Otomatik Gıda Alımı İzleme Sistemi Kullanan Sıçanlarda Sakaroz Tercihi ve Yenilik Kaynaklı Hipofaji Testleri

Özet

Burada sunulan sıçanlarda depresyon benzeri ve anhedonik davranış çalışma için bir protokoldür. Bu iki köklü davranış yöntemleri birleştirir, sakaroz tercihi ve yenilik kaynaklı hipofaji testleri, otomatik bir gıda ve sıvı alımı izleme sistemi ile, dolaylı olarak vekil parametreleri kullanarak kemirgen davranışını araştırmak için.

Özet

Depresif hastalıkların görülme sıklığı ve görülme sıklığı dünya çapında artmakta olup, yaklaşık 322 milyon bireyi etkileyerek hayvan modellerinde davranışsal çalışmalara duyulan ihtiyacın altını çizmektedir. Bu protokolde, sıçanlarda depresyon benzeri ve anhedonik davranışları incelemek için, kurulan sakaroz tercihi ve yeniliği neden olan hipofaji testleri otomatik gıda ve sıvı alımı izleme sistemi ile birleştirilmiştir. Testten önce, sakaroz tercihi paradigmasında, erkek sıçanlar musluk suyuna ek olarak sakaroz solüsyonu tüketmek için en az 2 gün eğitilirler. Test sırasında sıçanlar tekrar su ve sakkaroz çözeltisine maruz kalırlar. Tüketim otomatik sistem tarafından her saniye kaydedilir. Toplam su alımı (sakaroz tercih oranı) sakaroz oranı anhedoni için bir vekil parametre. Yenilik kaynaklı hipofaji testinde, erkek sıçanlar lezzetli bir atıştırmaya maruz kaldıkları bir eğitim döneminden geçerler. Eğitim sırasında, kemirgenler istikrarlı bir temel atıştırmalık alımı göstermektedir. Test günü, hayvanlar ev kafeslerinden taze, boş bir kafese aktarılır ve bilinen lezzetli atıştırmaya erişimi olan bilinmeyen yeni bir ortamı temsil eder. Otomatik sistem toplam alımını ve altta yatan mikro yapısını kaydeder (örneğin, atıştırmaya yaklaşmaya gecikme), anhedonik ve endişeli davranışlarhakkında bilgi sağlar. Bu paradigmaların otomatik bir ölçüm sistemi yle birleşimi, ölçüm hatalarını azaltarak daha yüksek doğrulukla birlikte daha ayrıntılı bilgi sağlar. Ancak, testler vekil parametreleri kullanmak ve sadece dolaylı bir şekilde depresyon ve anhedoni tasvir.

Giriş

Ortalama olarak, dünya nüfusunun% 4.4 depresyon etkilenir. Bu hesap 322 milyon kişi dünya çapında, bir 18% artış on yıl^önce1 göre. Dünya Sağlık Örgütü tarafından yapılan tahminlere göre, depresyon 2020 yılında Engellilik Düzeltilmiş Yaşam Yılı sıralamasında ikinci olacak². Duygusal bozuklukların artan yaygınlığını ele almak ve yeni girişimsel stratejiler oluşturmak için bu davranışı daha fazla incelemek gerekir. İnsanlarda önceden ve muayeneye ek olarak hayvan çalışmaları gereklidir.

Çeşitli modeller depresif davranış bileşenleri çalışmak için kurulmuştur (yani, zorla yüzme testi, kuyruk süspansiyon testi, sakaroz tercih testi, ve yenilik kaynaklı hipofaji)^3,4. Sakaroz tercih testi (SPT) ve yeniliklere bağlı hipofaji (NIH) hayvanlarda depresyon benzeri davranışları saptayabiliyor. Bu testler kendilerini kemirgenlerde depresyon durumuna neden olmaz ama davranış akut değişiklikler tasvir. Hem SPT ve NIH aşağıdaki ilgi kaybı olarak bilinen depresyon karakteristik bir özelliği değerlendirmek: ödüllendirici faaliyetleri, bir zamanlar bireysel tarafından zevk edildi faaliyetleri⁵, ve işleme karmaşık fenomenin bir yönü ve ödül yanıt⁶. Her iki test de lezzetli gıda şeklinde ödüllendirici bir uyarıcı yanıt çalışma. Tüketim in ölçüde anhedoni için bir vekil parametre olarak hizmet^{vermektedir 7,8,9}.

