植物组织细胞壁中阿拉比诺格拉坦蛋白和皮克廷的荧光免疫化

摘要

该协议详细描述了用于阿拉伯甘草蛋白和果胶免疫的植物材料是如何固定的，嵌入亲水丙烯酸树脂中，在玻璃滑梯上分节并安装。我们显示细胞壁相关的表位将被检测到与特定的抗体。

摘要

植物发育需要根据内部和外部的刺激不断调整细胞壁的组成和结构。细胞壁由纤维素和非纤维素多糖以及蛋白质、酚类化合物和水组成。90%的细胞壁由多糖（例如皮茨坦）和阿拉伯甘草蛋白（AGPs）组成。植物组织学部分特定甘草表位的荧光免疫化仍然是揭示墙体多糖网络、结构和组件改造的关键工具。

在这里，我们报告一个优化的荧光免疫化程序，以检测来自AGP和植物组织中的皮瓣的甘油表位。与植物样品的LR-White嵌入一起使用甲醛/谷胱甘肽固定，从而更好地保存组织结构和组成。用超微切除术获得的嵌入式样品的细小部分用于特定抗体的免疫化。该技术提供高分辨率、高特异性以及检测同一样本中多个甘油表位的机会。该技术允许甘油的亚细胞定位，并检测其在细胞壁中的积累水平。它还允许在开发过程中确定AGP和果胶分布的空间-时间模式。使用此工具最终可能指导研究方向，并将甘草与植物中的特定功能联系起来。此外，获得的信息可以补充生化和基因表达研究。

引言

植物细胞壁是由多糖和糖蛋白组成的复杂结构。细胞壁是极具活力的结构，其结构、组织和组成因细胞类型、定位、发育阶段、外部和内部刺激¹而异。阿拉比诺格拉坦蛋白（AGPs）和皮丁是植物细胞壁的重要组成部分。AGP是高糖化蛋白，果胶是同源多糖，其组成、数量和结构在不同的植物发育阶段^2、3、4差异很大。AGP和果胶研究表明，他们参与了几个植物过程，如编程细胞死亡，对副生压力的反应，性植物繁殖，等等^5。这些研究大多从免疫化研究获得的信息开始。

鉴于其复杂性，研究细胞壁需要许多不同的工具。使用单克隆抗体 （mAbs） 检测甘草表位是解决聚糖和糖蛋白沿此结构分布的宝贵方法。有大量的mAb可用于检测甘油表位和每个mAb的特异性正在不断改善，以及^6。此处描述的技术适用于所有植物物种，是指导未来研究方向的完美工具，可能涉及更昂贵和复杂的技术。

在这项技术中，特定的抗体在化学上与荧光染料结合，如FITC（荧光异硫氰酸酯）、TRITC（四甲基多胺-5-（和6）异硫氰酸酯）或几种亚历克萨氟酸盐染料。免疫荧光提供了几个优点，允许在荧光显微镜下直接观察到的甘精的清晰和快速的亚细胞定位。它是高度具体和敏感的，因为样品的制备可以有效地保护抗原的自然结构，即使存在于较低的量。它允许检测多个抗原在同一样本中，最重要的是，提供高质量和视觉上美丽的结果。尽管荧光免疫研究提供了巨大的力量，但它们往往被认为难以执行和实施，很可能是因为缺乏允许可视化程序不同步骤的详细方案。在这里，我们提供了一些简单的指南，如何执行这项技术，以及如何获得高质量的图像。

