用于大型精子细胞三维共焦分析的全山 嗜血杆菌 睾丸免疫染色

摘要

我们在这里提出了一个改进的协议，为全安装准备和免疫染色的 嗜血杆菌 睾丸，适合共焦显微镜，也允许可重复和可靠的标签。我们通过对大型S4-S5精子细胞的同位素化实验进行3D表示和量化来说明此协议。

摘要

嗜血 性睾丸是研究生物过程的强大模型系统，包括干细胞生物学、核结构、肌瘤和精子发育。然而，由于抗体渗透，整个 嗜血杆菌 睾丸的免疫带通常与染色的严重不均匀性有关。压扁的准备工作只是部分克服了这个问题，因为它降低了分析的3D质量。在此，我们描述了使用NP40和六烷在固定过程中与液体介质免疫带的全安装协议。它保留了适合共焦显微镜的体积以及可重复和可靠的标签。我们展示了不同的例子，从共聚焦部分的精子细胞核的3D重组。睾丸内部和睾丸间可重复性允许不同基因型的单个细胞之间的荧 光 进行3D定量和比较。我们使用了核内造币厂结构（含Mad1的核领土内部）的不同组件以及与核孔复合物相关的两个组件来说明该协议及其在睾丸最大细胞S4-S5精子细胞上的应用。

引言

果蝇睾丸是研究核建筑的宝贵模型。在线粒体精子癌细胞中，核体积主要被色质所占据。这些细胞经过四轮分裂，产生16个原发性精子细胞的囊肿。在接下来的几天里，精子细胞通过6个发育阶段（S1-S6），体积大大增加，大约是20倍^1，2。它们也改变了其核形态。层压 Dm0 揭示的原子核轮廓变得不规则，并显示深层入侵^1，3。伴随着广泛的基因表达变化和改变染色质组织^{1，4，5，6，7。}相间染色体在S4-S5阶段定义明确，形成三个不同的质量，对应于2个主要双价自体体和与核对接的X-Y对。

Mad1 最初被隔离为线粒体检查点的关键部分（在⁸中审查）。在相间，它被描述为主要位于核信封，但也在核质^{9，10，11。}在嗜血杆菌睾丸中，我们报告说，Mad1在核质中很突出，与两种主要的自体染色质质量密切相关，在较小程度上与XY色素有关。我们定义这种染色质相关结构为MINT（含Mad1核内领土^）12。其他四种蛋白质与精子细胞中的MINT相关:核苷Mtor/Tpr、SUMO肽酶乌尔普1、线粒体检查点蛋白Mad2和类似聚团的复合Raf2¹²的亚单位。

为了完成对MINT的描述，我们需要使用抗体，并面临着睾丸中免疫稳定通常遇到的技术问题:渗透性差，导致睾丸深度的污渍严重不均匀，特别是在 大型精子细胞中。S消解制剂 增加了抗体访问，但 导致压缩图像，限制3D分析， 并 防止定量荧光的测量 ，包括同位素化。抗体渗透的问题也可以通过渗透剂，如0.3%纳脱氧色素¹³来解决，但这个程序并没有在我们手中产生可重复的结果。因为我们进行了许多联合标记实验，我们期待改进渗透协议。1% NP40 加希普坦的组合导致更多的可重复性，特别是在研究大型精子细胞方面。

本协议对悬浮睾丸进行固定和免疫维护，提高样品质量，提高可重复性，使其适合共聚焦显微镜。我们利用该协议更好地定义某些核包络蛋白与大型精子细胞核质结构的空间关系。这种方法将允许更好地研究伴随精子细胞发育的变化，例如细胞核的动态结构变化，包括色素、核质和核毛孔。

