Флуоресцентная иммунолокализация арабиногалактических белков и пектинов в клеточной стенке тканей растений

Резюме

Этот протокол подробно описывает, как фиксируется растительный материал для иммунолокализации арабиногалактановых белков и пектинов, встроенный в гидрофильные акриловые смолы, секционированные и установленные на стеклянных слайдах. Мы показываем, что эпитопы, связанные с клеточной стеной, будут обнаружены с помощью специфических антител.

Аннотация

Развитие растений включает в себя постоянную корректировку состава и структуры клеточной стенки в ответ как на внутренние, так и на внешние раздражители. Клеточные стенки состоят из целлюлозы и неклеточных полисахаридов вместе с белками, фенольными соединениями и водой. 90% клеточной стенки состоит из полисахаридов (например, пектинов) и арабиногалактановых белков (АГП). Флуоресцентная иммунолокализация специфических гликан-эпитопов в гистологических секциях растений остается ключевым инструментом для обнаружения ремоделирования стеночных полисахаридных сетей, структуры и компонентов.

Здесь мы сообщаем об оптимизированной флуоресцентной процедуре иммунолокализации для обнаружения эпитопов гликанов из АЛП и пектинов в тканях растений. Параформальдегид/глутаралдегид фиксация была использована вместе с LR-White встраивания образцов растений, что позволяет лучше сохранить структуру ткани и состава. Тонкие секции встроенных образцов, полученных с помощью ультрамистома, использовались для иммунолокализации специфическими антителами. Этот метод предлагает отличное разрешение, высокую специфичность и возможность обнаружения нескольких гликан-эпитопов в одном образце. Этот метод позволяет субклеточной локализации гликанов и обнаруживает их уровень накопления в клеточной стенке. Это также позволяет определить пространственно-временные модели AGP и распределения пектина в процессах развития. Использование этого инструмента может в конечном итоге направлять направления исследований и связывать гликаны с конкретными функциями растений. Кроме того, полученная информация может дополнять биохимические исследования и исследования экспрессии генов.

Введение

Стенки клеток растений являются сложными структурами, состоящими из полисахаридов и гликопротеинов. Клеточные стены являются чрезвычайно динамичными структурами, архитектура, организация и состав которых варьируются в зависимости от типа клетки, локализации, стадии развития, внешних и внутренних^{стимулов 1.} Арабиногалактановые белки (АГП) и пектины являются важными компонентами стенки клеток растений. AGPs высоко гликозилированных белков и пектинов гомогалактуронных полисахаридов, состав, количество и структура которых сильно различаются на различных^{стадиях развития растений 2,3,4}. AGPs и исследования пектина показали их участие в нескольких процессах завода, таких как запрограммированная гибель клеток, ответ на абиотические стрессы, половое размножение растений, среди многих^{других 5}. Большинство из этих исследований началось с информации, полученной в результате исследований иммунолокализации.

Учитывая его сложность, изучение клеточных стенок требует много различных инструментов. Обнаружение гликановых эпитопов с использованием моноклональных антител (мабов) является ценным подходом к разрешению распределения полисахаридов и гликопротеинов вдоль этой структуры. Существует большая коллекция mAbs доступны для обнаружения гликан эпитопов и специфика каждого mAb постоянно совершенствуется, а^{также 6}. Описанная здесь методика применима ко всем видам растений и является идеальным инструментом для руководства будущими направлениями исследований, которые могут включать более дорогостоящие и сложные методы.

В этом методе, специфические антитела химически конъюгируются к флуоресцентным красителям such as FITC (фторсейн изотиоцианат), TRITC (тетраметилдодамин-5-(и 6)-isothiocyanate) или несколько красителей Alexa Fluor. Иммунофлуоресценция предлагает ряд преимуществ, что позволяет четко и быстро субклеточной локализации гликанов, которые могут быть непосредственно замечены под флуоресцентным микроскопом. Он очень специфичен и чувствителен, так как подготовка образца может эффективно защитить естественную структуру антигена, даже если присутствует в меньшем количестве. Это позволяет обнаруживать несколько антигенов в одном образце и, самое главное, предлагает высокое качество и визуально красивые результаты. Несмотря на большую мощность, предлагаемую исследованиями иммунолокализации флуоресценции, они часто считаются трудными для выполнения и реализации, скорее всего, из-за отсутствия подробных протоколов, позволяющих визуализировать различные этапы процедуры. Здесь мы предоставляем несколько простых рекомендаций о том, как выполнить эту технику и как получить высококачественные изображения.

