근할 수 없어야 합니다.
   4. 30분 후에 게이트를 닫고 모니터링 시스템에서 교육의 끝을 문서화합니다. 간식을 표준 차우로 대체하십시오.
   5. 1) 안정적인 기준선 맛 간식 섭취량이 달성 될 때까지 매일 이 것을 반복 (예를 들어, 1.5-2.0 g/30 분) 및 2) 섭취는 통계적으로 훈련 일 마다 다르지 않습니다.
2. 참신 유도 hypophagia 테스트 수행
   1. 자동화된 식품 섭취 모니터링 시스템에 침구나 농축 없이 비어 있는 갓 청소된 케이지를 준비합니다. 수돗물 한 병과 호퍼를 케이지 마운트에 맛있는 간식으로 놓습니다.
      참고 : 소설 케이지는 쥐가 개최되고 훈련이 수행되는 동일한 방에 배치해야합니다. 게이트를 닫아 두십시오.
   2. 홈 케이지에서 쥐를 제거하고 새로운 케이지에 배치합니다.
   3. 모든 게이트를 30분 동안 엽니다. 모니터링 시스템에서 테스트의 시작을 문서화합니다.
      참고: 간식에 30분 동안 간식 섭취 량과 기본 미세 구조 매개 변수(예: 첫 식사 대기 시간)는 자동화된 식품 섭취 모니터링 시스템을 사용하여 기록됩니다.
   4. 30분 후에 게이트를 닫고 테스트 의 끝을 문서화합니다. 쥐를 다시 홈 케이지에 넣습니다.
      참고: 테스트는 그 사이에 훈련 간격(최소 5일)으로 여러 번 반복될 수 있습니다.

결과

데이터 배포를 테스트하기 위해 콜모고로프-스미르노프 테스트가 사용되었습니다. T-테스트는 데이터가 일반적으로 배포되고 Mann-Whitney-U 테스트가 사용되지 않을 때 사용되었습니다. 단방향 ANOVA 다음에 Tukey 포스트 혹 테스트는 일반적으로 분산 된 다중 그룹 비교에 사용되었습니다. 단방향 ANOVA 다음에 던의 다중 비교 테스트는 비정상 분포의 경우 사용되었습니다. 그룹 간의 차이는 p< 0...

토론

자당 선호도 및 참신 유도 hypophagia 시험은 쥐에 있는 anhedonia를 평가하기 위한 2개의 확립된 기술입니다. 자동화된 식품 섭취 모니터링 시스템과의 결합을 통해 방해받지 않는 쥐에서 보다 자세한 분석을 할 수 있으며 잘못된 측정을 줄일 수 있습니다.

오류발생률은 다른 접근법에 의해 감소됩니다. 첫째, 유출로 인한 오류를 해결하기 위해 식품 호퍼와 게이트 사이의 간격을 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Assembly LH Cage Mount - RAT-FOOD - includes Stainless cage mount, hopper, blocker, coupling	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BCMPRF01
Assembly LH Cage Mount unplugged - RAT - FOOD includes stainless steel cage mount, hopper, blocker, unplugged adapter, coupling	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BCMUPRF01
cage w/ 2 openings - RAT - costum modified cage - includes cage top and standard water bottle	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BCR02	single housing
Data collection Laptop Windows - Configured w/ BioDAQ Software	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BLT003
enrichment (plastic tubes, gnawing wood)			distributed by the animal facility
HoneyMaid Graham Cracker Crumbs	Nabisco, East Hanover, NJ, USA	ASIN: B01COWTA98	palatable snack for NIH test
low vibration polymer rack	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BRACKR
male Sprague Dawley rats	Envigo	Order Code: 002
Model #2210 32x Port BioDAQ Central Controller - includes cables, and calibration kit	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BCC32_03
Peripheral sensor Controller - includes cable	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BPSC01
SigmaStat 3.1	Systat Software, San Jose, CA, USA		statistical analysis
Stainless steel blocker	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BBLKR
standard rodent diet with 10 kcal% fat	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	D12450B
sucrose powder	Roth	4621.1	for SPT