Inmunolocalización fluorescente de proteínas arabinogalactanas y pectinas en la pared celular de los tejidos vegetales

Resumen

Este protocolo describe en detalle cómo se fija el material vegetal para la inmunolocalización de proteínas y pectinas arabinogalactanas, incrustado en una resina acrílica hidrófila, seccionado y montado en toboganes de vidrio. Mostramos que los epítopos relacionados con la pared celular se detectarán con anticuerpos específicos.

Resumen

El desarrollo de la planta implica ajustes constantes de la composición y estructura de la pared celular en respuesta a estímulos internos y externos. Las paredes celulares se componen de celulosa y polisacáridos no celulósicos junto con proteínas, compuestos fenólicos y agua. El 90% de la pared celular se compone de polisacáridos (por ejemplo, pectinas) y proteínas arabinogalactanas (AGPs). La inmunolocalización fluorescente de epítopos glicanos específicos en secciones histológicas vegetales sigue siendo una herramienta clave para descubrir la remodelación de redes, estructura y componentes de polisacáridos de pared.

Aquí, informamos de un procedimiento optimizado de inmunolocalización fluorescente para detectar epitopos glicanos de AGPs y pectinas en tejidos vegetales. Se utilizó la fijación de paraformaldehído/glutaraldehído junto con la incrustación LR-White de las muestras de la planta, lo que permite una mejor preservación de la estructura y composición del tejido. Secciones delgadas de las muestras incrustadas obtenidas con un ultra-microtome se utilizaron para la inmunolocalización con anticuerpos específicos. Esta técnica ofrece una gran resolución, alta especificidad y la posibilidad de detectar múltiples epítopos glicanos en la misma muestra. Esta técnica permite la localización subcelular de glicanos y detecta su nivel de acumulación en la pared celular. También permite la determinación de patrones espacio-temporales de distribución de AGP y pectina durante los procesos de desarrollo. El uso de esta herramienta puede, en última instancia, guiar las instrucciones de investigación y vincular glicanos a funciones específicas en las plantas. Además, la información obtenida puede complementar estudios bioquímicos y de expresión génica.

Introducción

Las paredes de células vegetales son estructuras complejas compuestas de polisacáridos y glicoproteínas. Las paredes celulares son estructuras extremadamente dinámicas cuya arquitectura, organización y composición varían según el tipo de celda, localización, etapa de desarrollo, estímulos externos e internos^1. Las proteínas arabinogalactan (AGPs) y las pectinas son componentes importantes de la pared celular vegetal. Los AGPs son proteínas y pectinas altamente glicosiladas son polisacáridos homogalacturonan cuya composición, cantidad y estructura varían mucho durante diferentes etapas de desarrollo vegetal^2,3,4. Agps y estudios de pectina han revelado su participación en varios procesos vegetales como la muerte celular programada, respuesta a tensiones abióticas, reproducción de plantas sexuales, entre muchos otros^5. La mayoría de estos estudios comenzaron con información obtenida de estudios de inmunolocalización.

Dada su complejidad, el estudio de las paredes celulares requiere muchas herramientas diferentes. La detección de epítopos glicanos utilizando anticuerpos monoclonales (mAbs) es un enfoque valioso para resolver la distribución de polisacáridos y glicoproteínas a lo largo de esta estructura. Hay una gran colección de mAbs disponibles para detectar epítopos glicanos y la especificidad de cada mAb se está mejorando continuamente, así como⁶. La técnica aquí descrita es aplicable a todas las especies vegetales, y es una herramienta perfecta para guiar futuras direcciones de investigación que podrían implicar técnicas más costosas y complejas.