Для протокола, представленного здесь, образцы должны быть сначала исправлены и встроены с использованием наиболее подходящего фиксатора. Хотя считается трудоемким и относительно утомительным методом, надлежащая фиксация и встраивание образца растения является ключом к обеспечению успешного анализа иммунолокализации. Для этой цели наиболее обычной является химическая фиксация с использованием перекрестных фиксаторов, таких как альдегиды. Перекрестные фиксаторы устанавливают химические связи между молекулами ткани, стабилизируют и затвердевают образец. Формальдегид и глутаралдегид являются перекрестными фиксаторами, и иногда используется сочетание обоих фиксаторов^7. Формальдегид предлагает большое структурное сохранение тканей и в течение длительных периодов времени, производя небольшие опровержения тканей и быть совместимым с иммуностимулированием. Glutaraldehyde является более сильным и стабильным фиксатор обычно используется в сочетании с формальдегидом. Использование глутаралдегид имеет некоторые недостатки, которые должны быть приняты во внимание, как он вводит некоторые свободные группы альдегида в фиксированной ткани, которые могут генерировать некоторые неспецифические маркировки. Кроме того, перекрестные связи между белками и другими молекулами иногда может сделать некоторые целевые эпитопы недоступными для антител. Чтобы избежать этого, количество и продолжительность фиксации должны быть тщательно определены.

После фиксации образцы встраиваются в правильную смолу, чтобы затвердеть перед получением секций. Лондонская смола (LR-White) акриловая смола является смолой выбора для иммунолокализации исследований. В отличие от других смол, LR-белый является гидрофильной, что позволяет антителам достичь своих антигенов, без необходимости какого-либо лечения, чтобы облегчить его. LR-White также имеет преимущество, предлагая низкую аутофлуоресценцию, что позволяет снижение фонового шума во время иммунофлуоресценции изображения.

Есть много методов окрашивания доступны для обнаружения различных компонентов клеточной стенки, таких как Alcian синий окрашивания, толуйдин синий окрашивания или периодические кислоты Шифф (PAS) окрашивания. Ни один из них не предлагает силу иммунолокализации анализы⁸. Такой подход дает большую специфичность в обнаружении гликанов, предлагая более обширную информацию о составе и структуре клеточной стенки.

