Preferenza per il saccarosio e test di ipofagia indotti dalla novità nei ratti utilizzando un sistema automatizzato di monitoraggio dell'assunzione di cibo

Riepilogo

Presentato qui è un protocollo per studiare il comportamento depressionico e anedonico nei ratti. Combina due metodi comportamentali consolidati, la preferenza per il saccarosio e i test di ipofagia indotti dalla novità, con un sistema automatizzato di monitoraggio dell'assunzione di cibo e liquidi, per indagare indirettamente il comportamento dei roditori utilizzando parametri surrogati.

Abstract

La prevalenza e l'incidenza dei disturbi depressivi sono in aumento in tutto il mondo, colpendo circa 322 milioni di individui, sottolineando la necessità di studi comportamentali nei modelli animali. In questo protocollo, per studiare il comportamento depressionico e anedonico nei ratti, la preferenza consolidata per il saccarosio e i test di ipofagia indotti dalla novità sono combinati con un sistema automatizzato di monitoraggio dell'assunzione di cibo e liquidi. Prima del test, nel paradigma delle preferenze del saccarosio, i ratti maschi vengono addestrati per almeno 2 giorni a consumare una soluzione di saccarosio oltre all'acqua del rubinetto. Durante la prova, i ratti sono nuovamente esposti alla soluzione di acqua e saccarosio. Il consumo viene registrato ogni secondo dal sistema automatizzato. Il rapporto tra saccarosio e assunzione totale di acqua (rapporto preferenza saccarosio) è un parametro surrogato per l'anedonia. Nel test di ipofagia indotto dalla novità, i ratti maschi subiscono un periodo di allenamento in cui sono esposti a uno spuntino appetibile. Durante l'allenamento, i roditori mostrano un apporto stabile di snack di base. Il giorno del test, gli animali vengono trasferiti dalle gabbie di casa in una gabbia fresca e vuota che rappresenta un nuovo ambiente sconosciuto con accesso al noto spuntino appetibile. Il sistema automatizzato registra l'assunzione totale e la sua microstruttura sottostante (ad esempio, latenza ad avvicinarsi allo spuntino), fornendo informazioni sui comportamenti anedonici e ansiosi. La combinazione di questi paradigmi con un sistema di misurazione automatizzato fornisce informazioni più dettagliate, insieme a una maggiore precisione riducendo gli errori di misurazione. Tuttavia, i test utilizzano parametri surrogati e rappresentano solo depressione e anedonia in modo indiretto.

Introduzione

In media, il 4,4% della popolazione mondiale è colpito dalla depressione. Questi rappresentano 322 milioni di persone in tutto il mondo, con un aumento del 18% rispetto a dieci anni fa¹. Secondo le stime dell'Organizzazione Mondiale della Sanità, la depressione sarà al secondo posto nella classifica degli anni di vita corretti per la disabilità nel 2020². Per affrontare la crescente prevalenza di disturbi affettivi e stabilire nuove strategie interventive, è necessario studiare ulteriormente questo comportamento. Prima e oltre all'esame nell'uomo, sono necessari studi sugli animali.

Diversi modelli sono stati stabiliti per studiare componenti del comportamento depressivo (ad esempio, test di nuoto forzato, test di sospensione della coda, test di preferenza del saccarosio e ipofagia indotta dalla novità)^3,4. Il test di preferenza del saccarosio (SPT) e l'ipofagia indotta dalla novità (NIH) possono rilevare comportamenti simili alla depressione negli animali. Questi test stessi non inducono uno stato di depressione nei roditori ma descrivono cambiamenti acuti nel comportamento. Sia il TSS che il NIH valutano un tratto caratteristico di depressione noto come anedonia, che è la perdita di interesse per quanto segue: attività gratificanti, attività che un tempo erano^{godute dai singoli 5,}e un aspetto del complesso fenomeno della lavorazione e risposta alla^{ricompensa 6}. Entrambi i test studiano la risposta a uno stimolo gratificante sotto forma di cibo appetibile. L'entità del consumo funge da parametro surrogato per l'anedonia^7,8,9.