En esta técnica, anticuerpos específicos se conjugan químicamente a tintes fluorescentes como FITC (isothiocyanato de fluoresceína), TRITC (tetrametilrhodamina-5-(y 6)-isothiocyanato) o varios tintes Alexa Fluor. La inmunofluorescencia ofrece varias ventajas, permitiendo una localización subcelular clara y rápida de glicanos que se pueden observar directamente bajo un microscopio de fluorescencia. Es altamente específico y sensible, ya que la preparación de la muestra puede proteger eficazmente la estructura natural del antígeno, incluso si está presente en cantidades más bajas. Permite la detección de múltiples antígenos en la misma muestra y lo más importante, ofrece resultados de alta calidad y visualmente hermosos. A pesar de la gran potencia que ofrecen los estudios de inmunolocalización de fluorescencia, a menudo se consideran difíciles de realizar e implementar muy probablemente debido a la falta de protocolos detallados que permitan la visualización de los diferentes pasos del procedimiento. Aquí, proporcionamos algunas directrices simples sobre cómo realizar esta técnica y cómo obtener imágenes de alta calidad.

Para el protocolo presentado aquí, las muestras primero deben ser fijas e incrustadas utilizando el fijador más adecuado. Aunque se considera como una técnica lenta y relativamente tediosa, la fijación e incrustación adecuada de la muestra vegetal es la clave para garantizar un ensayo de inmunolocalización exitoso. Para ello, lo más habitual es la fijación química mediante fijadores de enlace cruzado, como los aldehídos. Los fijadores de enlace cruzado establecen vínculos químicos entre moléculas del tejido, estabilizando y endureciendo la muestra. Formaldehído y glutaraldehído son fijadores de enlace cruzado, y a veces se utiliza una mezcla de ambos fijadores⁷. El formaldehído ofrece una gran preservación estructural de los tejidos y durante largos períodos de tiempo, produciendo pequeñas retracciones tisulares y siendo compatible con el inmunostaining. El glutaraldehído es un fijador más fuerte y estable que se utiliza generalmente en combinación con formaldehído. El uso de glutaraldehído tiene algunas desventajas que deben tenerse en cuenta ya que introduce algunos grupos de aldehído libre en el tejido fijo, lo que puede generar algún etiquetado inespecífico. También el reticulamiento entre proteínas y otras moléculas ocasionalmente puede hacer que algunos epítopos objetivo sean inaccesibles para los anticuerpos. Para evitar esto, la cantidad y la duración de la fijación deben definirse cuidadosamente.

Después de la fijación, las muestras se incrustan en la resina adecuada para endurecer antes de obtener las secciones. La resina acrílica london resina (LR-White) es la resina preferida para estudios de inmunolocalización. A diferencia de otras resinas, LR-White es hidrófilo, permitiendo que los anticuerpos alcancen sus antígenos, sin necesidad de ningún tratamiento para facilitarlo. LR-White también tiene la ventaja de ofrecer baja fluorescencia automática, permitiendo una reducción en el ruido de fondo durante las imágenes de inmunofluorescencia.

Hay muchas técnicas de tinción disponibles para detectar diferentes componentes de la pared celular, tales como manchas azules alcian, tinción azul toluidina o tinción periódica ácido-Schiff (PAS). Ninguno de ellos ofrece el poder de los análisis de inmunolocalización^8. Este enfoque proporciona una mayor especificidad en la detección de glicanos, ofreciendo información más vasta sobre la composición y estructura de la pared celular.