протокол

1. Подготовка образцов: фиксация, обезвоживание и встраивание LR-White

1. Фиксация и обезвоживание
   ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс фиксации имеет решающее значение для сохранения образца; путем перекрестного обмена молекул клеточный метаболизм останавливается, обеспечивая клеточной целостности и предотвращения молекулярной диффузии. Фиксативные агенты и используемая концентрация должны быть скорректированы с этой целью, оставляя антигены достаточно подвержены взаимодействию с антителами. Следующий протокол сочетает в себе мягкую фиксативную способность параформальдегида, с более сильным эффектом глутаралдегида. Их пропорции были оптимизированы для AGPs и компонентов клеточной стенки, но это подходит для других белков и клеточных структур. Последующий процесс обезвоживания подготовит образцы для встраивания LR-White. В этом эксперименте использовались растительные ткани нескольких видов растений. Образцы субайдеров Кверка были взяты из деревьев, выращенных в полевых условиях. Образцы субмерсы Trithuria любезно поделились с нами Паула Рудалл (Кью Гарденс, Лондон, Великобритания).
   1. Посеять все растения Arabidopsis непосредственно на почве и расти в помещении роста объекта с 60% относительной влажности и день / ночь цикла 16 ч света при 21 градусов по Цельсию и 8 ч темноты при 18 градусов по Цельсию. Выберите ткани растений для анализа, и отделка образцов будет не более 16 мм^{2 в} размерах.
   2. Немедленно перенесите образец на стеклянный флакон, ранее наполненный достаточным холодным фиксаторным раствором (2% формальдегида (w/v), 2,5% glutaraldehyde (w/v), 25 mM PIPES pH 7 и 0.001% Tween-20 (v/v)) для полного погружения образцов(рисунок 1A).
      ВНИМАНИЕ: Формальдегид и глутаралдегид являются фиксаторными агентами, которые могут быть вредны при вдыхании и контакте. Выполните фиксацию шаг на капоте дыма и носить адекватную защитную одежду и нитриловые перчатки. Все решения с этого шага, включая серию алкоголя до 70%, должны храниться для дальнейшего обеззараживания специализированным персоналом.
   3. Собрав все образцы, обновите фиксатор.
   4. Перенесите флаконы в вакуумную камеру и медленно нанесите вакуум. По достижении -60 кПа, плавающий материал начнет опускаться на дно флакона(рисунок 1B).
   5. Хранить под вакуумом не более -80 кПа в течение 2 ч при комнатной температуре.
   6. Медленно отпустите вакуум, загерметив стеклянный флакон и поместите на ночь при 4 градусов по Цельсию.
   7. Откажитесь от любых образцов, которые не утонули во время ночной фиксации. Вымойте оставшиеся образцы с 25 мММ PBS рН 7 в течение 10 минут, а затем 20 минут мыть в 25 мМ PIPES буфер рН 7,2.
   8. Обезвоживать образцы в серии этанола (25%, 35%, 50%, 70%, 80%, 90%, и 3x 100% этанола) в течение 20 мин каждый. Немедленно перенесите обезвоженные образцы на помеченные стеклянные флаконы для встраивания(рисунок 1C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс обезвоживания может быть приостановлен на 70% этанола шаг.
2. LR-Белая смола встраивания
   ПРИМЕЧАНИЕ: LR-белый является негидрофобной акриловой смолы с низкой вязкостью, что делает его идеальным для проникновения тканей со многими толстыми слоями стенок клеток. LR-White также поставляется в нескольких классах твердости, совместимых для резки большинства образцов растений. Пожалуйста, убедитесь, что используемая смола уже поставляется с надлежащей катализатора смешивается, или следовать инструкциям поставщика для подготовки смолы. Следующий процесс встраивания идет медленно, но результаты в значительной степени оправдывают средства.
   1. Перелить образцы путем инкубации с LR-белой смолы в серии полумесяца концентрации смолы (1:3, 2:3, 1:1, 3:2, 3:1, 1:0) в этаноле, инкубации в течение 24 ч при 4 градусов по Цельсию на каждом шагу.
      ВНИМАНИЕ: LR-белая смола является низкой токсичности акриловой смолы; однако, это может быть раздражителем для кожи при контакте и вдыхании. Рекомендуется работать в хорошо проветриваемой области или под дымовой капотом с соответствующим защитным износом и нитрильными перчатками.
   2. Освежите LR-белую смолу и инкубировать еще 12 ч при 4 градусах Цельсия.
   3. Подготовка соответствующих размеров встраивания желатиновых капсул (размер 1 (0,5 мл) для образцов до 3 мм, 2 х 0,37 мл для образцов до 5 мм или 3 х 0,3 мл для образцов до 8 мм и бумажных меток(рисунок 1D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите размер капсулы, чтобы быть немного больше, чем образец, так что образец может быть полностью заключен в смолу. Кроме того, не забудьте обозначить теги карандашом, потому что ручка или печатные чернила будут загрязнять смолу, разрушая образец.
   4. Нанесите одну каплю свежей LR-белой смолы на дно каждой капсулы.
   5. Поместите образец в каждую желатиновую капсулу и заполните до максимальной емкости свежей смолой. Поместите капсулу крышку и нажмите осторожно, чтобы сформировать герметичный уплотнение( Рисунок 1E).
   6. Полимеризируйте смолу на 24-48 ч при 58 градусах Цельсия или до полного затвердевшего.
   7. Храните образцы при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пост полимеризации LR-белой смолы является инертным.

2. Подготовка слайда

ПРИМЕЧАНИЕ: Стеклянные слайды должны быть чистыми, без пыли, жира или любых других загрязняющих веществ. Даже новые слайды должны быть очищены, как некоторые поставщики используют масла и моющие средства, чтобы предотвратить слайды от слипания. Любая смазка или моющее средство будет мешать прилипать к слайду, даже если его обработать поли-L-лизином. Линт и пыль повлияют на наблюдения образца и, вполне возможно, разрушат эксперимент. Тефлоновые слайды с реакционными скважинами идеально подходят для этой задачи. Они доступны по цене, многоразовые и резко уменьшить количество антител решение необходимо. При надлежащей очистке, отличное качество флуоресцентной иммунолокализации может быть выполнена по очень доступной цене.

1. Стирка слайдов
   1. Поместите слайды в окрашивание стойки и накройте раствором для очистки (0,1% SDS (w/v), 1% уксусной кислоты (v/v), 10% этанола (v/v)).
   2. Поддерживайте легкое возбуждение в течение 20 минут.
   3. Перенесите окрашивающие стойки в ванну ddH₂O с легким возбуждением в течение 10 мин. Повторите 4 раза.
   4. Тщательно слейте стеллажи перед погружением кратко в 100% этанола и дайте слайды высохнуть в без пыли окружающей среды.
   5. Хранить до использования.
2. Поли-L-лизиновое покрытие (по желанию)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшие секции обычно придерживаются очень хорошо для очистки стеклянных слайдов. Этот шаг рекомендуется только для больших секций (2 мм^2). Большие секции, как правило, складываются и морщины, и не рекомендуется. Тем не менее, при необходимости используйте реакционые слайды с большими отверстиями. Очистите их, как указано выше, и продолжайте следующим образом.
   1. Поместите чистые горки в квадратную чашку Петри. Pipette 0.001% поли-L-лизин раствор (w/v) для покрытия отверстий слайдов, без переполнения.
   2. Пусть слайды высохнут на ночь при 40 градусов по Цельсию в закрытых чашках Петри.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Покрытые слайды готовы к немедленному использованию и могут храниться в свободной от пыли среде при комнатной температуре, в течение нескольких месяцев.