Il valore delle prove che studiano l'anedonia dipende fortemente dall'accurata determinazione del consumo risultante da una misurazione precisa del peso della sostanza. Convenzionalmente, questa misurazione viene effettuata manualmente una volta prima e una volta dopo il test. Tuttavia, questo è soggetto a misurazioni errate per diversi motivi. In primo luogo, i roditori tendono ad accumulare cibo, il che significa che rimuovono il cibo senza consumarlo immediatamente, quindi lo nascondono in un luogo sicuro. Pertanto, questa perdita di cibo può essere inclusa nel calcolo del consumo totale. In secondo luogo, i ratti versano cibo e acqua, con conseguente perdita di peso senza il rispettivo consumo. In terzo luogo, la perdita involontaria di liquido si verifica a causa della manipolazione delle bottiglie inserendole e rimuovendole dalle gabbie.

In un approccio per ridurre queste fonti di errore, abbiamo combinato i due test comuni di valutazione dell'anedonia (SPT^3,4 e NIH⁹⁾con la misurazione dell'assunzione di cibo e acqua utilizzando un sistema automatizzato di monitoraggio dell'assunzione di alimenti e liquidi. Questa procedura consente un'indagine accurata sul consumo di sostanze appetibili e fornisce informazioni sull'esperienza del piacere nei ratti come caratteristica del comportamento simile alla depressione. Gli errori di cui sopra associati alla misurazione manuale sono ridotti utilizzando diversi approcci, che vengono illustrati più avanti in modo più dettagliato.

Per fornire informazioni sulla microstruttura, il sistema automatizzato di monitoraggio dell'assunzione utilizzato in^{questo protocollo 10} pesa il cibo (±0,01 g) ogni secondo. Pertanto, un peso stabile è documentato come "non mangiare", e un peso instabile come "mangiare". Un "incontro" è definito come cambiamento di peso stabile prima e dopo un evento. Un pasto consiste in uno o più incontri e la sua dimensione minima nei ratti è stata definita come 0,01 g. Un pasto è separato da un altro pasto nei ratti di 15 min (valore standardizzato). Pertanto, l'assunzione di cibo è considerata un pasto quando gli attacchi si sono verificati entro 15 minuti e il cambiamento di peso è uguale o superiore a 0,01 g. I parametri dei pasti valutati in questo protocollo includono la durata del pasto, il tempo trascorso nei pasti, la dimensione dell'incontro, la durata dell'incontro, il tempo trascorso negli incontri, la latenza al primo incontro e il numero di incontri.

Protocollo

La cura degli animali e le procedure sperimentali hanno seguito le specifiche linee guida etiche istituzionali ed è stata approvata dall'autorità statale per la ricerca sugli animali.

1. Funzionamento del sistema di monitoraggio automatizzato

NOTA: quando si gestisce il sistema di monitoraggio automatico, è fondamentale documentare ogni azione nella casella dei commenti inclusa nel software immediatamente prima dell'azione. La descrizione deve essere digitata nella casella dei commenti e premendo Salva, viene salvata con un punto di tempo specifico. I punti di tempo sono significativi quando si analizzano i dati, poiché il sistema registra continuamente e il periodo di interesse deve essere indicato per l'analisi.