对于此处提交的协议，样品必须首先使用最合适的固定剂进行固定和嵌入。虽然被认为是一种耗时且相对繁琐的技术，但植物样本的正确固定和嵌入是确保免疫化检测成功的关键。为此，最常见的是使用交叉链接固定剂（如醛）进行化学固定。交叉连接固定剂在组织分子之间建立化学键，稳定和硬化样品。甲醛和谷胱甘肽是交叉连接固定剂，有时两种固定剂的混合物使用^7。甲醛为组织提供了很好的结构保存和长时间的保存，产生小组织缩水，并与免疫污染相容。谷胱甘肽是一种更强、更稳定的固定剂，通常与甲醛结合使用。谷胱甘肽的使用有一些缺点，必须考虑到，因为它引入一些自由醛组到固定组织，这可能会产生一些不具体的标签。此外，蛋白质和其他分子之间的交叉连接偶尔可能会使一些目标表位无法接触到抗体。为了避免这种情况，必须仔细定义固定的数量和持续时间。

固定后，样品嵌入适当的树脂中，在获得部分之前变硬。伦敦树脂（LR-White）丙烯酸树脂是免疫化研究的首选树脂。与其他树脂不同，LR-White是亲水的，允许抗体达到其抗原，无需任何治疗，以促进它。LR-White 还具有提供低自动荧光的优势，允许在免疫荧光成像过程中降低背景噪音。

有许多染色技术可用于检测细胞壁的不同成分，如阿尔西亚蓝色染色，甲丁蓝色染色或周期性酸-希夫（PAS）染色。这些都没有提供免疫分析^{的力量8。}这种方法在糖的检测方面具有更大的特异性，提供了关于细胞壁组成和结构的更广泛的信息。

研究方案

1. 样品准备:固定、脱水和LR-白色嵌入

1. 固定和脱水
   注:固定过程对于保存样本至关重要:通过交叉链接分子，细胞代谢停止，确保细胞完整性，防止分子扩散。固定剂和使用的浓度必须调整到该目的，使抗原充分暴露与抗体相互作用。以下协议结合了准甲醛的轻度固定能力，以及谷胱甘肽的更强效果。其比例被优化为AGP和细胞壁组件，但它适用于其他蛋白质和细胞结构。随后的脱水过程将为 LR-White 嵌入准备样品。本实验使用了来自几个植物物种的植物组织。从田间生长的树木中采集了 Quercus子 样本。保拉·鲁德尔（英国伦敦邱花园）与我们亲切地分享了 特里图里亚潜水 器样品。
   1. 将所有阿拉比多普西斯植物直接播种在土壤上，在相对湿度为 60% 的室内生长设施中生长，在 21 °C 下日/夜循环 16 小时光，在 18 °C 时以 8 小时黑暗生长。 选择要分析的植物组织，并修剪样本不超过 16 mm² 的大小。
   2. 立即将样品转移到以前充满足够冷固定溶液的玻璃瓶（2%甲醛（w/v）、2.5%麸质醛（w/v）、25 mM PIPES pH 7 和 0.001% Tween-20（v/v）），以完全淹没样品（图 1A）。
      警告:甲醛和谷胱甘肽都是通过吸入和接触可能有害的固定剂。在烟雾罩上执行固定步骤，并穿足够的防护服和亚硝酸盐手套。从这一步骤开始，所有解决方案，包括酒精系列，直到70%，应存储，供专门人员以后净化。
   3. 收集完所有样品后，刷新固定剂。
   4. 将小瓶转移到真空室，慢慢吸尘。到达-60 kPa后，浮动材料将开始沉入小瓶底部（图1B）。
   5. 在室温下保持不超过 -80 kPa 的真空下 2 小时。
   6. 慢慢释放真空，密封玻璃瓶，在4°C处过夜。
   7. 丢弃在夜间固定期间未下沉的任何样品。用 25 mM PBS pH 7 清洗剩余样品 10 分钟，然后在 25 mM PIPES 缓冲 pH 7.2 中清洗 20 分钟。
   8. 乙醇系列中的样品脱水（25%、35%、50%、70%、80%、90%和3倍100%乙醇），每次20分钟。立即将脱水样品转移到标记的玻璃瓶中嵌入（图 1C）。
      注:脱水过程可在 70% 乙醇步骤中暂停。
2. LR-白色树脂嵌入
   注:LR-White 是一种低粘度无疏水丙烯酸树脂，非常适合穿透具有许多厚壁层的组织。LR-White 还有几个硬度等级，适合切割大多数植物样品。请确保用过的树脂已经与混合在一起的适当催化剂一起供应，或按照供应商的说明准备树脂。以下嵌入过程很慢，但结果在很大程度上证明了手段的合理性。
   1. 通过在乙醇中与 LR-White 树脂一起孵育一系列新月树脂浓度（1:3、2:3、1:1、3:2、3:1、1:0），在每步 4 °C 下孵育 24 小时。
      警告:LR-白树脂是一种低毒性的丙烯酸树脂:然而，它可能是通过接触和吸入对皮肤的刺激。强烈建议在通风良好的区域或烟雾罩下工作，并配有适当的防护服和氮化物手套。
   2. 刷新 LR-白色树脂，并在 4 °C 下再孵育 12 小时。
   3. 准备适当尺寸嵌入明胶胶囊（大小 1 （0.5 mL） 的样品高达 3 毫米， 2 x 0.37 mL 的样品高达 5 毫米或 3 x 0.3 mL 的样品高达 8 毫米， 和纸标签 （图 1D）.
      注意:选择胶囊大小比样品稍大，以便标本可以完全封闭在树脂中。此外，请记住用铅笔标记标签，因为笔或印刷油墨会污染树脂，破坏样品。
   4. 将一滴新鲜的LR-白色树脂涂抹在每粒胶囊的底部。
   5. 将样品放在每个明胶胶囊中，用新鲜树脂填充至最大容量。放置胶囊帽，轻轻按压形成密封密封（图1E）。
   6. 在 58 °C 下将树脂聚合 24 至 48 小时，或直到完全硬化。
   7. 在室温下存储样品。
      注:聚合后LR-白色树脂是惰性的。