Protocolo

1. Preparación de la muestra: fijación, deshidratación e incrustación LR-White

1. Fijación y deshidratación
   NOTA: El proceso de fijación es fundamental para conservar la muestra; cruzando moléculas el metabolismo celular se detiene, asegurando la integridad celular y evitando la difusión molecular. Los agentes fijadores y la concentración utilizada deben ajustarse a tal fin, dejando los antígenos suficientemente expuestos para interactuar con los anticuerpos. El siguiente protocolo combina la suave capacidad fijativa del paraformaldehído, con el efecto más fuerte del glutaraldehído. Sus proporciones fueron optimizadas para AGPs y componentes de pared celular, pero es adecuado para otras proteínas y estructuras celulares. El proceso de deshidratación posterior preparará las muestras para la incrustación LR-White. En este experimento se utilizaron tejidos vegetales de varias especies vegetales. Las muestras de suber quercus fueron recogidas de árboles cultivados en el campo. Las muestras de trithuria submersa fueron amablemente compartidas con nosotros por Paula Rudall (Kew Gardens, Londres, Reino Unido).
   1. Sembrar todas las plantas de Arabidopsis directamente en el suelo y crecer en una instalación de crecimiento interior con un 60% de humedad relativa y un ciclo de día / noche de 16 h de luz a 21 °C y 8 h oscuridad a 18 °C. Seleccione los tejidos vegetales que desea analizar y recorte las muestras para que no sean más de 16 mm^{y 2} de tamaño.
   2. Transfiera inmediatamente la muestra a un vial de vidrio previamente lleno de suficiente solución fija en frío (2% formaldehído (w/v), 2,5% glutaraldehído (w/v), 25 mM PIPES pH 7 y 0,001% Tween-20 (v/v)) para sumergir completamente las muestras (Figura 1A).
      PRECAUCIÓN: El formaldehído y el glutaraldehído son agentes fijativos que pueden ser dañinos por inhalación y contacto. Realice el paso de fijación en una capucha de humo y use ropa protectora adecuada y guantes de nitrilo. Todas las soluciones a partir de este paso, incluidas las series de alcohol hasta el 70%, deben ser almacenadas para su posterior descontaminación por personal especializado.
   3. Después de recopilar todos los ejemplos, actualice el fijador.
   4. Transfiera los viales a una cámara de vacío y aplique lentamente el vacío. Al alcanzar -60 kPa, el material flotante comenzará a hundirse en la parte inferior del vial (Figura 1B).
   5. Mantener bajo un vacío de no más de -80 kPa para 2 h a temperatura ambiente.
   6. Suelte lentamente el vacío, selle el vial de vidrio y colóquelo durante la noche a 4 °C.
   7. Deseche las muestras que no se hundieron durante la fijación durante la noche. Lave las muestras restantes con 25 mM PBS pH 7 durante 10 min, seguido de un lavado de 20 minutos en 25 mM PIPES buffer pH 7.2.
   8. Deshidratar las muestras de una serie de etanol (25%, 35%, 50%, 70%, 80%, 90% y 3x 100% etanol) durante 20 minutos cada una. Transfiera inmediatamente las muestras deshidratadas a viales de vidrio etiquetados para su incrustación(Figura 1C).
      NOTA: El proceso de deshidratación se puede pausar en el paso del etanol del 70%.
2. Incrustación de resina LR-White
   NOTA: LR-white es una resina acrílica no hidrofóbica con baja viscosidad, por lo que es ideal para penetrar tejidos con muchas capas gruesas de paredes celulares. LR-White también viene en varios grados de dureza compatibles para cortar la mayoría de las muestras de plantas. Asegúrese de que la resina utilizada ya se suministra con el catalizador adecuado mezclado, o siga las instrucciones del proveedor para preparar la resina. El siguiente proceso de incrustación es lento, pero los resultados justifican en gran medida los medios.
   1. Perfundir las muestras incubando con la resina LR-White en una serie de concentraciones crecientes de resina (1:3, 2:3, 1:1, 3:2, 3:1, 1:0) en etanol, incubando durante 24 h a 4 °C en cada paso.
      PRECAUCIÓN: La resina LR-Blanca es una resina acrílica de baja toxicidad; sin embargo, puede ser un irritante para la piel por contacto e inhalación. Se recomienda trabajar en un área bien ventilada o debajo de una campana de humo con un desgaste protector adecuado y guantes de nitrilo.
   2. Refresque la resina LR-blanca e incubar durante 12 h adicionales a 4 °C.
   3. Preparar cápsulas de gelatina de incrustación de tamaño adecuado (tamaño 1 (0,5 ml) para muestras de hasta 3 mm, 2 x 0,37 ml para muestras de hasta 5 mm o 3 x 0,3 ml para muestras de hasta 8 mm, y etiquetas de papel (Figura 1D).
      NOTA: Seleccione el tamaño de la cápsula para que sea ligeramente mayor que la muestra, de modo que la muestra pueda estar completamente encerrada en la resina. Además, recuerda etiquetar las etiquetas con un lápiz, porque la pluma o las tintas impresas contaminarán la resina, arruinando la muestra.
   4. Aplique una gota de resina fresca LR-blanca en la parte inferior de cada cápsula.
   5. Coloque una muestra en cada cápsula de gelatina y llene al máximo la capacidad con resina fresca. Coloque la tapa de la cápsula y presione suavemente para formar un sello hermético(Figura 1E).
   6. Polimerizar la resina de 24 a 48 h a 58 °C, o hasta que esté completamente endurecida.
   7. Almacene muestras a temperatura ambiente.
      NOTA: La resina LR-blanca post polimerización es inerte.