1. Installazione, utilizzo e manutenzione del sistema di monitoraggio automatizzato
   NOTA: Questo protocollo utilizza ratti Sprague Dawley maschi adulti del peso di 250-300 g (~ 10 settimane). Si consiglia di ospitare ratti in gruppi durante il periodo di acclimatazione. Le condizioni ambientali devono essere controllate con i seguenti parametri: 12 h/12 h ciclo buio/luce con luci accese alle 6:00 A.M., umidità del 45%-65%, e temperatura di 21-23 °C, e accesso ad libitum all'acqua e dieta standard dei roditori. La manipolazione quotidiana consente agli animali di abituarsi agli investigatori.
   1. Separare i ratti in modo che ogni animale abbia una gabbia individuale. Assicurarsi che ogni topo rimanga separato durante il protocollo.
   2. Riempire le gabbie di alloggiamento con biancheria da letto regolare con uno strato spesso 1-2 cm. Questa quantità (ridotta) riduce la possibilità di contaminazione di microbilanciamenti e tramogge con fuoriuscite, riducendo così gli errori di misurazione. Aggiungere tubi di plastica (ad esempio, un pezzo lungo 20 cm di un tubo di scarico di plastica con diametro di 8 cm) e rosicchiare il legno come arricchimento, omettendo i tessuti di carta per ridurre gli errori di misurazione.
   3. Preparare le gabbie per la misurazione automatizzata dell'assunzione di alimenti solidi e liquidi collegando due supporti a gabbia chiusi con microbilanciamenti a fori su misura sul lato anteriore delle gabbie. Posizionare due tramogge vuote sui supporti della gabbia, una per il chow e una per la bottiglia.
      NOTA: I microbilanciamenti sono collegati tramite cavi a un sistema di registrazione collegato a un computer e il rispettivo software è installato sul computer.
   4. Per iniziare la registrazione, aprite "Monitor" e premete "Start", quindi scegliete un posto dove salvare i dati.
   5. Utilizzando la funzione dicalibrazione(pressa " Calibrate ") del sistema di monitoraggio automatico dell'aspirazione, calibrare ogni bilanciamento rimuovendo le tramogge e posizionando due diversi pesi misurati sui supporti della gabbia con balancei.i. Eseguire questa attività a intervalli di tempo regolari (si consiglia settimanalmente).
   6. Riempire completamente una tramoggia con chow (~ 100 g) e rimuovere i pezzi di chow e i sbriciolamenti di dimensioni troppo piccole. Riempire l'acqua nella bottiglia (~ 100 mL) e posizionarla nell'altra tramoggia.
   7. Documentare la posizione del cibo e dell'acqua (ad esempio, equilibrio 1: animale alimentare 1, bilancio 2: animale d'acqua 1).
   8. Metti il topo nella gabbia e apri tutti i cancelli dei supporti della gabbia in modo che possa mangiare e bere ad libitum.
      NOTA: Per una misurazione accurata, è necessario mantenere quotidianamente gli equilibri e le tramogge pulendo delicatamente con un pennello dallo sversamento e rimuovendo piccole briciole di cibo dal contenitore alimentare. Ciò ridurrà notevolmente la misurazione errata. Chiudere tutti i cancelli durante la manutenzione giornaliera.
2. Accesso ai dati dopo gli esperimenti
   1. Cercare nella casella dei commenti i punti di ora di inizio e fine di un periodo (ad esempio, allenamento, test) che deve essere analizzato.
   2. Fare clic su "Visualizzadati " sul software per aprire il Visualizzatore dati.
   3. Inserire i punti di tempo nelle caselle sotto "Begin time" e "End time". Premere il quadrato nell'angolo superiore sinistro indicando il saldo che ha registrato le informazioni.
   4. Clicca su "PSC Totals" per accedere ai dati della microstruttura. Premere il pulsante "Esporta tabella PSC" per esportare i dati.
      NOTA: Per confrontare la microstruttura dei singoli animali (ad esempio, non stressati vs stressati) utilizzando il monitoraggio automatizzato, i singoli animali possono essere selezionati nel"Visualizzatore dati" premendo il quadrato appropriato nell'angolo superiore sinistro. Il PSC Totals mostra solo la microstruttura per l'animale selezionato. L'analisi statistica non può essere eseguita con il sistema. I dati devono essere estratti in un programma di fogli di calcolo / software di analisi.

