Bitki Dokularının Hücre Duvarındaki Arabinogalactan Protein ve Pektinlerin Floresan İmmünolokalizasyonu

Özet

Bu protokol, Arabinogalactan proteinlerinin ve pektinlerinin immünolokalizasyonu için bitki materyalinin hidrofilik akrilik reçineye gömülü, bölümlenmiş ve cam slaytlara monte edilmiş nasıl sabitlendiğini ayrıntılı olarak açıklar. Hücre duvarı ile ilgili epitopların spesifik antikorlarla tespit edileceğini gösteriyoruz.

Özet

Bitki gelişimi, hem iç hem de dış uyaranlara yanıt olarak hücre duvarı bileşiminin ve yapısının sürekli olarak ayarlanmasını içerir. Hücre duvarları proteinler, fenolik bileşikler ve su ile birlikte selüloz ve selülozik olmayan polisakkaritlerden oluşur. Hücre duvarının %90'ı polisakkaritler (örneğin pektinler) ve arabinogalactan proteinlerinden (AGP) oluşur. Bitki histolojik bölümlerindeki spesifik glikan epitoplarının floresan immünolocalizasyonu, duvar polisakkarit ağlarının, yapısının ve bileşenlerinin yeniden şekillendirilmesini ortaya çıkarmak için önemli bir araç olmaya devam etmektedir.

Burada, bitki dokularındaki AGP'lerden ve pektinlerden glikan epitopları tespit etmek için optimize edilmiş bir floresan immünolocalizasyon prosedürü rapor ediyoruz. Paraformaldehit/glutaraldehit fiksasyonu, bitki örneklerinin LR-White gömülmesi ile birlikte kullanıldı ve doku yapısının ve bileşiminin daha iyi korunmasını sağladı. Ultra mikrotom ile elde edilen gömülü örneklerin ince bölümleri spesifik antikorlarla immünokokalizasyon için kullanılmıştır. Bu teknik büyük çözünürlük, yüksek özgüllük ve aynı örnekte birden fazla glikan epitop tespit etme şansı sunar. Bu teknik glikanların hücre altı lokalizasyonunu sağlar ve hücre duvarındaki birikim düzeylerini algılar. Ayrıca gelişimsel süreçler sırasında AGP ve pektin dağılımının mekansal-zamansal paternlerinin belirlenmesine izin sağlar. Bu aracın kullanımı sonuçta araştırma yönlerine rehberlik edebilir ve glikanları bitkilerdeki belirli işlevlere bağlayabilir. Ayrıca elde edilen bilgiler biyokimyasal ve gen ekspresyon çalışmalarını tamamlayabilir.

Giriş

Bitki hücre duvarları polisakkaritler ve glikoproteinlerden oluşan karmaşık yapılardır. Hücre duvarları, mimarisi, organizasyonu ve bileşimi hücre tipine, lokalizasyona, gelişim aşamasına, dış ve iç uyaranlara göre değişen son derece dinamik yapılardır^1. Arabinogalactan proteinleri (AGP'ler) ve pektinler bitki hücre duvarının önemli bileşenleridir. AGP'ler oldukça glikosillenmiş proteinlerdir ve pektinler, farklı bitki gelişim aşamalarında bileşimi, miktarı ve yapısı büyük ölçüde değişen homogalacturonan polisakkaritlerdir^2,3,4. AGP'ler ve pektin çalışmaları, programlanmış hücre ölümü,biyotik streslere yanıt, cinsel bitki üremesi gibi çeşitli bitki süreçlerinde rollerini ortaya koydu⁵. Bu çalışmaların çoğu immünolokalizasyon çalışmalarından elde edilen bilgilerle başlamıştır.