3. Пример обрезки и секции

1. Обрезка образцов
   1. С острым лезвием бритвы, обрезать LR-белые блоки под стереомикроскопом, чтобы сформировать пирамида формы структуры, где вершина перпендикулярна области интересов образца (Дополнительный рисунок 1A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ультра-микротома образца держатель является отличным инструментом для обеспечения блока. Если устройство не имеет универсального держателя образца, используйте тот, который наиболее подходит для круглых блоков.
   2. Обрезать пирамидарной структуры, удалив тонкие ломтики избыточной смолы перпендикулярно пирамиды основной оси.
   3. Продолжайте до тех пор, пока образец не будет достигнут формирования режущей поверхности. В пределах режущей поверхности образец мишени в идеале должен быть заключен в трапециевидную форму.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Блок смолы можно дополнительно обрезать под углом щели, чтобы уменьшить площадь поверхности секции острым лезвием(рисунок 1F).
2. Полутонкое сечение
   ПРИМЕЧАНИЕ: Микротом с стеклянными ножами будет использоваться. Способность антитела связываться с эпитопом будет состояние иммунолабеля реакции успеха. Гидрофильная природа LR-белой смолы позволит хорошо контактировать антител с образцами секций. Более тонкие секции будут представлять более слабые окраски Calcofluor, которые будут использоваться, чтобы помочь найти разделы и помочь с процессом визуализации. То же самое относится и к другим пятнам, которые впоследствии могут быть применены. Также чрезмерная толщина повлияет на качество приобретения изображения. Хороший компромисс для толщины раздела можно найти между 200 и 700 nm, в зависимости от характеристик ткани. Намонтировать блоки плотно на держатель образца ультра-микротомы.
   1. С ультра-микротом, сделать разделы с толщиной от 200 до 700 нм(рисунок 1G).
   2. Проверьте область раздела, передав некоторые разделы на ddH₂O падение на стеклянную горку. Поместите горку на горячую тарелку на 50 градусов цельсия до тех пор, пока вода не испарится. Пятно размещения падение на 1% Толуйдин Blue O (w/v) в 1% борной кислоты раствор (ж / в) над секциями на 30 с. Промыть и наблюдать под микроскопом.
   3. Найдя нужную структуру, перенесите одну или две секции на каждую каплю ddH₂O, ранее размещенную на каждой колодец чистого слайда реакции.
   4. Поместите каждую горку в закрытую чистую 10-сантиметровую тарелку Петри и дайте ей высохнуть при 50 градусах Цельсия.
   5. Храните слайды в чистом архивном ящике до использования.

4. Иммунолокализация

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура флуоресцентной иммунолокализации опирается на последовательное использование двух антител. Первичное антитело поднимается против конкретного целевого антигена. Вторичное антитело поднято специфически против главным образом антитела и для флуоресцентных методов conjugated к флюорофору (FITC в этом специфическом протоколе). Первичные антитела будут использоваться для обнаружения целевого антигена в образце, а вторичные антитела будут использоваться для определения места, где первичное антитело подключено к образцу после смывания избытка первичного антитела. Контроль является важной частью этого анализа и всегда должен выполняться для обеспечения точности наблюдений. Один колодец на слайде должен быть зарезервирован для использования в качестве отрицательного контроля, где первичное лечение антителом будет пропущено, и поэтому не следует наблюдать сигнал в конце эксперимента. Положительный контроль должен быть включен в эксперимент, рассматривая один хорошо с антителом, маркировка которого уже известна и уверена. Положительный контроль используется для подтверждения вторичной эффективности маркировки антител и условий реакции, в то время как отрицательный контроль проверяет вторичную специфичность антител.

