Preferência por sacarose e testes de hipofagia induzidos por novidades em ratos usando um sistema automatizado de monitoramento da ingestão de alimentos

Resumo

Apresentado aqui é um protocolo para estudar o comportamento anedônico e depressão em ratos. Combina dois métodos comportamentais bem estabelecidos, a preferência por sacarose e testes de hipofagia induzidos por novidades, com um sistema automatizado de monitoramento de consumo alimentar e líquido, para investigar indiretamente o comportamento dos roedores usando parâmetros substitutos.

Resumo

A prevalência e incidência de transtornos depressivos estão aumentando em todo o mundo, afetando cerca de 322 milhões de indivíduos, ressaltando a necessidade de estudos comportamentais em modelos animais. Neste protocolo, para estudar o comportamento anedônico e anedônico semelhante à depressão em ratos, a preferência estabelecida por sacarose e os testes de hipofagia induzidos por novidades são combinados com um sistema automatizado de monitoramento de consumo alimentar e líquido. Antes dos testes, no paradigma de preferência da sacarose, os ratos machos são treinados por pelo menos 2 dias para consumir uma solução de sacarose, além da água da torneira. Durante o teste, os ratos são novamente expostos à solução de água e sacarose. O consumo é registrado a cada segundo pelo sistema automatizado. A razão entre sacarose e a ingestão total de água (razão de preferência de sacarose) é um parâmetro substituto para a anedonia. No teste de hipofagia induzida pela novidade, os ratos machos passam por um período de treinamento no qual são expostos a um lanche palatável. Durante o treinamento, os roedores mostram uma ingestão estável de lanches na linha de base. No dia do teste, os animais são transferidos de gaiolas domésticas para uma gaiola fresca e vazia representando um novo ambiente desconhecido com acesso ao conhecido lanche palatável. O sistema automatizado registra a ingestão total e sua microestrutura subjacente (por exemplo, latência à aproximação do lanche), fornecendo insights sobre comportamentos anedônicos e ansiosos. A combinação desses paradigmas com um sistema de medição automatizado fornece informações mais detalhadas, juntamente com maior precisão, reduzindo erros de medição. No entanto, os testes utilizam parâmetros substitutos e apenas retratam depressão e anedonia de forma indireta.

Introdução

Em média, 4,4% da população mundial é afetada pela depressão. Estes representam 322 milhões de pessoas em todo o mundo, um aumento de 18% em relação a dez anos atrás¹. Segundo estimativas da Organização Mundial da Saúde, a depressão será a segunda no ranking de Anos de Vida Ajustado por Incapacidade em 2020². Para enfrentar a crescente prevalência de transtornos afetivos e estabelecer novas estratégias intervencionistas, é necessário estudar melhor esse comportamento. Antes e além do exame em humanos, são necessários estudos em animais.

Vários modelos foram estabelecidos para estudar componentes do comportamento depressivo (ou seja, teste de natação forçado, teste de suspensão de cauda, teste de preferência de sacarose e hipofagia induzida por novidades)^3,4. O teste de preferência de sacarose (SPT) e a hipofagia induzida por novidades (NIH) podem detectar comportamento semelhante à depressão em animais. Esses testes em si não induzem um estado de depressão em roedores, mas retratam mudanças agudas de comportamento. Tanto o SPT quanto o NIH avaliam um traço característico da depressão conhecido como anedonia, que é a perda de interesse nas seguintes atividades: atividades gratificantes, atividades que antes eram desfrutadas pelo indivíduo⁵, e um aspecto do complexo fenômeno de processamento e resposta à recompensa⁶. Ambos os testes estudam a resposta a um estímulo gratificante na forma de alimentos palatáveis. A extensão do consumo serve como parâmetro substituto para a anedonia^7,8,9.

O valor dos testes que investigam a anedonia depende fortemente da determinação precisa do consumo resultante da medição precisa do peso da substância. Convencionalmente, esta medição é realizada manualmente uma vez antes e uma vez após o teste. No entanto, isso é propenso a medições errôneas por várias razões. Primeiro, os roedores tendem a acumular alimentos, o que significa que eles removem alimentos sem consumi-lo imediatamente e depois escondem-no em um lugar seguro. Assim, essa perda de alimentos pode ser incluída no cálculo do consumo total. Em segundo lugar, os ratos derramam alimentos e água, resultando em perda de peso sem o respectivo consumo. Em terceiro lugar, a perda não intencional de líquido ocorre devido ao manuseio das garrafas, inserindo-as e removendo-as das gaiolas.