2. Preparación de diapositivas

NOTA: Las toboganes de vidrio deben estar limpias, libres de polvo, grasa o cualquier otro contaminante. Incluso las nuevas diapositivas deben limpiarse, ya que algunos proveedores utilizan aceites y detergentes para evitar que las diapositivas se mantengan juntas. Cualquier grasa o detergente interferirá con la adherencia de la sección a la diapositiva, incluso si se trata con poli-L-lisina. La pelusa y el polvo afectarán las observaciones del espécimen y muy posiblemente arruinarán el experimento. Los toboganes recubiertos de teflón con pozos de reacción son perfectos para esta tarea. Son asequibles, reutilizables y reducen drásticamente la cantidad de solución de anticuerpos necesaria. Con una limpieza adecuada, la inmunolocalización fluorescente de excelente calidad se puede realizar a un costo muy asequible.

1. Lavado de diapositivas
   1. Coloque las diapositivas en un estante de tinción y cubra con solución de limpieza (0,1% SDS (w/v), 1% ácido acético (v/v), 10% etanol (v/v)).
   2. Mantenga una agitación leve durante 20 minutos.
   3. Transfiera los estantes de tinción a un baño ddH₂O con agitación leve durante 10 minutos. Repita 4 veces.
   4. Escurrir cuidadosamente los estantes antes de sumergirse brevemente en etanol al 100% y dejar que las diapositivas se sequen en un ambiente libre de polvo.
   5. Conservar hasta su uso.
2. Recubrimiento de poli-L-lisina (opcional)
   NOTA: Las secciones pequeñas suelen pegarse muy bien a los toboganes de vidrio limpio. Este paso solo es recomendable para secciones más grandes (>2 mm^2). Las secciones más grandes tienden a plegarse y arrugarse, y no son recomendables. Sin embargo, si es necesario, utilice diapositivas de reacción con agujeros más grandes. Límpielos como se ha mencionado anteriormente y proceda de la siguiente manera.
   1. Coloque toboganes limpios en una placa cuadrada de Petri. Pipeta 0.001% solución de poli-L-lisina (w/v) para cubrir los agujeros de las diapositivas, sin desbordarse.
   2. Deje que los toboganes se sequen durante la noche a 40 °C en platos cerrados de Petri.
      NOTA: Las toboganes recubiertas están listas para su uso inmediato y se pueden almacenar en un ambiente libre de polvo a temperatura ambiente, durante varios meses.