1. Подготовка инкубационной камеры, поместив некоторые влажные бумажные полотенца в нижней части коробки советы пипетки и упаковка его с фольгой(Дополнительный рисунок 1B-1E). Поместите горки в инкубационую камеру.
2. Pipette 50 йл падение на 8 мм хорошо блокирующего раствора (5% обезжиренного сухого молока (w/v) в 1 М PBS) и инкубировать в течение 10 мин. Снимите блокирующий раствор и промойте все скважины дважды с помощью PBS в течение 10 минут.
3. Подготовка первичных антител решений (см. Дополнительная таблица 1), 1:5 (V /V) антитела в блокирующий раствор; сделать оценку около 40 йл на 8 мм хорошо.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация антитела должна быть скорректирована в соответствии с протоколом производства.
4. Выполните окончательную стирку с ddH₂O в течение 5 минут, никогда не позволяйте скважины высохнуть полностью.
5. Pipette основной раствор антитела к скважинам реакции. Пипетка блокирует раствор для контрольных скважин.
6. Закройте инкубационую камеру и дайте постоять 2 ч при комнатной температуре, а затем на ночь при температуре 4 градусов по Цельсию. Подготовь вторичный раствор антитела, 1% в блокирующий раствор (v/v) около 40 йл на колодец. Держите его покрыты фольгой.
7. Вымойте все скважины дважды с PBS в течение 10 минут, а затем 10 дополнительных минут с ddH₂O. Убедитесь, что никаких следов блокирующего раствора или отложений не видно на скважинах.
8. Пипетт вторичный раствор антител ко всем скважинам. Отныне защитите горки от света.
9. Инкубация в течение 3-4 ч в темноте при комнатной температуре.
10. Вымойте все скважины дважды в течение 10 минут с PBS следуют еще один мыть 10 мин с ddH₂O.
11. Нанесите каплю кальцифлюора (1:10,000 (w/v) флуоресцентный ярче 28 в PBS) к каждой хорошо. Без стирки нанесите каплю монтажной среды (см. таблицу материалов)к каждому колодец и поместите крышку(рисунок 1H).
12. Наблюдайте с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного объективом 10x/0.45, 20x/0.75, 40x/0.95 и 100x/1.40, используйте УФ (для кальцифторного пятна) и фильтры FITC для обнаружения клеточной стенки и иммунолокализации соответственно(рисунок 1I). Используйте следующие длины волн: возбуждение/излучение (нм) 358/461 для УФ и 485/530 для FITC.
13. Для лучшей визуализации результатов перекрывают оба изображения с ImageJ или аналогичными.

Результаты

В успешном эксперименте, вторичные антитела будут конкретно определить расположение конкретного эпитопа в ярко-зеленый, в последовательной манере, что позволяет для характеристики состава клеточной стенки на определенной стадии развития клетки, ткани или органа. Например, антитела LM...

Обсуждение

Метод флуоресцентной иммунолокализации растений, описанный здесь, хотя и легко прост, опирается на успех нескольких небольших шагов. Первым из них является подготовка и фиксация образца. Во время этого первого шага, смесь формальдегида и глутаралдегида используется для перекрестного ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
25% (w/v) Gluteraldehyde	Agar Scientific	AGR1010	aq. Solution, methanol free
8 wells Glass reaction slides	Marinfeld	MARI1216750	other brands may be used
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produce in GOAT	Sigma-Aldrich	F6258
cover slips, 24 mm x 50 mm	Marinfeld	MARI0100222	The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used
ddH2O	na	na
Ethanol absolute	na	na
Fluorescent brightner 28	Sigma-Aldrich	F-6259
Gelatin capsules	Agar scientific	AGG29211	The capsule size sould feat the size of the sample.
Glass vials	na	na	Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be clean with 96% etanol after use to remove LR-White residue and reused.
LR-white medium grade, embdeding resin	Agar Scientific	AGR1281	LR-White comes in several forms the medium grade provides na adequate cutting suport for most tissues for harder tissues a harder grade of LR-white may be recomendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please folow the instructions of the suplier to prepare the resin.
Non fat dry milk	Nestlé	na	any non fat dry milk is adequate
Oven	na	na	generic laboratory oven
Petri dish, 10 cm x 10 cm square	na	na
PIPES	Sigma Aldrich	P1851
Rat generated Monoclonal Anti-Body	Plant probes	na	Several antibodies that recognize cell wall components are available at both the Complex Carbohydrate research center (CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of some commonly used MABS and where they can be purchased is presented in Supplemental Table 1
Razor blades	na	na	regular razor blades
SDS	Sigma-Aldrich	L6026
Toluidine Blue-O	Agar Scientific	AGR1727
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Ultramicrotome	Leica Microsystems	UC7
upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters	Leica Mycrosistems	DMLb
vaccum chamber	na	na
vaccum pump	na	na
Vectashield	vecta Labs	T-1000	Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An antifade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.)