2. 幻灯片准备

注意:玻璃滑梯必须清洁，不含任何灰尘、油脂或任何其他污染物。甚至新的幻灯片必须清洗，因为一些供应商使用油和洗涤剂，以防止幻灯片粘在一起。任何油脂或洗涤剂都会干扰滑梯的节粘附，即使用聚 L-赖氨酸处理也是如此。绒毛和灰尘会影响标本的观测结果，并很可能破坏实验。带反应井的特氟隆涂层滑梯非常适合此任务。它们价格实惠，可重复使用，并大大减少了所需的抗体溶液量。通过适当的清洁，优质的荧光免疫接种可以以非常实惠的成本进行。

1. 滑动洗涤
   1. 将滑梯放在染色架中，并盖上清洁液（0.1% SDS（w/v）、1% 醋酸（v/v）、10% 乙醇（v/v）。
   2. 保持轻微的搅拌20分钟。
   3. 将染色架转移到有轻微搅拌的 ddH₂O 浴池 10 分钟。重复4次。
   4. 小心地将机架排干，然后短暂浸入 100% 乙醇中，让滑梯在无尘环境中干燥。
   5. 存储直到使用。
2. 聚-L-赖氨酸涂层（可选）
   注意:小部分通常粘得很好，以清洁玻璃滑梯。此步骤仅建议用于较大的部分（+2 mm^2）。较大的部分倾向于折叠和皱纹，不可取。然而，如果需要，使用反应幻灯片与更大的孔。按上述方式进行清洁，并按以下方式进行。
   1. 将干净的幻灯片放在方形的培养皿中。派珀特 0.001% 聚 L-赖氨酸溶液 （w/v） 覆盖滑梯的孔，无需溢出。
   2. 让幻灯片在 40 °C 下在封闭的 Petri 菜肴中干燥过夜。
      注:涂层滑梯已准备就绪，可在室温下存放在无尘环境中数月。