3. Recorte y seccionamiento de muestras

1. Recorte de muestras
   1. Con una cuchilla de afeitar afilada, recorta los bloques LR-White bajo un estereomicroscopio para formar una estructura en forma de pirámide donde el ápice es perpendicular al área de interés de la muestra(Figura Suplementaria 1A).
      NOTA: El soporte de la muestra ultra-microtome es una excelente herramienta para asegurar el bloque. Si el dispositivo no tiene un soporte de muestra universal, utilice el más adecuado para bloques redondos.
   2. Recorte la estructura piramidal eliminando finas rodajas del exceso de resina perpendicularmente al eje principal de la pirámide.
   3. Proceda hasta que se alcance la muestra formando la superficie de corte. Dentro de la superficie de corte, la muestra objetivo debe estar idealmente encerrada en una forma trapezoidal.
      NOTA: El bloque de resina se puede recortar aún más en un ángulo de hendidura para reducir el área de superficie de sección con una hoja afilada (Figura 1F).
2. Seccionamiento semifino
   NOTA: Se utilizará un microtome con cuchillos de vidrio. La capacidad del anticuerpo para unirse al epítopo condicionará el éxito de la reacción inmunoetiquedora. La naturaleza hidrófila de la resina LR-White permitirá un buen contacto de los anticuerpos con las secciones de la muestra. Las secciones más delgadas presentarán una coloración calcofluor más débil que se utilizará para ayudar a localizar las secciones y ayudar con el proceso de imagen. Lo mismo ocurre con otras manchas que luego se pueden aplicar. También el espesor excesivo afectará a la calidad de adquisición de imágenes. Un buen compromiso para el espesor de la sección se puede encontrar entre 200 y 700 nm, dependiendo de las características del tejido. Monte los bloques firmemente en el soporte de la muestra del ultra-microtome.
   1. Con un ultra-microtome, hacer secciones con un espesor entre 200 y 700 nm (Figura 1G).
   2. Compruebe el área de la sección transfiriendo algunas secciones a una caída de ddH₂O en una diapositiva de vidrio. Coloque el tobogán sobre una placa caliente de 50 °C hasta que el agua se evapore. Mancha colocando una gota de 1% Toluidine Blue O (w/v) en 1% solución de ácido bórico (w/v) sobre las secciones durante 30 s. Enjuague y observe bajo el microscopio.
   3. Al encontrar la estructura deseada, transfiera una o dos secciones a cada gota de ddH₂O colocada previamente en cada pozo de una diapositiva de reacción limpia.
   4. Coloque cada tobogán en una placa de Petri cuadrada cerrada de 10 cm y déjela secar a 50 °C.
   5. Almacene las diapositivas en un cuadro de archivo limpio hasta su uso.

4. Inmunolocalización

NOTA: El procedimiento de inmunolocalización fluorescente se basa en el uso secuencial de dos anticuerpos. El anticuerpo primario se eleva contra un antígeno objetivo específico. El anticuerpo secundario se eleva específicamente contra el anticuerpo primario y para las técnicas fluorescentes se conjuga a un fluoróforo (FITC en este protocolo específico). El anticuerpo principal se utilizará para detectar el antígeno objetivo en la muestra, y el anticuerpo secundario se utilizará para marcar la ubicación donde el anticuerpo primario conectado a la muestra después de lavar el exceso de anticuerpo primario. Los controles son una parte importante de este ensayo y siempre deben realizarse para asegurar la precisión de las observaciones. Un pozo en la diapositiva debe reservarse para su uso como control negativo, donde se omitirá el tratamiento de anticuerpos primarios, y por lo tanto no se debe observar ninguna señal al final del experimento. En el experimento debe incluirse un control positivo tratando un pozo con un anticuerpo cuyo etiquetado ya es conocido y cierto. El control positivo se utiliza para confirmar la eficacia secundaria del etiquetado de anticuerpos y las condiciones de reacción, mientras que el control negativo prueba la especificidad secundaria de anticuerpos.

1. Prepare una cámara de incubación colocando algunas toallas de papel humedecidas en la parte inferior de una caja de puntas de pipeta y envolviéndola con papel de aluminio(Figura suplementaria 1B-1E). Coloque los portaobjetos en la cámara de incubación.
2. Pipeta una caída de 50 μL por pozo de 8 mm de solución de bloqueo (5% leche seca sin grasa (w/v) en 1 M PBS) e incubar durante 10 min. Retire la solución de bloqueo y lave todos los pozos dos veces con PBS durante 10 minutos.
3. Preparar las soluciones principales de anticuerpos (véase la Tabla Suplementaria 1),anticuerpo 1:5 (v/v) en solución de bloqueo; hacer una estimación de aproximadamente 40 μL por pozo de 8 mm.
   NOTA: La concentración del anticuerpo debe ajustarse de acuerdo con el protocolo de la fabricación.
4. Realice un lavado final con ddH₂O durante 5 minutos, nunca deje que los pozos se sequen por completo.
5. Pipetear la solución principal de anticuerpos a los pozos de reacción. Solución de bloqueo de pipetas a los pozos de control.
6. Cierre la cámara de incubación y deje pararse durante 2 h a temperatura ambiente seguido de la noche a la mañana a 4 °C. Preparar la solución secundaria de anticuerpos, 1% en solución de bloqueo (v/v) de aproximadamente 40 μL por pozo. Manténgalo cubierto con papel de aluminio.
7. Lave todos los pozos dos veces con PBS durante 10 minutos, seguido de 10 minutos adicionales con ddH₂O. Asegúrese de que ningún rastro de la solución de bloqueo o depósitos sea visible en los pozos.
8. Pipetear la solución secundaria de anticuerpos a todos los pozos. A partir de ahora, proteja las diapositivas de la luz.
9. Incubar durante 3-4 h en la oscuridad a temperatura ambiente.
10. Lave todos los pozos dos veces durante 10 minutos con PBS seguido de otro lavado de 10 minutos con ddH₂O.
11. Aplique una gota de calcofluor (1:10.000 (w/v) fluorescente más brillante 28 en PBS) a cada pozo. Sin lavar, aplique una gota de medio de montaje (ver Tabla de materiales)a cada pozo y coloque un tapa-cubierta (Figura 1H).
12. Observe con un microscopio de fluorescencia, equipado con lente 10x/0.45, 20x/0.75, 40x/0.95 y 100x/1.40, utilice filtros UV (para mancha de calcofluor) y FITC, para detectar la pared celular y la inmunolocalización respectivamente(Figura 1I). Utilice las siguientes longitudes de onda: excitación/emisión (nm) 358/461 para UV y 485/530 para FITC.
13. Para una mejor visualización de los resultados se superponen ambas imágenes con ImageJ o similar.