Em uma abordagem para reduzir essas fontes de erro, combinamos os dois testes comuns avaliando a anedonia (SPT^3,4 e NIH⁹) com a medição da ingestão de alimentos e água utilizando um sistema automatizado de monitoramento de consumo alimentar e líquido. Este procedimento permite uma investigação precisa do consumo de substâncias palatáveis, bem como fornece informações sobre a experiência do prazer em ratos como uma característica de comportamento semelhante à depressão. Os erros acima mencionados associados à medição manual são reduzidos usando diferentes abordagens, que são ilustradas posteriormente com mais detalhes.

Para fornecer informações sobre microestrutura, o sistema automatizado de monitoramento de admissão utilizado neste protocolo¹⁰ pesa os alimentos (±0,01 g) a cada segundo. Assim, um peso estável é documentado como "não comer", e um peso instável como "comer". Um "bout" é definido como mudança no peso estável antes e depois de um evento. Uma refeição consiste em um ou mais bouts e seu tamanho mínimo em ratos foi definido como 0,01 g. Uma refeição é separada de outra refeição em ratos por 15 min (valor padronizado). Assim, a ingestão alimentar é considerada uma refeição quando as crises ocorreram dentro de 15 minutos e a mudança de peso é igual ou superior a 0,01 g. Os parâmetros da refeição avaliados neste protocolo incluem duração da refeição, tempo gasto em refeições, tamanho do ataque, duração do ataque, tempo gasto em lutas, latência para primeiro ataque, e número de ataques.

Protocolo

O cuidado com os animais e os procedimentos experimentais seguiram as diretrizes específicas de ética institucional e foram aprovados pela autoridade estadual para pesquisa animal.

1. Funcionamento do sistema de monitoramento automatizado

NOTA: Ao operar o sistema de monitoramento automatizado, é crucial documentar todas as ações na caixa de comentários incluídas no software imediatamente antes da ação. A descrição deve ser digitado na caixa de comentários e, pressionando Save,ela é salva com um ponto de tempo específico. Os prazos são significativos na análise dos dados, uma vez que o sistema registra continuamente, e o período de interesse deve ser indicado para análise.

1. Instalação, utilização e manutenção do sistema de monitoramento automatizado
   NOTA: Este protocolo usa ratos adultos machos Sprague Dawley pesando 250-300 g (~10 semanas de idade). Recomenda-se abrigar ratos em grupos durante o período de aclimatação. As condições ambientais devem ser controladas com os seguintes parâmetros: ciclo escuro/claro de 12 h/12h com luzes acesas às 6:00 A.M., umidade de 45%-65%, e temperatura de 21-23 °C, e acesso a ad libitum à água e dieta de roedores padrão. O manuseio diário permite que os animais se acostumem com os investigadores.
   1. Separe os ratos para que cada animal tenha uma gaiola individual. Certifique-se de que cada rato permaneça separado durante o protocolo.
   2. Encha as gaiolas de alojamento com roupa de cama regular com uma camada de 1 a 2 cm de espessura. Essa quantidade (reduzida) diminui a possibilidade de contaminação de microbalancens e funis com derramamento, reduzindo assim os erros de medição. Adicione tubos plásticos (por exemplo, um pedaço de 20 cm de comprimento de um cano de drenagem plástico com diâmetro de 8 cm) e roendo a madeira como enriquecimento, ao mesmo tempo em que omitia tecidos de papel para reduzir os erros de medição.
   3. Prepare as gaiolas para a medição automatizada de consumo de alimentos sólidos e líquidos, anexando duas montagens de gaiola fechadas com microequilíquilos a orifícios feitos sob medida na parte frontal das gaiolas. Coloque dois funis vazios nas montarias da gaiola, um para a comida e outro para a garrafa.
      NOTA: Os microbalances são conectados via cabos a um sistema de gravação conectado a um computador e o respectivo software é instalado no computador.
   4. Para começar a gravar, abra "Monitor" epressione" Iniciar ", em seguida, escolha um lugar para salvar os dados.
   5. Utilizando a função de calibração (pressione "Calibrar") do sistema automatizado de monitoramento de admissão, calibrar cada equilíbrio removendo os funis e colocando dois pesos medidos diferentes nas montagens da gaiola com saldos. Faça isso em intervalos de tempo regulares (semanalmente é recomendado).
   6. Encha um funil completamente com chow (~100 g) e remova pedaços de comida e crumbles que são muito pequenos em tamanho. Encha a água na garrafa (~100 mL) e coloque-a no outro funil.
   7. Documente a posição de alimentos e água (por exemplo, equilíbrio 1: alimento animal 1, equilíbrio 2: animal de água 1).
   8. Coloque o rato na gaiola e abra todos os portões das montarias da gaiola para que ele possa comer e beber ad libitum.
      NOTA: Para uma medição precisa, é necessário manter os equilíbrios e os funis diariamente, limpando suavemente com uma escova de derramamento e removendo pequenas migalhas de alimentos do recipiente de alimentos. Isso reduzirá muito a medição errônea. Feche todos os portões durante a manutenção diária.
2. Acessando dados após os experimentos
   1. Pesquise na caixa de comentários os pontos de tempo de início e fim de um período (por exemplo, treinamento, teste) que precisa ser analisado.
   2. Clique em "Exibir dados" no software para abrir o Data Viewer.
   3. Insira os pontos de tempo nas caixas abaixo "Begin time" e "End time". Pressione a praça no canto superior esquerdo indicando o saldo que registrou a informação.
   4. Clique em "PSC Totals" para acessar os dados de microestrutura. Pressione o botão "Export PSC Table" para exportar os dados.
      NOTA: Para comparar a microestrutura de animais individuais (por exemplo, não estressados versus estressados) utilizando monitoramento automatizado, animais individuais podem ser selecionados no"Visualizador de Dados" pressionando o quadrado apropriado no canto superior esquerdo. O PSC Totals mostra apenas a microestrutura para o animal selecionado. A análise estatística não pode ser realizada com o sistema. Os dados precisam ser extraídos em um programa de planilha/software de análise.