Karmaşıklığı göz önüne alındığında, hücre duvarlarının incelenmesi birçok farklı araç gerektirir. Glikan epitoplarının monoklonal antikorlar (mAbs) kullanılarak saptanması, bu yapı boyunca polisakkarit ve glikoprotein dağılımını çözmek için değerli bir yaklaşımdır. Glikan epitoplarını tespit etmek için geniş bir mAb koleksiyonu vardır ve her mAb'nin özgüllüğü sürekli olarak iyileştirilmektedir⁶. Burada açıklanan teknik tüm bitki türleri için geçerlidir ve daha pahalı ve karmaşık teknikler içerebilecek gelecekteki araştırma yönlerine rehberlik etmek için mükemmel bir araçtır.

Bu teknikte spesifik antikorlar FITC (floresan izotiyosiyanat), TRITC (tetrametrinhodamin-5-(ve 6)-izotiyosiyanat) veya birkaç Alexa Fluor boyası gibi floresan boyalara kimyasal olarak konjuge edilir. İmmünoresans, floresan mikroskobu altında doğrudan gözlemlenebilen glikanların net ve hızlı bir hücre altı lokalizasyonuna izin veren çeşitli avantajlar sunar. Son derece spesifik ve hassastır, çünkü numunenin hazırlanması, daha düşük miktarlarda mevcut olsa bile antijenin doğal yapısını etkili bir şekilde koruyabilir. Aynı örnekte ve en önemlisi birden fazla antijenin tespit edilmesine izin verir, yüksek kaliteli ve görsel olarak güzel sonuçlar sunar. Floresan immünolocalizasyon çalışmalarının sunduğu büyük güce rağmen, genellikle prosedürün farklı adımlarının görselleştirilmesine izin eden ayrıntılı protokollerin olmaması nedeniyle yapılması ve uygulanması zor olarak kabul edilirler. Burada, bu tekniğin nasıl gerçekleştirilacağı ve yüksek kaliteli görüntülerin nasıl eldeılacağı hakkında bazı basit yönergeler sunuyoruz.

Burada sunulan protokol için, örneklerin öncelikle en uygun sabitleyici kullanılarak sabitlenilmesi ve gömülmesi gerekir. Zaman alıcı ve nispeten sıkıcı bir teknik olarak düşünülse de, bitki örneğinin uygun şekilde sabitlenmesi ve gömülmesi, başarılı bir immünolocalizasyon tahlilini sağlamanın anahtarıdır. Bu amaçla, en olağan olanı aldehitler gibi çapraz bağlama fiksatifleri kullanılarak kimyasal fiksasyondur. Çapraz bağlama fiksatifleri, doku molekülleri arasında kimyasal bağlar kurarak numuneyi stabilize eder ve sertleşir. Formaldehit ve glutaraldehit, fiksatifleri çapraz bağlar ve bazen her iki fiksatifin bir karışımı kullanılır⁷. Formaldehit, dokuların ve uzun sürelerin büyük yapısal korunmasını, küçük doku geri çekilmeleri üretilmesini ve immünostaining ile uyumlu olmasını sunar. Glutaraldehit, genellikle formaldehit ile birlikte kullanılan daha güçlü ve kararlı bir fiksatiftir. Glutaraldehit kullanımı, bazı serbest aldehit gruplarını sabit dokuya soktuğu için dikkate alınması gereken bazı dezavantajlara sahiptir, bu da bazı belirsiz etiketlemeler oluşturabilir. Ayrıca proteinler ve diğer moleküller arasındaki çapraz bağlantı bazen bazı hedef epitopları antikorlar için erişilemez hale getirebilir. Bunu önlemek için, fiksasyonun miktarı ve süresi dikkatlice tanımlanmalıdır.

Sabitlemeden sonra, numuneler bölümleri elde etmeden önce sertleştirmek için uygun reçineye gömülür. Londra Reçinesi (LR-White) akrilik reçine, immünolokalizasyon çalışmaları için tercih edilmesi olan reçinedir. Diğer reçinelerin aksine, LR-White hidrofiliktir ve antikorların antijenlerine ulaşmasını sağlar ve bunu kolaylaştırmak için herhangi bir tedaviye gerek yoktur. LR-White ayrıca düşük otomatik floresan sunma avantajına sahiptir ve immünoresans görüntülemesi sırasında arka plan gürültüsünde bir azalma sağlar.