Resultados

En un experimento exitoso, el anticuerpo secundario identificará específicamente la ubicación del epítopo específico en verde brillante, de manera consistente, permitiendo la caracterización de la composición de la pared celular en una cierta etapa de desarrollo de la célula, tejido u órgano. Por ejemplo, el anticuerpo LM6 tiene una alta afinidad por 1,5-arabinan, un compuesto con rhamnogalacturonan tipo I que se puede encontrar etiquetando abundantemente la pared celular del anéter quercus suber en de...

Discusión

El método de inmunolocalización fluorescente en las plantas aquí descrito, aunque sin problemas sencillo, se basa en el éxito de varios pasos pequeños. El primero de los cuales es la preparación y fijación de muestras. Durante este primer paso, se utiliza una mezcla de formaldehído y glutaraldehído para reenlazar la mayoría de los componentes celulares. El formaldehído en la solución proporciona una fijación suave y reversible, mientras que el glutaraldehído proporciona una fuerte vinculación más permanen...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
25% (w/v) Gluteraldehyde	Agar Scientific	AGR1010	aq. Solution, methanol free
8 wells Glass reaction slides	Marinfeld	MARI1216750	other brands may be used
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produced in GOAT	Sigma-Aldrich	F6258
cover slips, 24 mm x 50 mm	Marinfeld	MARI0100222	The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used
ddH2O	na	na
Absolute ethanol	na	na
Fluorescent brightner 28	Sigma-Aldrich	F-6259
Gelatin capsules	Agar scientific	AGG29211	The capsule size should fit the size of the sample.
Glass vials	na	na	Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be cleaned with 96% ethanol after use to remove LR-White residue and reused.
LR-white medium grade, embdeding resin	Agar Scientific	AGR1281	LR-White comes in several forms; the medium grade provides an adequate cutting support for most tissues, while for harder tissues a harder grade of LR-white may be recommendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please follow the instructions of the supplier to prepare the resin.
Non fat dry milk	Nestlé	na	any non fat dry milk is adequate
Oven	na	na	generic laboratory oven
Petri dish, 10 cm x 10 cm square	na	na
PIPES	Sigma Aldrich	P1851
Rat generated Monoclonal Anti-Body	Plant probes	na	Several antibodies that recognize cell wall components are available at both the Complex Carbohydrate research center (CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of some commonly used MABS and where they can be purchased is presented in Supplemental Table 1
Razor blades	na	na	regular razor blades
SDS	Sigma-Aldrich	L6026
Toluidine Blue-O	Agar Scientific	AGR1727
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Ultramicrotome	Leica Microsystems	UC7
Upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters	Leica Mycrosistems	DMLb
Vacuum chamber	na	na
Vacuum pump	na	na
Vectashield	vecta Labs	T-1000	Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An anti-fade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.)