2. Implementação do teste de preferência de sacarose

1. Conduzindo o período de treinamento
   NOTA: Antes do teste, os animais devem estar acostumados com a disponibilidade de duas garrafas para líquidos em funis através dos portões, enquanto os alimentos devem ser fornecidos a partir dos topos das gaiolas (a configuração é mostrada na Figura 1). Esse período de treinamento deve durar pelo menos 2 dias. É realizado nas gaiolas de casa na sala onde os animais são mantidos.
   1. Feche todos os portões. Remova a garrafa de água e o recipiente de alimentos dos microbalanceamentos.
   2. Coloque alimentos pré-pesados (~50 g) no topo da gaiola e documente seu peso diariamente usando um equilíbrio regular para avaliar o consumo diário de alimentos. Refil, se necessário.
   3. Limpe uma garrafa com água limpa e reabaste nas encha com cerca de 100 mL de água. Coloque de volta no funil.
   4. Encha uma segunda garrafa limpa com 100 mL de solução de sacarose recém-feita 1%. Coloque no funil.
      NOTA: Marque as garrafas com cuidado e documente suas localizações (por exemplo, equilíbrio 1: animal de água 1, equilíbrio 2: solução de sacarose animal 1).
   5. Abra todos os portões. Documente o início do treinamento no sistema de monitoramento. Deixe os portões abertos por 24 horas, resultando no acesso ad libitum a ambas as garrafas. Depois das 24h, feche os portões e documente o fim do treinamento. Os dados do intervalo de 24 horas podem ser avaliados usando o sistema de monitoramento automatizado inserindo o "tempo de início" e " tempofinal". Os procedimentos são os mesmos quando um intervalo de teste de 1 h é avaliado.
   6. Limpe e rechee as garrafas a cada 24 horas. Prepare a solução fresca de 1% de sacarose diariamente. Troque a posição da garrafa de solução de água e sacarose diariamente para evitar efeitos de habitação.
      NOTA: Realize o treinamento em todos os animais pelo menos 48h até que as razões de preferência atinjam ~1. A razão de preferência de sacarose é avaliada logo após o treinamento usando o "data viewer". É calculado como a razão da ingestão de sacarose para a ingestão global (água mais entrada de sacarose).
   7. 24 h antes do teste, remova a garrafa com a solução de sacarose para que o rato tenha acesso apenas à comida e água padrão.
   8. Prepare uma garrafa fresca cheia de água da torneira e uma cheia com uma solução de sacarose de 1%, ambas com ~100 mL.
   9. Antes dos testes, feche todos os portões.
   10. Retire a garrafa cheia de água da torneira do funil e coloque as duas garrafas frescas, uma cheia de água da torneira e outra cheia com uma solução de sacarose de 1%, no funil.
   11. Abra todos os portões, documente o início do teste no sistema de monitoramento. Deixe os portões abertos por 60 minutos. Feche os portões após 60 min e documente o fim do teste.
   12. Avalie os dados (por exemplo, a razão de entrada de fluidos/sacarose/total).
       NOTA: O teste pode ser repetido várias vezes com intervalos de treinamento (pelo menos 2 dias) no meio.

