대형 정자 세포의 3D 공초점 분석을 위한 전산 Drosophila 고환의 면역 염색

요약

우리는 여기에 공초점 현미경 검사법에 적합하고 재현 가능하고 신뢰할 수있는 라벨을 허용 Drosophila 고환의 전체 마운트 준비 및 면역 스테인링을위한 향상된 프로토콜을 제시합니다. 우리는 대형 S4-S5 정자 세포에 대한 공동 지역화 실험의 3D 표현 및 정량화에 의해이 프로토콜을 설명합니다.

초록

Drosophila 고환은 줄기 세포 생물학을 포함하여 생물학 프로세스를 공부하기 위한 강력한 모형 시스템, 핵 건축, meiosis 및 정액 발달. 그러나, 전체 Drosophila 고환의 면역 라벨링은 항체 침투로 인한 염색의 중요한 비 균일성과 수시로 연관된다. 분석의 3D 품질을 감소하기 때문에 분쇄 된 준비는 부분적으로 문제를 부분적으로 극복합니다. 본 명세서에서는 액체 매체의 면역 라벨링과 함께 고정 시 NP40 및 heptane을 사용하여 전체 마운트 프로토콜을 설명합니다. 그것은 재현 가능하고 신뢰할 수있는 라벨과 함께 공초점 현미경 검사법에 적합한 볼륨을 보존합니다. 우리는 공초점 섹션에서 정자 세포 핵의 3D 재구성의 다른 예를 보여줍니다. 장 내 및 고환 간 재현성은 상이한 유전자형으로부터 단일 세포 간의 형광의 3D 정량화 및 비교를 허용합니다. 우리는 핵 내 MINT 구조 (Mad1 함유 인트라 핵 영토)의 다른 구성 요소뿐만 아니라 핵 모공 복합체와 관련된 두 가지 구성 요소를 사용하여 이 프로토콜과 시험의 가장 큰 세포인 S4-S5 정자 세포에 대한 응용 프로그램을 설명했습니다.

서문

드로소필라 고환은 핵 건축 연구를 위한 귀중한 모델입니다. 미토틱 정자 세포에서 핵 부피는 주로 크로마틴에 의해 점유됩니다. 이 세포는 16개의 1차 정자세포의 낭종을 생성하는 분열의 4라운드를 겪습니다. 다음 며칠 동안, 정자 세포는 6 개의 발달 단계 (S1-S6)를 통과하며, 부피가 크게 증가하여 20 배^1,2. 그들은 또한 그들의 핵 형태를 변경. 라빈 Dm0에 의해 드러난 핵의 윤곽은 불규칙해지고 깊은 질^1,3을나타낸다. 이는 크로마틴 조직^{1,4,5,6,7에서}광범위한 유전자 발현 변화 및^{수정을 수반한다.} 단계 간 염색체는 단계 S4-S5에서 잘 정의되어 있으며, 2개의 주요 이중성 자가솜과 뉴클레오투스로 도킹된 X-Y 쌍에 대응하는 3개의 뚜렷한 질량을 형성한다.

Mad1은 원래 미토틱 체크포인트의 핵심 성분으로^{격리되었습니다(8에서}검토됨). 상간에서, 핵봉투에 주로 위치하는 것으로 설명되고 핵9,^10,11에있다. 드로소필라 고환에서, 우리는 Mad1이 핵에 두드러진 것을 보고했습니다, 밀접하게 두 개의 주요 염색체 염색체질량과 연결되고 XY 크로마틴과 더 적은 정도에. 우리는 이 크로마틴 관련 구조를 민트(Mad1 함유 핵 영토)^12로정의하였다. 네 가지 다른 단백질은 정자 세포에서 MINTs와 연관되었다: 뉴클레오포린 Mtor/Tpr, SUMO 펩티다아제 Ulp1, 미토틱 체크포인트 단백질 Mad2 및 폴리콤 과 같은 복합 Raf2^12의서브유닛.

MINTs의 설명을 완료하기 위하여는, 우리는 항체를 이용해야 하고 일반적으로 고환에 있는 면역 염색과 가진 기술적인 문제에 직면했습니다: 고환의 깊이에 얼룩의 중요한 비 균일성의 결과로, 특히 큰 정자 세포에. Squashed 준비는 항체 접근을 증가시켰지만 압축 된 이미지로 이어졌고, 3D 분석을 제한하고, 공동화를 포함한정량형 형광의 측정을 방지했다. 항체 침투의 문제는 또한 0.3% Na deoxycholate^13과같은 permeabilizing 에이전트에 의해 해결될 수 있었습니다, 그러나 이 절차는 우리의 손에 재현가능한 결과를 산출하지 않았습니다. 우리는 많은 공동 라벨 링 실험을 수행했기 때문에, 우리는 permeabilization 프로토콜을 개선하기 위해 보았다. 1% NP40 플러스 헵탄의 조합은 특히 큰 정자 세포를 연구하는 데 더 많은 재현성을 초래했습니다.