Anhedoniyi araştıran testlerin değeri, maddenin ağırlığının kesin ölçümünden kaynaklanan tüketimin doğru belirlenmesine bağlıdır. Geleneksel olarak, bu ölçüm testten önce ve sonra bir kez el ile yapılır. Ancak, bu çeşitli nedenlerle hatalı ölçümler eğilimli. İlk olarak, kemirgenler gıda istiflemek eğilimindedir, onlar hemen tüketmeden gıda kaldırmak anlamına gelir sonra güvenli bir yerde gizlemek. Böylece, bu gıda kaybı toplam tüketimin hesaplanmasına dahil edilebilir. İkincisi, sıçanlar gıda ve su dökmek, ilgili tüketim olmadan kilo kaybı ile sonuçlanan. Üçüncü olarak, istenmeyen sıvı kaybı, şişelerin kafeslere yerleştirilerek ve çıkarılarak işlenmesine bağlı olarak meydana gelir.

Bu hata kaynaklarını azaltmak için bir yaklaşım olarak, anhedoni (SPT^3,,4 ve NIH⁹⁾değerlendirilen iki ortak testleri otomatik gıda ve sıvı alımı izleme sistemi kullanarak gıda ve su alımının ölçümü ile birleştirdik. Bu prosedür, lezzetli maddelerin tüketiminin doğru araştırılmasını sağlar ve depresyon benzeri davranışların bir özelliği olarak sıçanlarda zevk deneyimi hakkında bilgi sağlar. Manuel ölçümle ilişkili yukarıda belirtilen hatalar, daha sonra daha ayrıntılı olarak gösterilen farklı yaklaşımlar kullanılarak azaltılır.

Mikroyapı hakkında bilgi vermek için, bu protokolde kullanılan otomatik alım izleme sistemi¹⁰ her saniye gıda (±0.01 g) ağırlığındadır. Böylece, istikrarlı bir ağırlık olarak belgelenmiştir "yeme değil", ve "yeme" olarak kararsız bir ağırlık. "Bout" bir olaydan önce ve sonra kararlı ağırlık değişimi olarak tanımlanır. Bir öğün bir veya daha fazla nöbetten oluşur ve sıçanlarda minimum boyutu 0.01 g olarak tanımlanmıştır. Bir öğün farelerde başka bir yemekten 15 dakika (standart değer) ile ayrılır. Böylece, gıda alımı nöbetleri 15 dakika içinde meydana gelen ve kilo değişimi olarak eşit veya 0,01 g daha büyük bir yemek olarak kabul edilir. Bu protokolde değerlendirilen yemek parametreleri arasında yemek süresi, öğünlerde geçirilen süre, müsabaka boyutu, nöbet süresi, nöbetlerde geçirilen süre, ilk müsabakaya geç kalma ve nöbet sayısı yer almaktadır.

Protokol

Hayvan bakımı ve deneysel prosedürler belirli kurumsal etik yönergeleri izledi ve hayvan araştırma için devlet otoritesi tarafından onaylandı.

1. Otomatik izleme sisteminin çalışması

NOT: Otomatik izleme sistemini çalıştırırken, eylemden hemen önce yazılımda yer alan yorum kutusundaki her eylemi belgelemek çok önemlidir. Açıklama yorum kutusuna yazılmalıdır ve Kaydettuşuna basılarak, belirli bir zaman dilimi ile kaydedilir. Sistem sürekli olarak kaydedildiğinden, verileri analiz ederken zaman puanları önemlidir ve analiz için ilgi süresi belirtilmelidir.