Alcian mavisi boyama, toluidin mavisi boyama veya Periyodik asit-Schiff (PAS) lekeleme gibi hücre duvarının farklı bileşenlerini tespit etmek için birçok boyama tekniği mevcuttur. Bunların hiçbiri immünolokalizasyon analizlerinin gücünü sunmaz⁸. Bu yaklaşım glikanların tespitinde daha fazla özgüllük sağlar ve hücre duvarı bileşimi ve yapısı hakkında daha geniş bilgiler sunar.

Protokol

1. Örnek Hazırlama: fiksasyon, dehidrasyon ve LR-White gömme

1. Fiksasyon ve dehidrasyon
   NOT: Sabitleme işlemi örneği korumak için kritik öneme sahiptir; molekülleri çapraz bağlayarak hücresel metabolizma durdurulur, hücresel bütünlük sağlanır ve moleküler difüzyonu önler. Fiksatif ajanlar ve kullanılan konsantrasyon bu amaca göre ayarlanmalıdır ve antijenler antikorlarla etkileşime girmeye yeterince maruz kalmalıdır. Aşağıdaki protokol, paraformaldehitin hafif fiksatif yeteneğini glutaraldehitin daha güçlü etkisiyle birleştirir. Oranları AGP'ler ve hücre duvarı bileşenleri için optimize edilmiştir, ancak diğer proteinler ve hücre yapıları için uygundur. Sonraki dehidrasyon işlemi, numuneleri LR-White gömme için hazırlayacaktır. Bu deneyde birkaç bitki türünden bitki dokuları kullanılmıştır. Tarlada yetişen ağaçlardan Quercus suber örnekleri toplandı. Trithuria submersa örnekleri Paula Rudall (Kew Gardens, Londra, İngiltere) tarafından bizimle paylaşıldı.
   1. Tüm Arabidopsis bitkilerini doğrudan toprağa ekin ve % 60 bağıl neme ve 21 ° C'de 16 saat ışık ve 18 ° C'de 8 saat karanlık olan bir iç mekan büyüme tesisinde yetişin. Analiz edilecek bitki dokularını seçin ve örnekleri en fazla 16 mm² boyutunda olacak şekilde kırpın.
   2. Numuneyi hemen, numuneleri tamamen batırmak için daha önce yeterli soğuk fiksatif çözelti (%2 formaldehit (w/v), %2,5 glutaraldehit (w/v), 25 mM PIPES pH 7 ve %0,001 Ara-20 (v/v)) ile doldurulmuş bir cam şişeye aktarın (Şekil 1A).
      DİkKAT: Formaldehit ve glutaraldehit hem soluma hem de temas yoluyla zararlı olabilecek fiksatif ajanlardır. Bir duman davlumbazında sabitleme adımını gerçekleştirin ve yeterli koruyucu giysiler ve nitril eldivenler giyin. Bu adımdan itibaren alkol serileri de dahil olmak üzere% 70'e kadar tüm çözümler, uzman personel tarafından daha sonra arındırılma için saklanmalıdır.
   3. Tüm örnekleri topladıktan sonra, düzelticiyi yenileyin.
   4. Şişeleri bir vakum odasına aktarın ve yavaşça vakum uygulayın. -60 kPa'ya ulaştıktan sonra, yüzen malzeme şişenin dibine batmaya başlayacaktır (Şekil 1B).
   5. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca -80 kPa'dan fazla olmayan bir vakum altında tutun.