2. Attuazione della prova di preferenza per il saccarosio

1. Condurre il periodo di formazione
   NOTA: Prima della prova, gli animali devono essere abituati alla disponibilità di due bottiglie per liquidi sulle tramogge attraverso i cancelli, mentre il cibo deve essere fornito dalla parte superiore delle gabbie (l'allevamento è mostrato nella figura 1). Questo periodo di formazione dovrebbe durare almeno 2 giorni. Viene eseguito nelle gabbie di casa nella stanza in cui sono tenuti gli animali.
   1. Chiudi tutti i cancelli. Rimuovere la bottiglia d'acqua e il contenitore del cibo dai microbilanciamenti.
   2. Posizionare il cibo pre-pesato (~ 50 g) sulla parte superiore della gabbia e documentare il suo peso ogni giorno utilizzando un equilibrio regolare per valutare il consumo giornaliero di cibo. Ricarica, se necessario.
   3. Pulire una bottiglia con acqua limpida e ricaricare con circa 100 ml di acqua. Riposizionare sulla tramoggia.
   4. Riempire una seconda bottiglia pulita con 100 ml di soluzione di saccarosio all'1% appena fatta. Mettilo sulla tramoggia.
      NOTA: Contrassegnare accuratamente le bottiglie e documentarne la posizione (ad esempio, equilibrio 1: animale da acqua 1, equilibrio 2: soluzione di saccarosio animale 1).
   5. Aprite tutti i cancelli. Documentare l'inizio della formazione nel sistema di monitoraggio. Lasciare i cancelli aperti per 24 ore, con conseguente accesso ad libitum ad entrambe le bottiglie. Dopo 24 ore, chiudere i cancelli e documentare la fine dell'allenamento. I dati dell'intervallo di 24 ore possono essere valutati utilizzando il sistema di monitoraggio automatizzato inserendo l' "ora di inizio" e l' " ora difine". Le procedure sono le stesse quando viene valutato un intervallo di prova di 1 h.
   6. Pulire e ricaricare le bottiglie ogni 24 ore. Preparare ogni giorno una soluzione fresca di saccarosio all'1%. Cambiare la posizione della bottiglia di soluzione di acqua e saccarosio ogni giorno per evitare effetti di assuazione.
      NOTA: Condurre l'allenamento in tutti gli animali almeno 48 ore fino a quando i rapporti di preferenza raggiungono ~1. Il rapporto di preferenza del saccarosio viene valutato direttamente dopo l'allenamento utilizzando il "Visualizzatore dati". È calcolato come rapporto tra l'assunzione di saccarosio e l'assunzione globale (acqua più assunzione di saccarosio).
   7. 24 ore prima della prova, rimuovere la bottiglia con la soluzione di saccarosio in modo che il ratto abbia accesso solo al chow standard e all'acqua.
   8. Preparare una bottiglia fresca riempita con acqua di rubinetto e una riempita con una soluzione di saccarosio all'1%, entrambe con ~ 100 ml.
   9. Prima del test, chiudi tutti i cancelli.
   10. Rimuovere la bottiglia riempita con acqua di rubinetto dalla tramoggia e posizionare le due bottiglie fresche, una riempita con acqua di rubinetto e una riempita con una soluzione di saccarosio all'1%, sulla tramoggia.
   11. Aprire tutti i cancelli, documentare l'inizio del test nel sistema di monitoraggio. Lasciare i cancelli aperti per 60 minuti. Chiudere i cancelli dopo 60 minuti e documentare la fine della prova.
   12. Valutare i dati (ad esempio, il rapporto di assunzione di saccarosio/fluido totale).
       NOTA: Il test può essere ripetuto più volte con intervalli di allenamento (almeno 2 giorni) nel mezzo.