1. Otomatik izleme sisteminin kurulumu, kullanılması ve bakımı
   NOT: Bu protokolde 250-300 g (~10 haftalık) ağırlığında yetişkin erkek Sprague Dawley sıçanları kullanılmıştır. Bu alışma döneminde gruplar halinde sıçanlar ev için tavsiye edilir. Çevre koşulları aşağıdaki parametrelerle kontrol edilmelidir:.M 12 saat/12 saat karanlık/ışık döngüsü, %6:00'da ışıklar açık, nem %45-65, sıcaklık 21-23 °C, ve su ve standart kemirgen diyetine reklam libitum erişimi. Günlük kullanım, hayvanların araştırmacılara alışmasını sağlar.
   1. Fareleri ayırın, böylece her hayvanın ayrı bir kafesi vardır. Protokol sırasında her farenin ayrı kaldığından emin olun.
   2. 1-2 cm kalınlığında bir tabaka ile düzenli yatak ile konut kafesleri doldurun. Bu (azaltılmış) miktar, mikroterazilerin ve haznelerin dökülme ile kirlenme olasılığını azaltarak ölçüm hatalarını azaltır. Ölçüm hatalarını azaltmak için kağıt dokuları atlarken, plastik tüpler (örneğin, 8 cm çapında plastik bir drenaj borusu 20 cm uzunluğunda bir parça) ve zenginleştirme olarak odun kemirme ekleyin.
   3. Kafeslerin ön tarafındaki özel deliklere mikro terazili iki kapalı kafes yuvası takarak otomatik katı ve sıvı gıda alımı ölçümü için kafesleri hazırlayın. Kafes bağlar üzerinde iki boş hazneler yerleştirin, bir yemek için ve şişe için bir.
      NOT: Mikro teraziler kablolar aracılığıyla bilgisayara bağlı bir kayıt sistemine bağlanır ve ilgili yazılım bilgisayara yüklenir.
   4. Kayda başlamak için "Monitor" tuşuna basın ve "Başlat" tuşuna basın, ardından verileri kaydetmek için bir yer seçin.
   5. Otomatik alım izleme sisteminin kalibrasyon ("Calibratlet") işlevini kullanarak, hazneleri çıkararak ve terazi ile kafes yuvalarına iki farklı ölçülü ağırlık yerleştirerek her dengeyi ayarlayın. Bunu düzenli zaman aralıklarında yapın (haftalık önerilir).
   6. Bir hazneyi tamamen chow (~100 g) ile doldurun ve boyutu çok küçük olan chow parçalarını ve ufaları çıkarın. Suyu şişeye doldurun (~100 mL) ve diğer hazneye yerleştirin.
   7. Gıda ve suyun konumunu belgeleyin (örn. denge 1: gıda hayvanı 1, denge 2: su hayvanı 1).
   8. Kafese sıçan yerleştirin ve yemek ve reklam libitumiçmek böylece kafes bağlar tüm kapılarını açın.
      NOT: Doğru bir ölçüm için, dökülme bir fırça ile hafifçe temizlik ve gıda kabından küçük gıda kırıntıları kaldırarak günlük dengeleri ve hazneler korumak için gereklidir. Bu büyük ölçüde hatalı ölçüm azaltacaktır. Günlük bakım sırasında tüm kapıları kapatın.
2. Denemelerden sonra verilere erişim
   1. Analiz edilmesi gereken bir dönemin başlangıç ve bitiş zaman noktalarını (örn. eğitim, test) için yorum kutusunda arama yapın.
   2. Veri Görüntüleyicisi'ni açmak için yazılımdaki "Verileri Görüntüle" üzerine tıklayın.
   3. Saat noktalarını aşağıdaki kutulara "Başlangıç zamanı" ve "Bitiş zamanı" ekleyin. Bilgileri kaydeden bakiyeyi gösteren sol üst köşedeki kareye basın.
   4. Mikroyapı verilerine erişmek için "PSC Toplamları" üzerine tıklayın. Verileri dışa aktarmak için"PSC Tablosunu Dışa Aktar"düğmesine basın.
      NOT: Otomatik izleme kullanarak hayvanların mikro yapısını karşılaştırmak için (örn. vurgusuz vs. stresli) sol üst köşedeki uygun kareye basılarak"Veri görüntüleyici" seçilebilir. PSC Toplamları yalnızca seçilen hayvanın mikro yapısını gösterir. Sistemle istatistiksel analiz yapılamaz. Verilerin bir elektronik tablo programı/analiz yazılımına ayıklanması gerekir.