   6. Vakumyu yavaşça bırakın, cam şişeyi kapatın ve gece boyunca 4 °C'ye yerleştirin.
   7. Gece fiksasyonu sırasında batmayan örnekleri atın. Kalan numuneleri 25 mM PBS pH 7 ile 10 dakika yıkayın, ardından 25 mM PIPES tampon pH 7.2'de 20 dk yıkama.
   8. Numuneleri bir etanol serisinde (%25, %35, %50, %70, %80, %90 ve %3x %100 etanol) her biri 20 dakika susuz bırakır. Susuz kalmış numuneleri gömmek için etiketli cam şişelere hemen aktarın (Şekil 1C).
      NOT: Dehidrasyon işlemi % 70 etanol adımında duraklatılabilir.
2. LR-Beyaz reçine gömme
   NOT: LR-beyaz, düşük viskoziteye sahip hidrofobik olmayan akrilik bir reçinedir, bu da onu birçok kalın hücre duvarı katmanına sahip dokulara nüfuz etmek için ideal hale getirir. LR-White ayrıca çoğu bitki örneğini kesmek için uyumlu çeşitli sertlik sınıflarında gelir. Lütfen kullanılmış reçinenin zaten uygun katalizörle birlikte sağlandığından emin olun veya reçineyi hazırlamak için tedarikçi talimatlarını izleyin. Aşağıdaki katıştırma işlemi yavaştır, ancak sonuçlar araçları büyük ölçüde haklı çıkarır.
   1. Numuneleri, LR-White reçinesi ile bir dizi hilal reçine konsantrasyonunda (1:3, 2:3, 1:1, 3:2, 3:1, 1:0) etanolde kuluçkaya yatırarak, her adımda 4 °C'de 24 saat kuluçkaya yatırarak örnekleri etkisiz haline getirir.
      DİkKAT: LR-Beyaz reçine düşük toksisiteli akrilik reçinedir; ancak temas ve teneffüs ile cilt için tahriş edici olabilir. uygun koruyucu aşınma ve nitril eldivenlerle iyi havalandırılmış bir alanda veya duman kaputunun altında çalışmanız şiddetle tavsiye edilir.
   2. LR-beyaz reçineyi yenileyin ve 4 °C'de 12 saat daha kuluçkaya yaslanın.
   3. 3 mm'ye kadar numuneler için uygun boyutta gömme jelatin kapsülleri (boyut 1 (0,5 mL), 5 mm'ye kadar numuneler için 2 x 0,37 mL veya 8 mm'ye kadar numuneler için 3 x 0,3 mL ve kağıt etiketler(Şekil 1D) hazırlayın.
      NOT: Numunenin reçineye tamamen kapatılabilmesi için kapsül boyutunu numuneden biraz daha büyük olacak şekilde seçin. Ayrıca, etiketleri bir kalemle etiketlemeyi unutmayın, çünkü kalem veya basılı mürekkepler reçineyi kirleterek numuneyi mahveder.
   4. Her kapsülün altına bir damla taze LR-beyaz reçine uygulayın.
   5. Her jelatin kapsülüne bir örnek yerleştirin ve taze reçine ile maksimum kapasiteye doldurun. Kapsül kapağını yerleştirin ve hermetik bir conta oluşturmak için hafifçe bastırın (Şekil 1E).
   6. Reçineyi 58 °C'de 24 ila 48 saat veya tamamen sertleşene kadar polimerize edin.
   7. Numuneleri oda sıcaklığında saklayın.
      NOT: Polimerizasyon sonrası LR-beyaz reçine inerttir.