3. Implementação do teste de hipofagia induzida pela novidade

1. Conduzindo o período de treinamento
   NOTA: Antes do teste, recomenda-se um período diário de treinamento de 30 minutos de 5 dias (a configuração é mostrada na Figura 2). O objetivo é alcançar uma linha de base estável de ingestão de lanche palatável antes do experimento. É realizado nas gaiolas de casa na sala onde os animais são mantidos.
   1. Feche todos os portões e remova o funil com comida padrão.
   2. Encha um funil fresco com o lanche palatável (~50 g). Insira os biscoitos cuidadosamente no funil para evitar desmoronar. Coloque o funil no suporte da gaiola em cima do microequilípmo.
   3. Abra os portões por 30 minutos para que o rato tenha acesso a ad libitum ao lanche e água. Documente o início do treinamento no sistema de monitoramento.
      NOTA: O rato não deve ter acesso à comida padrão durante o período de treinamento.
   4. Feche os portões após 30 min e documente o fim do treinamento no sistema de monitoramento. Substitua o lanche por comida padrão.
   5. Repita isso diariamente até que uma ingestão de lanche palatável de linha de base estável seja alcançada (por exemplo, 1,5-2,0 g/30 min) e 2) a ingestão não difere estatisticamente entre os dias de treinamento.
2. Realizando o teste de hipofagia induzida pela novidade
   1. Prepare uma gaiola vazia e recém-limpa sem roupa de cama ou enriquecimento ligado ao sistema automatizado de monitoramento da ingestão de alimentos. Coloque um funil com uma garrafa de água da torneira e funil com um lanche palatável nas montagens da gaiola.
      NOTA: A gaiola nova deve ser colocada na mesma sala onde os ratos são mantidos e o treinamento realizado. Mantenha os portões fechados.
   2. Retire o rato da gaiola e coloque na gaiola da novela.
   3. Abra todos os portões por 30 minutos. Documente o início dos testes no sistema de monitoramento.
      NOTA: Durante os 30 minutos de acesso ao lanche, o tamanho da ingestão de lanches e os parâmetros de microestrutura subjacente (por exemplo, latência à primeira refeição) são registrados utilizando o sistema automatizado de monitoramento da ingestão alimentar.
   4. Feche os portões após 30 minutos e documente o fim dos testes. Coloque o rato de volta na jaula.
      NOTA: O teste pode ser repetido várias vezes com intervalos de treinamento (pelo menos 5 dias) no meio.

Resultados

Para testar a distribuição de dados, foi utilizado o teste Kolmogorov-Smirnov. Os testes T foram utilizados quando os dados foram normalmente distribuídos e o teste Mann-Whitney-U foi utilizado, se não. Anova unidirecional seguida de teste pós-hoc tukey foi usado para comparação de vários grupos normalmente distribuída. ANOVA unidirecional, seguida do teste de comparação múltipla de Dunn, foi utilizado em casos de distribuição não normal. As diferenças entre os grupos foram consideradas significativas qua...

Discussão

A preferência por sacarose e os testes de hipofagia induzidos por novidades são duas técnicas estabelecidas para avaliar a anedonia em ratos. Sua combinação com o sistema automatizado de monitoramento da ingestão de alimentos permite uma análise mais detalhada em ratos não perturbados e reduz a medição errônea.

A incidência de erros é reduzida por diferentes abordagens. Primeiro, para resolver o erro ocorrido devido ao derramamento, a lacuna entre o funil de alimentos e o portão ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Assembly LH Cage Mount - RAT-FOOD - includes Stainless cage mount, hopper, blocker, coupling	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BCMPRF01
Assembly LH Cage Mount unplugged - RAT - FOOD includes stainless steel cage mount, hopper, blocker, unplugged adapter, coupling	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BCMUPRF01
cage w/ 2 openings - RAT - costum modified cage - includes cage top and standard water bottle	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BCR02	single housing
Data collection Laptop Windows - Configured w/ BioDAQ Software	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BLT003
enrichment (plastic tubes, gnawing wood)			distributed by the animal facility
HoneyMaid Graham Cracker Crumbs	Nabisco, East Hanover, NJ, USA	ASIN: B01COWTA98	palatable snack for NIH test
low vibration polymer rack	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BRACKR
male Sprague Dawley rats	Envigo	Order Code: 002
Model #2210 32x Port BioDAQ Central Controller - includes cables, and calibration kit	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BCC32_03
Peripheral sensor Controller - includes cable	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BPSC01
SigmaStat 3.1	Systat Software, San Jose, CA, USA		statistical analysis
Stainless steel blocker	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	BBLKR
standard rodent diet with 10 kcal% fat	Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA	D12450B
sucrose powder	Roth	4621.1	for SPT