3. Implementazione del test di ipofagia indotta dalla novità

1. Condurre il periodo di formazione
   NOTA: Prima della prova, si raccomanda un periodo di allenamento giornaliero di 30 minuti di 5 giorni (l'configurazione è illustrata nella figura 2). L'obiettivo è quello di raggiungere una linea di base stabile per l'assunzione di snack appetibili prima dell'esperimento. Viene eseguito nelle gabbie di casa nella stanza in cui sono tenuti gli animali.
   1. Chiudere tutti i cancelli e rimuovere la tramoggia con chow standard.
   2. Riempi una tramoggia fresca con lo spuntino appetibile (~ 50 g). Inserire accuratamente i cracker nella tramoggia per evitare il crollo. Posizionare la tramoggia sul supporto della gabbia sopra il microbilanciamento.
   3. Aprire i cancelli per 30 minuti in modo che il topo abbia accesso ad libitum allo spuntino e all'acqua. Documentare l'inizio della formazione nel sistema di monitoraggio.
      NOTA: Il ratto non deve avere accesso al chow standard durante il periodo di allenamento.
   4. Chiudere i cancelli dopo 30 minuti e documentare la fine dell'allenamento nel sistema di monitoraggio. Sostituire lo spuntino con un chow standard.
   5. Ripetere questa dose giornaliera fino a ottenere un'assunzione stabile di snack appetibili di base (ad esempio, 1,5-2,0 g/30 min) e 2) l'assunzione non differisce statisticamente tra i giorni di allenamento.
2. Esecuzione del test di ipofagia indotta dalla novità
   1. Preparare una gabbia vuota e appena pulita senza lettiera o arricchimento collegata al sistema automatizzato di monitoraggio dell'assunzione di cibo. Posiziona una tramoggia con una bottiglia di acqua del rubinetto e tramoggia con uno spuntino appetibile sui supporti della gabbia.
      NOTA: La nuova gabbia deve essere collocata nella stessa stanza in cui sono tenuti i ratti e deve essere condotta una formazione. Tieni i cancelli chiusi.
   2. Rimuovere il topo dalla gabbia di casa e posizionare nella nuova gabbia.
   3. Apri tutti i cancelli per 30 minuti. Documentare l'inizio dei test nel sistema di monitoraggio.
      NOTA: Durante i 30 minuti di accesso allo spuntino, le dimensioni dell'assunzione di snack e i parametri di microstruttura sottostanti (ad esempio, latenza al primo pasto) vengono registrati utilizzando il sistema automatizzato di monitoraggio dell'assunzione di cibo.
   4. Chiudere i cancelli dopo 30 minuti e documentare la fine dei test. Riposizionare il topo nella gabbia di casa.
      NOTA: La prova può essere ripetuta più volte con intervalli di allenamento (almeno 5 giorni) nel mezzo.

Risultati

Per testare la distribuzione dei dati, è stato utilizzato il test di Kolmogorov-Smirnov. I test T sono stati utilizzati quando i dati sono stati normalmente distribuiti e il test Mann-Whitney-U è stato utilizzato, in caso di allora. ANOVA uni-way seguito da Tukey post-hoc test è stato utilizzato per il confronto di più gruppi normalmente distribuito. ANOVA uni-way seguito dal test di confronto multiplo di Dunn è stato utilizzato in casi di distribuzione non normale. Le differenze tra i gruppi sono state considerate ...

Discussione

La preferenza per il saccarosio e le prove di ipofagia indotte dalla novità sono due tecniche consolidate per valutare l'anedonia nei ratti. La loro combinazione con il sistema automatizzato di monitoraggio dell'assunzione di cibo consente un'analisi più dettagliata nei ratti indisturbati e riduce la misurazione errata.

L'incidenza degli errori è ridotta da approcci diversi. In primo luogo, per affrontare l'errore che si verifica a causa dello sversamento, lo spazio tra la tramoggia e il ca...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Assembly LH Cage Mount - RAT-FOOD - includes Stainless cage mount, hopper, blocker, coupling	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BCMPRF01
Assembly LH Cage Mount unplugged - RAT - FOOD includes stainless steel cage mount, hopper, blocker, unplugged adapter, coupling	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BCMUPRF01
cage w/ 2 openings - RAT - costum modified cage - includes cage top and standard water bottle	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BCR02	single housing
Data collection Laptop Windows - Configured w/ BioDAQ Software	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BLT003
enrichment (plastic tubes, gnawing wood)			distributed by the animal facility
HoneyMaid Graham Cracker Crumbs	Nabisco, East Hanover, NJ, USA	ASIN: B01COWTA98	palatable snack for NIH test
low vibration polymer rack	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BRACKR
male Sprague Dawley rats	Envigo	Order Code: 002
Model #2210 32x Port BioDAQ Central Controller - includes cables, and calibration kit	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BCC32_03
Peripheral sensor Controller - includes cable	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BPSC01
SigmaStat 3.1	Systat Software, San Jose, CA, USA		statistical analysis
Stainless steel blocker	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BBLKR
standard rodent diet with 10 kcal% fat	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	D12450B
sucrose powder	Roth	4621.1	for SPT