2. Slayt hazırlama

NOT: Cam kaydıraklar temiz olmalı, toz, gres veya diğer kirleticilerden arındırılmalıdır. Bazı tedarikçiler slaytların birbirine yapışmasını önlemek için yağlar ve deterjanlar kullandığından, yeni slaytlar bile temizlenmelidir. Herhangi bir gres veya deterjan, poli-L-lizin ile işlenmiş olsa bile, kaydırağın bölüm yapışmasını engeller. Tiftik ve toz numunenin gözlemlerini etkileyecek ve muhtemelen deneyi mahvedecektir. Reaksiyon kuyuları ile teflon kaplı slaytlar bu görev için mükemmeldir. Uygun fiyatlı, yeniden kullanılabilir ve ihtiyaç duyulan antikor çözeltisi miktarını büyük ölçüde azaltırlar. Uygun temizlik ile mükemmel kalitede floresan immünolocalizasyon çok uygun bir maliyetle yapılabilir.

1. Slayt yıkama
   1. Slaytları bir boyama rafı içine yerleştirin ve temizleme çözeltisi (%0,1 SDS (w/v), %1 asetik asit (v/v), %10 etanol (v/v) ile örtün.
   2. 20 dakika boyunca hafif bir ajitasyon sağlayın.
   3. Boyama raflarını 10 dakika boyunca hafif ajitasyonlu bir ddH₂O banyosuna aktarın. 4 kez tekrarlayın.
   4. % 100 etanol içine kısa bir süre daldırılmadan önce rafları dikkatlice boşaltın ve slaytların tozsuz bir ortamda kurumasına izin verin.
   5. Kullanıma kadar saklayın.
2. Poli-L-lizin kaplama (isteğe bağlı)
   NOT: Küçük bölümler genellikle cam slaytları temizlemek için çok iyi yapışır. Bu adım yalnızca daha büyük bölümler için tavsiye edilir (>2 mm^2). Daha büyük bölümler katlama ve kırışma eğilimindedir ve tavsiye edilmez. Bununla birlikte, gerekirse daha büyük delikli reaksiyon slaytları kullanın. Yukarıdaki gibi temizleyin ve aşağıdaki gibi devam edin.
   1. Temiz slaytları kare bir Petri kabına yerleştirin. Pipet 0.001% poli-L-lizin çözeltisi (w / v) taşmadan slaytların deliklerini kapatmak için.
   2. Kapalı Petri kaplarında slaytların gece boyunca 40 °C'de kurumasına izin verin.
      NOT: Kaplamalı kaydıraklar hemen kullanıma hazırdır ve birkaç ay boyunca oda sıcaklığında tozsuz bir ortamda saklanabilir.

3. Örnek kırpma ve bölümleme

1. Örnek kırpma
   1. Keskin bir jiletle, apeksin numunenin ilgi alanına dik olduğu piramit şeklinde bir yapı oluşturmak için LR-White bloklarını stereomikroskop altında kesin (Ek Şekil 1A).
      NOT: Ultra mikrotom numune tutucu, bloğu sabitlemek için mükemmel bir araçtır. Cihazın evrensel bir numune tutucusu yoksa, yuvarlak bloklar için en uygun olanı kullanın.
   2. Fazla reçinenin ince dilimlerini piramit ana eksenine dik olarak çıkararak piramit yapısını kırpın.
   3. Kesme yüzeyini oluşturan numuneye ulaşılana kadar devam edin. Kesme yüzeyi içinde, hedef numune ideal olarak yamuk şeklinde kapatılmalıdır.
      NOT: Reçine bloğu, kesit yüzey alanını keskin bir bıçakla azaltmak için yarık açıyla daha da kırpılabilir(Şekil 1F).
2. Yarı ince kesitleme
   NOT: Cam bıçaklı bir mikrotom kullanılacaktır. Antikorun epitopa bağlanma yeteneği immünolabeling reaksiyon başarısını şarta bağlayacaktır. LR-White reçinesinin hidrofilik doğası, antikorların numune bölümleriyle iyi temasını sağlayacaktır. Daha ince bölümler, bölümlerin bulunmasına ve görüntüleme işlemine yardımcı olmak için kullanılacak daha soluk Calcofluor renklendirmesi sunacaktır. Aynı durum daha sonra uygulanabilecek diğer lekeler için de geçerlidir. Ayrıca aşırı kalınlık görüntü alma kalitesini etkileyecektir. Doku özelliklerine bağlı olarak 200 ila 700 nm arasında kesit kalınlığı için iyi bir uzlaşma bulunabilir. Blokları ultra mikrotom numune tutucusuna sıkıca monte edin.
   1. Ultra mikrotom ile 200 ila 700 nm(Şekil 1G)arasında kalınlıklarda bölümler yapın.
   2. Bazı bölümleri cam slayttaki ddH₂O damlasına aktararak bölüm alanını kontrol edin. Su buharlaşana kadar kaydırağı 50 °C sıcak tabağa yerleştirin. Leke, 30 sn boyunca bölümlerin üzerine% 1 borik asit çözeltisine (w / v)% 1 Toluidin Mavi O (w / v) damlası yerleştirir. Mikroskop altında durulayın ve gözlemleyin.
   3. İstenen yapıyı bulduktan sonra, daha önce temiz bir reaksiyon slaydının her kuyusuna yerleştirilen her ddH₂O damlasına bir veya iki bölüm aktarın.
   4. Her slaydı kapalı temiz 10 cm kare petri kabına yerleştirin ve 50 °C'de kurumasına izin verin.
   5. Slaytları kullanıma kadar temiz bir arşiv kutusunda saklayın.