3. 样品修剪和剖面

1. 样品修剪
   1. 用锋利的剃须刀刀片，在立体显微镜下修剪 LR-White 方块，形成金字塔形结构，其中顶点垂直于样品感兴趣的区域（补充图 1A）。
      注意:超微原子标本持有人是固定块的绝佳工具。如果设备没有通用标本架，请使用最适合圆形方块的标本支架。
   2. 修剪金字塔结构，去除垂直于金字塔主轴的过量树脂的细片。
   3. 继续，直到样品到达形成切割表面。在切割表面内，目标样品最好以梯形形状封闭。
      注意:树脂块可以进一步修剪在狭缝角度，以减少部分表面积与锋利的刀片（图1F）。
2. 半薄剖腹产
   注:将使用带玻璃刀的微切除术。抗体与表位结合的能力将制约免疫带反应的成功。LR-白色树脂的亲水性质将允许抗体与样品部分的良好接触。更薄的部分将呈现较淡的 Calcofluor 着色，将用于帮助定位部分并协助成像过程。适用于以后可能应用的其他污渍也是如此。此外，厚度过高也会影响图像采集质量。根据组织特征，可以在 200 到 700 nm 之间找到适合部分厚度的折衷方案。将方块紧紧地安装在超微切除的标本架上。
   1. 通过超微切除术，制作厚度在 200 到 700 nm （图 1G）之间的部分。
   2. 通过将某些部分转移到玻璃滑梯上的 ddH₂O 落点来检查部分区域。将幻灯片放在 50 °C 热板上，直到水蒸发。污渍将 1% 的托卢丁蓝 O （w/v） 放入 1% 的玻酸溶液 （w/v） 中， 在 30 s 的部分。在显微镜下冲洗和观察。
   3. 找到所需的结构后，将一到两个部分转移到之前放置在清洁反应滑梯每个井上的 ddH₂O 的每一滴。
   4. 将每个幻灯片放在一个封闭的干净的 10 厘米方形培养皿中，让它在 50 °C 处干燥。
   5. 将幻灯片存储在一个干净的存档框中，直到使用。

4. 免疫化

注:荧光免疫程序依赖于连续使用两种抗体。原发性抗体针对特定目标抗原提出。二次抗体是专门针对原发性抗体而提出的，对于荧光技术，它与荧光（FITC在此特定协议中）结合在一起。原发性抗体将用于检测样品中的目标抗原，二次抗体将用于标记洗掉原发性抗体过量后与样品相连的主要抗体的位置。控制是此检测的重要组成部分，必须始终执行，以确保观测的准确性。幻灯片上的一口井应保留用于负控制，其中将跳过原发性抗体处理，因此在实验结束时不应观察到任何信号。实验中必须包括积极的控制，用标签已经为人所知和确定的抗体处理好一个抗体。阳性控制用于确认二次抗体标签的有效性和反应条件，而负控制测试二次抗体特异性。