이 프로토콜은 서스펜션에서 고환의 고정 및 면역 스테인링을 수행하여 샘플 품질을 개선하고 재현성을 향상시키고 공초점 현미경 검사에 적합합니다. 우리는 큰 정자 세포의 핵 폐색 구조와 특정 핵 봉투 단백질의 공간 관계를 더 잘 정의하기 위해 프로토콜을 사용했습니다. 이 방법은 예를 들어 크로마틴, 핵염 및 핵 모공을 포함한 핵의 동적 구조적 변화와 정자 세포 발달을 수반하는 변화에 대한 더 나은 조사를 허용할 것이다.

프로토콜

1. 드로소필라 고환 컬렉션

참고: 젊은 남성 (0-15 h 포스트 백과) diploid 세균 세포를 검사하는 데 필요합니다 (즉, 정자 고니아 및 정자 세포).

1. 정자 개발에서 간섭을 최소화하기 위해 가능한 한 많이 젊은 파리를 선택합니다.
2. 이산화탄소에 잠깐 노출되어 파리를 마취하고 플라이 패드^14,15로옮김한다.
3. 해부 현미경 (10 배율)에서, 머리를 제거하기 위해 집게를 사용합니다.
4. 5~10개의 참수된 파리를 링거의 완충제(183m MM KCI, 47m NaCl, 10mM Tris-HCI, 1mM EDTA, 완전한 단백질 억제제, pH 6.8)로 이동하여 검은 배경 지지대에서 실리콘 코팅 유리 슬라이드를 장착한다.
5. 40배율에서 해부현미경으로, 흉부와 복부 사이를 날아다니는 5번 집게 1쌍을 사용하고, 다른 집게와 함께 흉부에서 복부를 끌어당깁니다. 고환과 인접한 조직을 플라이^{시체(15)에서} 빠르게 격리하고 링거의 버퍼를 같은 슬라이드에 새로 한 방울 로 떨어뜨립니다.
6. 모든 고환이 준비되면 나머지 조직 (액세서리 선 및 외부 생식기)에서 고환을 청소하십시오.
7. 해부된 고환을 포함하는 낙하에서 초과 버퍼를 제거합니다. 일반적으로 200 μL 팁 위에 10 μL 팁이 장착된 p200 파이펫을 사용하십시오. 이렇게 하면 작은 조리개를 통해 액체 과잉을 제거할 수 있습니다. 해부 된 고환을 포함하는 드롭 위에 4 %의 파라 포름알데히드 고정을 한 다음 고환을 신선한 고정 솔루션을 포함하는 튜브로 신속하게 전송합니다.

2. 파라포름알데히드 고정

1. 사용하기 직전에 2mL의 고정 용액을 준비하십시오: NP40 20%의 30 μL과 2m 실리콘 마이크로센트리슈지 튜브에 1200 μL의 30μL을 가진 인산염 완충식식염(PBS)에서 희석된 4% 파라포름알데히드의 600 μL. 600 μL 알리쿼트에 제조및 -20 °C에 저장 PBS에서 4 %의 파라 포름 알데히드를 사용합니다.
   주의: 헵탄과 파라포름알데히드는 독성이 있으며 연기 후드로 처리해야 합니다. 호스트 연구소의 규정에 따라 처분하십시오.
2. PFA/NP40/heptane 용액에 넓은 조리개 팁이 있는 p200 마이크로파이펫을 사용하여 고환을 전송합니다. 튜브를 30s의 위아래로 흔들어 줍니다. 실온에서 로터리 믹서에 고환을 30분 동안 계속 고정하십시오.
3. 로터리 믹서를 중지하고 튜브랙에 튜브를 배치하여 위상 분리를 허용하고 고환이 튜브의 바닥에 정착할 수 있도록 합니다.
4. 모든 heptane 및 고정 솔루션을 제거하고 1x PBS로 고환을 세 번 빠르게 헹구습니다.
5. 깨끗한 200 μL 개별 튜브로 옮김합니다. 이 작은 관에 있는 모든 잠복기를 수행하여 채택된 항체의 양을 최소화하십시오.
6. P200과 P10 팁이 모두 부착된 200 μL 마이크로파이프를 사용하여 초과 버퍼를 제거합니다. 고환을 흡인하지 않도록 주의하십시오.
7. 모든 샘플이 준비될 때까지 고환을 얼음 위에 1배 PBS로 보관하십시오.