4. İmmünolokalizasyon

NOT: Floresan immünolocalizasyon prosedürü iki antikorun sıralı kullanımına dayanır. Birincil antikor belirli bir hedef antijene karşı yükseltilir. sekonder antikor özellikle primer antikora karşı yetiştirilir ve floresan teknikleri için bir florofora (bu özel protokolde FITC) eşlenilir. Birincil antikor, numunedeki hedef antijeni tespit etmek için kullanılacak ve ikincil antikor, birincil antikorun fazlalığını yıkadıktan sonra numuneye bağlı birincil antikorun bulunduğu yeri işaretlemek için kullanılacaktır. Kontroller bu tahlilin önemli bir parçasıdır ve gözlemlerin doğruluğunu güvenceye almak için her zaman yapılmalıdır. Slayttaki bir kuyu, birincil antikor tedavisinin atlanacağı negatif kontrol olarak kullanılmak üzere rezerve edilmeli ve bu nedenle deneyin sonunda sinyal gözlenmemelidir. Etiketlemenin zaten bilinen ve kesin olan bir antikorla iyi tedavi edilerek pozitif bir kontrol deneye dahil edilmelidir. Pozitif kontrol, ikincil antikor etiketleme etkinliğini ve reaksiyon koşullarını doğrulamak için kullanılırken, negatif kontrol ikincil antikor özgüllüğünü test etmek için kullanılır.

1. Pipet uçları kutusunun altına bazı sönümlenmiş kağıt havlular yerleştirerek ve teneke folyo ile sararak bir kuluçka odası hazırlayın(Ek Şekil 1B-1E). Slaytları kuluçka odasına yerleştirin.
2. Pipet, 8 mm'lik blokaj çözeltisi başına 50 μL düşüş (1 M PBS'de% 5 yağsız kuru süt (w/ v) ve 10 dakika kuluçkaya yaslayın. Engelleme solüsyonını çıkarın ve tüm kuyuları PBS ile iki kez 10 dakika yıkayın.
3. Blokaj çözeltisinde birincil antikor çözeltilerini hazırlayın (bkz. Ek Tablo1 ), 1:5 (v/v) antikor; 8 mm kuyu başına yaklaşık 40 μL tahminde bulunun.
   NOT: Antikorun konsantrasyonu, imalat protokolüne göre ayarlanmalıdır.
4. 5 dakika boyunca ddH₂O ile son bir yıkama gerçekleştirin, kuyuların tamamen kurumasına asla izin vermeyin.
5. Pipet reaksiyon kuyularına birincil antikor çözeltisi. Kontrol kuyularına pipet engelleme çözümü.
6. Kuluçka odasını kapatın ve oda sıcaklığında 2 saat bekletin ve ardından 4 ° C'de gece boyunca bekletin. İkincil antikor çözeltisini hazırlayın, blokaj çözeltisinde %1 (v/v) kuyu başına yaklaşık 40 μL. Teneke folyo ile kaplı tutun.
7. Tüm kuyuları PBS ile 10 dakika boyunca iki kez yıkayın, ardından ddH₂O ile 10 dakika daha yıkayın.
8. Pipet tüm kuyulara ikincil antikor çözeltisi. Şu andan itibaren slaytları ışıktan koru.
9. Oda sıcaklığında karanlıkta 3-4 saat kuluçkaya yatırın.
10. PBS ile tüm kuyuları 10 dakika boyunca iki kez yıkayın ve ardından ddH₂O ile 10 dakikalık başka bir yıkama.
11. Her kuyuya bir damla calcofluor (PBS'de 1:10.000 (w/v) floresan daha parlak 28) uygulayın. Yıkamadan, her kuyuya bir damla montaj ortamı uygulayın (bkz. Malzeme Tablosu)ve bir kapak kılıfı yerleştirin (Şekil 1H).
12. Hücre duvarını ve immünokokalizasyonu tespit etmek için sırasıyla 10x/0.45, 20x/0.75, 40x/0.95 ve 100x/1.40 lens ile donatılmış bir floresan mikroskopla gözlemleyin, UV (calcofluor lekesi için) ve FITC filtreleri kullanın (Şekil 1I). Aşağıdaki dalga boylarını kullanın: UV için uyarma/emisyon (nm) 358/461 ve FITC için 485/530.
13. Sonuçların daha iyi görselleştirilmesi için her iki görüntü de ImageJ veya benzeri görüntülerle çakışır.