研究方案

1. 德罗索菲拉睾丸收藏

注:年轻男性（0-15小时后关闭）是检查双体生殖细胞（即精子卵细胞和精子细胞）所必需的。

1. 尽可能多地选择幼蝇，以尽量减少来自发育精子的干扰。
2. 麻醉苍蝇通过短暂接触二氧化碳和转移到飞垫^14，15。
3. 在解剖显微镜（10倍放大），使用钳子去除头部。
4. 将 5 到 10 只被斩首的苍蝇转移到 100 μL 的林格缓冲区（183 mM KCI、47 mM NaCl、10 mM Tris-HCI、1 mM EDTA、完整的蛋白质抑制剂、pH 6.8）在黑色背景支撑下的硅胶涂层玻璃滑梯上。
5. 解剖显微镜的放大倍数为40倍，使用一对5号钳子在胸腔和腹部之间保持苍蝇，并用其他钳子将腹部从胸腔拉开。迅速将睾丸和相邻组织从飞尸体¹⁵中分离出来，并在同一滑梯上放置一滴新的林格缓冲器。
6. 所有睾丸准备好后，从剩余的组织（辅助腺体和外生殖器）中清洁睾丸。
7. 从包含解剖睾丸的滴中取出多余的缓冲区。通常，使用 p200 移液器，在 200μL 尖端顶部安装 10 μL 尖端。这允许通过一个小孔径去除多余的液体。将4%的甲醛固定在含有解剖睾丸的液滴上，然后迅速将睾丸转移到含有新鲜固定溶液的管子上。

2. 甲醛固定

1. 使用前准备 2 mL 的固定溶液:在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中稀释 4% 副甲醛的 600 μL，其中 30 μL 的 NP40 20% 加 1200 μL 的乙烷在 2 mL 硅化微中微富格管中。在 600μL 单环中使用 4% 的 PBS 中副甲醛，储存在 -20°C。
   注意:甲烷和甲醛是有毒的，应在烟灰罩中处理。按照主办机构的规定处理。
2. 使用带宽孔径尖的 p200 微管将睾丸转移到 PFA/NP40/heptane 解决方案。用手上下摇动管子30s。在室温下继续将睾丸固定在旋转搅拌机上 30 分钟。
3. 停止旋转搅拌机，将管子放在管架中，以便相分离，并让睾丸沉淀到管的底部。
4. 取出所有六烷和固定溶液，用 1 倍 PBS 快速冲洗睾丸三次。
5. 转移到一个干净的200μL单管。在这些小管中执行所有孵化，以最大限度地减少所使用的抗体量。
6. 使用附带 P200 和 P10 提示的 200μL 微皮带去除多余的缓冲区。小心不要吸气睾丸。
7. 将睾丸放在冰上1x PBS中，直到所有样品都准备好。

3. 溶液中的抗体染色

1. 丢弃 PBS，在室温下将睾丸留在 0.3% PBS-T 中 30 分钟，以渗透细胞膜。
2. 在同一缓冲区预孵化，加上5%的正常山羊血清（NGS）1小时。
3. 在 0.3% PBS-T 加上 5% NGS （材料表） 中稀释的主要抗体中加入 200 μL。
4. 在 4 °C（或室温）下在夜间孵化主要抗体，在摇杆上轻轻搅拌。
5. 在室温下在摇动器上用 0.3% PBS-T 清洗 3 次 15 分钟。允许睾丸按重力沉降到管子底部。
6. 从 DyLight 组合系列中添加 200 μL 的二次抗体稀释 1:500。
7. 在室温下在暗室中孵育二次抗体4小时。
8. 在室温下在摇动器上清洗 0.3% PBS-T 15 分钟。然后重复0.2%PBS-T和0.1%PBS-T，每次在室温下在摇动器上30分钟。在 1 倍 PBS 中进行 30 分钟的最终洗涤，以去除洗涤剂。
9. 在 1 倍 PBS 中以 1μg/mL 的速度加入 180μL 的 DAPI 解决方案，15 分钟。库存溶液为 H 2 O 中的₁₀毫克/mL，避免在 PBS 中制作库存溶液，从而减少较大精子细胞中扩散染色质上的 DAPI 染色信号。
10. 每次洗3次5分钟。
11. 使用疏水屏障笔在干净的滑梯上画一个圆圈。
12. 吸气睾丸，并把它们放在幻灯片上。用 0.1% PBS-T 预冲洗宽孔径尖可防止睾丸粘在尖端上。删除多余的 PBS。
13. 添加一滴（约100μL）的花旗流体AF1。
14. 轻轻将玻璃盖在纸巾上，小心避免诱捕气泡。
15. 使用透明指甲油将盖片密封在滑梯上。
16. 观察显微镜上的幻灯片。