2. Sakkaroz tercih testinin uygulanması

1. Eğitim döneminin yürütülmesi
   NOT: Testten önce, hayvanlar kapılardan silolarda sıvılar için iki şişe nin bulunmasına alışkın olmalıdır, kafeslerin üstlerinden yiyecek sağlanmalıdır (kurulum Şekil 1'degösterilmiştir). Bu eğitim süresi en az 2 gün sürmelidir. Hayvanların tutulduğu odadaki kafeslerde yapılır.
   1. Bütün kapıları kapatın. Su şişesini ve gıda kabını mikro dengelerden çıkarın.
   2. Önceden tartılmış yiyecekleri (~50 g) kafesin üstüne yerleştirin ve günlük gıda tüketimini değerlendirmek için düzenli bir denge kullanarak ağırlığını günlük olarak belgeleyin. Gerekirse yeniden doldurun.
   3. Bir şişeyi temiz suyla temizleyin ve yaklaşık 100 mL su yla doldurun. Hazneye geri koy.
   4. İkinci temiz şişeyi 100 mL taze yapılmış %1 sakaroz çözeltisi ile doldurun. Hazneye koy.
      NOT: Şişeleri dikkatlice işaretleyin ve konumlarını belgeleyin (örn. denge 1: su hayvanı 1, denge 2: sakkaroz çözeltisi hayvan 1).
   5. Tüm kapıları aç. İzleme sisteminde eğitimin başlangıcını belgele. Kapıları 24 saat açık bırakın ve her iki şişeye de reklam libitum erişimi elde edin. Saat 24'ten sonra kapıları kapatın ve eğitimin sonunu belgele. 24 saat aralığından elde edilen veriler , "başlangıç zamanı" ve "bitiş saati" ekleyerek otomatik izleme sistemi kullanılarak değerlendirilebilir. 1 saatlik bir test aralığı değerlendirildiğinde yordamlar aynıdır.
   6. Temiz ve her 24 saat şişe leri yeniden doldurun. Taze % 1 sakaroz çözeltisi günlük hazırlayın. Alışkanlık etkilerini önlemek için su ve sakaroz çözeltisi şişesinin konumunu günlük olarak değiştirin.
      NOT: Tercih oranları ~1'e ulaşana kadar tüm hayvanlarda en az 48 saat eğitim edin. Sakaroz tercih oranı eğitimden hemen sonra "Veri görüntüleyici" kullanılarak değerlendirilir. Sakaroz alımının genel alıma oranı olarak hesaplanır (su artı sakaroz alımı).
   7. Testten 24 saat önce, sakaroz solüsyonu ile şişeyi çıkarın, böylece sıçan sadece standart chow ve suya erişebilsin.
   8. Musluk suyu ile dolu bir taze şişe ve her ikisi de ~100 mL ile %1 sakaroz çözeltisi ile doldurulmuş bir şişe hazırlayın.
   9. Testeden önce tüm kapıları kapatın.
   10. Musluk suyu ile dolu şişeyi hazneden çıkarın ve biri musluk suyu yla dolu diğeri %1'lik sakaroz çözeltisi ile dolu iki taze şişeyi hazneye yerleştirin.
   11. Tüm kapıları açın, testin başlangıcını izleme sisteminde belgele. Kapıları 60 dakika açık bırakın. 60 dk sonra kapıları kapatın ve testin sonunu belgele.
   12. Verileri değerlendirin (örn. sakaroz/toplam sıvı alım oranı).
       NOT: Test, arada eğitim aralıkları (en az 2 gün) ile birkaç kez tekrarlanabilir.