Sonuçlar

Başarılı bir deneyde, ikincil antikor özellikle hücre, doku veya organın belirli bir gelişim aşamasında hücre duvarı bileşiminin karakterize edilmesine izin vererek, belirli epitopun yerini parlak yeşil, tutarlı bir şekilde belirleyecektir. Örneğin LM6 antikoru, gelişmekte olan Quercus suber anther'in hücre duvarını bolca etiketleyen tip-I rhamnogalacturonan içeren bir bileşik olan 1,5-arabinan için yüksek bir benzeşime sahiptir (Şekil 2A), böylece bu tü...

Tartışmalar

Burada açıklanan bitkilerdeki floresan immünolocalizasyon yöntemi, sorunsuz bir şekilde basit olsa da, birkaç küçük adımın başarısına dayanır. Bunlardan ilki örnek hazırlama ve sabitlemedir. Bu ilk adım sırasında, hücre bileşenlerinin çoğunu çapraz bağlamak için formaldehit ve glutaraldehit karışımı kullanılır. Çözeltideki formaldehit hafif ve geri dönüşümlü bir fiksasyon sağlarken glutaraldehit daha kalıcı güçlü bir bağlantı sağlar; iki fiksatif arasındaki denge, epitopl...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
25% (w/v) Gluteraldehyde	Agar Scientific	AGR1010	aq. Solution, methanol free
8 wells Glass reaction slides	Marinfeld	MARI1216750	other brands may be used
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produce in GOAT	Sigma-Aldrich	F6258
cover slips, 24 mm x 50 mm	Marinfeld	MARI0100222	The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used
ddH2O	na	na
Ethanol absolute	na	na
Fluorescent brightner 28	Sigma-Aldrich	F-6259
Gelatin capsules	Agar scientific	AGG29211	The capsule size sould feat the size of the sample.
Glass vials	na	na	Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be clean with 96% etanol after use to remove LR-White residue and reused.
LR-white medium grade, embdeding resin	Agar Scientific	AGR1281	LR-White comes in several forms the medium grade provides na adequate cutting suport for most tissues for harder tissues a harder grade of LR-white may be recomendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please folow the instructions of the suplier to prepare the resin.
Non fat dry milk	Nestlé	na	any non fat dry milk is adequate
Oven	na	na	generic laboratory oven
Petri dish, 10 cm x 10 cm square	na	na
PIPES	Sigma Aldrich	P1851
Rat generated Monoclonal Anti-Body	Plant probes	na	Several antibodies that recognize cell wall components are available at both the Complex Carbohydrate research center (CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of some commonly used MABS and where they can be purchased is presented in Supplemental Table 1
Razor blades	na	na	regular razor blades
SDS	Sigma-Aldrich	L6026
Toluidine Blue-O	Agar Scientific	AGR1727
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Ultramicrotome	Leica Microsystems	UC7
upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters	Leica Mycrosistems	DMLb
vaccum chamber	na	na
vaccum pump	na	na
Vectashield	vecta Labs	T-1000	Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An antifade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.)