1. 准备一个孵化室，将一些阻尼纸巾放在移液器提示盒的底部，然后用锡箔包裹它（补充图1B-1E）。将幻灯片放在孵化室中。
2. 每 8 毫米井的阻塞溶液滴 50μL（1 M PBS 中 5% 脱脂干牛奶（w/v），孵育 10 分钟。取出阻塞溶液，用 PBS 两次清洗所有油井 10 分钟。
3. 在阻塞溶液中准备主要抗体溶液（见 补充表1）、1:5（v/v）抗体:估计每8毫米井约40μL。
   注:抗体的浓度必须根据制造商的协议进行调整。
4. 用 ddH₂O 进行最后一次洗涤 5 分钟，切勿让油井完全干涸。
5. 派珀特反应井的主要抗体溶液。控制井的移液器阻塞解决方案。
6. 关闭孵化室，让在室温下站立2小时，然后在4°C过夜。 准备次要抗体溶液，1%在阻塞溶液（v/v）约40μL每口井。用锡箔盖住它。
7. 用PBS清洗所有油井两次10分钟，然后用ddH₂O再洗10分钟。
8. 派珀特是所有油井的次要抗体溶液。从现在起，保护滑梯免受光线照射。
9. 在室温下在黑暗中孵育3-4小时。
10. 用 Pbs 洗两次所有井 10 分钟， 然后用 ddh₂O 再洗 10 分钟。
11. 将一滴钙氟（1:10，000（w/v）荧光灯亮度28（PBS）涂抹到每口井上。无需清洗，将一滴安装介质（见材料表）涂抹到每口井上，并放置一个盖夹（图1H）。
12. 使用荧光显微镜观察，配备 10 倍/0.45、20 倍/0.75、40 倍/0.95 和 100 倍/1.40 透镜，使用紫外线（用于钙氟污渍）和 FITC 过滤器，分别检测细胞壁和免疫化（图 1I）。使用以下波长:紫外线激发/发射 （nm） 358/461 和 FITC 485/530。
13. 为了更好地可视化结果，将两个图像与 ImageJ 或类似图像重叠。

结果

在成功的实验中，次要抗体将以一致的方式以亮绿色具体定位特定表位的位置，从而在细胞、组织或器官的某一发育阶段对细胞壁组成进行定性。例如，LM6抗体对1，5-arabinan具有很高的亲和力，这种化合物具有I型拉诺拉图罗南，可以发现大量标记正在发育的 Quercus子 体的细胞壁（图2A），从而可以得出结论，这种类型的果胶是丰富的，是主要细胞壁成分的一部分。JIM5?...

讨论

这里描述的植物荧光免疫化方法虽然无缝简单，但依赖于几个小步骤的成功。第一个是样品准备和固定。在第一步中，甲醛和谷胱甘肽的混合物用于交叉连接大多数细胞组件。溶液中的甲醛提供温和和可逆的固定，而谷胱甘肽提供更强的永久联系:两个固定剂之间的平衡提供了适当的交叉链接量，允许暴露的表位与主要抗体¹⁰反应。要使固定解决方案正常工作，样本必须很小。直?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
25% (w/v) Gluteraldehyde	Agar Scientific	AGR1010	aq. Solution, methanol free
8 wells Glass reaction slides	Marinfeld	MARI1216750	other brands may be used
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produced in GOAT	Sigma-Aldrich	F6258
cover slips, 24 mm x 50 mm	Marinfeld	MARI0100222	The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used
ddH2O	na	na
Absolute ethanol	na	na
Fluorescent brightner 28	Sigma-Aldrich	F-6259
Gelatin capsules	Agar scientific	AGG29211	The capsule size should fit the size of the sample.
Glass vials	na	na	Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be cleaned with 96% ethanol after use to remove LR-White residue and reused.
LR-white medium grade, embdeding resin	Agar Scientific	AGR1281	LR-White comes in several forms; the medium grade provides an adequate cutting support for most tissues, while for harder tissues a harder grade of LR-white may be recommendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please follow the instructions of the supplier to prepare the resin.
Non fat dry milk	Nestlé	na	any non fat dry milk is adequate
Oven	na	na	generic laboratory oven
Petri dish, 10 cm x 10 cm square	na	na
PIPES	Sigma Aldrich	P1851
Rat generated Monoclonal Anti-Body	Plant probes	na	Several antibodies that recognize cell wall components are available at both the Complex Carbohydrate research center (CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of some commonly used MABS and where they can be purchased is presented in Supplemental Table 1
Razor blades	na	na	regular razor blades
SDS	Sigma-Aldrich	L6026
Toluidine Blue-O	Agar Scientific	AGR1727
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Ultramicrotome	Leica Microsystems	UC7
Upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters	Leica Mycrosistems	DMLb
Vacuum chamber	na	na
Vacuum pump	na	na
Vectashield	vecta Labs	T-1000	Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An anti-fade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.)