3. Yenilik kaynaklı hipofaji testinin uygulanması

1. Eğitim döneminin yürütülmesi
   NOT: Test öncesinde günlük 30 dk eğitim süresi 5 gün önerilir (kurulum Şekil 2'degösterilmiştir). Amaç deney öncesi lezzetli atıştırmalık alımı istikrarlı bir taban çizgisi elde etmektir. Hayvanların tutulduğu odadaki kafeslerde yapılır.
   1. Tüm kapıları kapatın ve standart chow ile huni çıkarın.
   2. Taze bir hazneyi lezzetli atıştırmalık (~50 g) ile doldurun. Parçalanmayı önlemek için krakerleri hazneye dikkatlice yerleştirin. Hazneyi mikro terazinin üzerine kafes yuvasına yerleştirin.
   3. Fare atıştırma ve su reklam libitum erişimi böylece 30 dakika için kapıları açın. İzleme sisteminde eğitimin başlangıcını belgele.
      NOT: Sıçan eğitim süresi boyunca standart chow erişimi olmamalıdır.
   4. 30 dakika sonra kapıları kapatın ve izleme sisteminde eğitimin sona erini belgelayın. Aperatifi standart yemekle değiştirin.
   5. 1) kararlı temel lezzetli atıştırma alımı elde edilene kadar (örn. 1.5-2.0 g/30 dk) ve 2) alım istatistiksel olarak eğitim günleri arasında farklılık göstermez.
2. Yenilik kaynaklı hipofaji testinin ifası
   1. Otomatik gıda alımı izleme sistemine bağlı yatak veya zenginleştirme olmadan boş, taze temizlenmiş bir kafes hazırlayın. Kafes bağlar üzerinde lezzetli bir aperatif ile musluk suyu ve huni bir şişe ile bir huni yerleştirin.
      NOT: Roman kafesi farelerin tutulduğu ve eğitimin yapıldığı aynı odaya yerleştirilmelidir. Kapıları kapalı tut.
   2. Ev kafesi ve roman kafesyer sıçan çıkarın.
   3. 30 dakika boyunca tüm kapıları açın. İzleme sistemindeki testin başlangıcını belgele.
      NOT: Atıştırmaya erişimin 30 dakikası boyunca, atıştırmalık alımının büyüklüğü ve altta yatan mikroyapı parametreleri (örn. ilk öğüne gecikme) otomatik gıda alımı izleme sistemi kullanılarak kaydedilir.
   4. 30 dakika sonra kapıları kapatın ve test in sonunu belgele. Fareyi ev kafesine geri yerleştirin.
      NOT: Test, arada eğitim aralıkları (en az 5 gün) ile birkaç kez tekrarlanabilir.

Sonuçlar

Veri dağıtımını test etmek için Kolmogorov-Smirnov testi kullanıldı. Veriler normal olarak dağıtıldığında T-testleri kullanıldı ve değilse Mann-Whitney-U testi kullanıldı. Tek yönlü ANOVA ve ardından Tukey post-hoc testi normalde dağıtılan birden fazla grup karşılaştırması için kullanılmıştır. Tek yönlü ANOVA ve ardından Dunn'ın çoklu karşılaştırma testi normal olmayan dağılım durumlarında kullanıldı. P < 0.05'te gruplar arasındaki farklar anlamlı kabul edildi....

Tartışmalar

Sakaroz tercihi ve yeniliği neden olan hipofaji testleri sıçanlarda anhedoniyi değerlendirmek için kullanılan iki tekniktir. Otomatik gıda alımı izleme sistemi ile bunların kombinasyonu bozulmamış sıçanlarda daha ayrıntılı analiz sağlar ve hatalı ölçüm azaltır.

Hataların görülme sıklığı farklı yaklaşımlarla azalır. İlk olarak, dökülme nedeniyle meydana gelen hatayı gidermek için, gıda haznesi ve kapı arasındaki boşluk, kemirme sırasında oluşan kır...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Assembly LH Cage Mount - RAT-FOOD - includes Stainless cage mount, hopper, blocker, coupling	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BCMPRF01
Assembly LH Cage Mount unplugged - RAT - FOOD includes stainless steel cage mount, hopper, blocker, unplugged adapter, coupling	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BCMUPRF01
cage w/ 2 openings - RAT - costum modified cage - includes cage top and standard water bottle	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BCR02	single housing
Data collection Laptop Windows - Configured w/ BioDAQ Software	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BLT003
enrichment (plastic tubes, gnawing wood)			distributed by the animal facility
HoneyMaid Graham Cracker Crumbs	Nabisco, East Hanover, NJ, USA	ASIN: B01COWTA98	palatable snack for NIH test
low vibration polymer rack	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BRACKR
male Sprague Dawley rats	Envigo	Order Code: 002
Model #2210 32x Port BioDAQ Central Controller - includes cables, and calibration kit	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BCC32_03
Peripheral sensor Controller - includes cable	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BPSC01
SigmaStat 3.1	Systat Software, San Jose, CA, USA		statistical analysis
Stainless steel blocker	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BBLKR
standard rodent diet with 10 kcal% fat	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	D12450B
sucrose powder	Roth	4621.1	for SPT