4. 同地分析

1. 获取对焦图像。我们使用了蔡司 LSM 710 共焦显微镜 （63x 计划杏色油）， z 分辨率为 0.5 或 1 μm。
2. 从独立睾丸中选择不同的细胞。
3. 将图像导入到处理软件（例如，Imaris）。
4. 通过手动分割来定义原子核，以排除相邻的核。使用科洛克软件;它收集皮尔逊的相关系数（PCCs）在整个体积之间的2个氟磷。

结果

获得充分染色的Drosophila睾丸的主要障碍是抗体的渗透性有限，通过使用压扁制剂部分解决，但代价是导致对3D分析的限制（例如3D表示或同地测量）。该程序允许统一标记，并保留睾丸所有细胞的体积。在这里，我们重点介绍了S4-S5精子细胞的3D表示方法，因为它们是最大的细胞，因此对挤压变形更敏感。我们使用了不同的核标记，包括核苷酸和核内薄荷域（含Mad1核领土）的标签，由线粒体蛋白Mad...

讨论

该协议为成功免疫全安装成人嗜血杆菌睾丸提供了一种方法。正如在其他程序中报告，年轻男性必须使用（我们甚至缩短年龄到20小时后，关闭），以尽量减少发展精子的存在，这有可能阻碍精子细胞。解剖应快速进行，抗体稀释必须进行调整，以优化信号与噪声比^{21、22、23。}因为使用其他协议，我们没有观察到整个睾丸深度?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila srains
ketelGFP y; ketelGFP/y+CyO			Gift from A. Debec (Institut Jacques Monod, UMR 7592, Paris, France)
Mad1-GFP			J Cell Sci. 2011 May 15;124(Pt 10):1664-71.
Mtor RNAi	VDRC	ID 110218	Vienna Drosophila RNAi Center
Materials
DAPI	Thermo	D1306	Stock solution must be prepared in H2O
Dumont # 5 Fine Forseps	Fine Science Tools
MBP Wide Bore Pipette Tips	Fisherbrand	11917744	Wide aperture tip
Thermo Scientific 0.2 mL Individual Tube	Thermo	AB-0620
2 ml micro centrifuge tubes	Sigma	T3531-200EA	Siliconized 2ml tube
Citifluor AF1	Citifluor	AF1
Dakopen	Sigma	Z377821-1EA
Normal Goat Serum (NGS)	Sigma	NS02L-1ML
Paraformaldehyde 4%	Sigma	P6148-500G	Paraformaldehyde (4%) dissolved in PBS 1X ; aliquot by 600 ml
PBS 1X	Thermo	14190094	DPBS, no calcium, no magnesium
0.1% (0.2 or 0.3%) PBS-T			PBS 1X  containing 0.1% (0.2 % or 0.3%) Triton X-100
Triton X-100, for molecular biology,	Sigma	T8787
Antibodies
GFP booster	Chromotek	gba488	1/200
Mouse anti-Mtor			1/40 gift from J. Johansen, Iowa State University
Rat anti-Nup62			1/200 gift from H. Ohkura (University of Edinburgh, UK
Guinea-pig anti-Ulp1			1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam
Rabbit anti-Raf2			1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam
DyLight conjugated series	Thermo		1/500 Donkey anti-(guinea-pig, mouse,  rabbit or rat) as second antibodies