3. 용액에 항체 염색

1. PBS를 폐기하고 세포막을 투과화하기 위해 실온에서 30 분 동안 0.3 % PBS-T로 고환을 둡니다.
2. 동일한 버퍼에 사전 배양하고 1h의 일반 염소 혈청(NGS)을 5% 더한 값입니다.
3. 0.3% PBS-T 플러스 5% NGS(재료표)로 희석된 1차 항체의 200 μL을추가합니다.
4. 로커에 부드러운 동요와 함께 4 °C (또는 실온)에서 하룻밤 기본 항체를 배양.
5. 실온에서 로커에서 15 분 동안 0.3 % PBS-T에서 3 번 세척하십시오. 고환이 중력에 의해 튜브의 바닥에 정착할 수 있도록 합니다.
6. DyLight 공액 계열에서 희석된 이차 항체 의 200 μL을 1:500로 추가합니다.
7. 실온에서 4 시간 동안 어두운 챔버에서 이차 항체를 배양하십시오.
8. 실온에서 로커에서 0.3% PBS-T로 15분 간 세척합니다. 그런 다음 0.2 % PBS-T와 0.1 % PBS-T로 반복되며 실온에서 로커에서 30 분 동안 매번 반복하십시오. 세제를 제거하기 위해 30 분 동안 1 x PBS에서 마지막 세척을하십시오.
9. 1x PBS에 1μg/mL에 180 μL의 DAPI 용액을 15분 간 추가합니다. 주식 용액은 H₂O. PBS에서 재고 용액을 만들지 않도록 10 mg / mL이며, 이는 더 큰 정자 세포에서 확산 크로 마틴에 DAPI 염색 신호를 줄일 수 있습니다.
10. 각각 3배씩 5분 동안 씻으시다.
11. 소수성 장벽 펜을 사용하여 깨끗한 슬라이드에 원을 그립니다.
12. 흡습 고환을 넣고 슬라이드에 넣습니다. 0.1% PBS-T로 넓은 조리개 팁을 미리 헹구면 고환이 팁에 달라붙지 않도록 합니다. 초과 PBS를 제거합니다.
13. Citifluor AF1의 드롭(약 100 μL)을 추가합니다.
14. 유리 덮개 를 조직 위에 부드럽게 놓고 기포를 포획하지 않도록주의하십시오.
15. 투명 매니큐어를 사용하여 커버슬립을 슬라이드에 밀봉합니다.
16. 현미경에 슬라이드를 관찰.

4. 지역화 분석

1. 공초점 이미지를 수집합니다. 우리는 0.5 또는 1 μm의 z 해상도와 자이스 LSM 710 공초점 현미경 (63x 계획 아포크로틱 오일)을 사용했다.
2. 독립적 인 고환에서 다른 세포를 선택합니다.
3. 이미지를 프로세싱 소프트웨어(예: Imaris)로 가져옵니다.
4. 인접한 핵을 배제하기 위해 수동 세분화에 의해 핵을 정의한다. Coloc 소프트웨어를 사용합니다. 2형형형량 사이의 전체 부피 내에서 Pearson의 상관계수(PcC)를 수집합니다.

결과

Drosophila 고환의 적당한 얼룩을 얻기에 있는 주요 장애물은 항체의 제한된 침투성입니다, 이는 부분적으로 분쇄된 준비를 사용하여 서 그러나 3D 분석의 제한을 유도하는 대가로 (예를 들면 3D 표현 또는 공동화의 측정)를 유도해서 부분적으로 해결되었습니다. 절차는 균일 한 라벨을 허용하고 고환의 모든 세포의 볼륨을 보존. 여기에서 우리는 S4-S5 정자 세포의 3D 표현에 방법의 그림을 집중했습니?...

토론

이 프로토콜은 전체 마운트 성인 Drosophila 고환의 성공적인 면역 라벨링을위한 방법을 제공합니다. 그밖 절차에서 보고된 바와 같이 젊은 남성은 정자를 방해하는 리스크가 있는 발달 정액의 존재를 극소화하기 위하여 (우리는 심지어 백과기 후에 20 시간 미만으로 나이를 단축했습니다) 이용되어야 합니다. 해부는 신속해야 하며 항체 희석은 신호 대 잡음^비(21,

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila srains
ketelGFP y; ketelGFP/y+CyO			Gift from A. Debec (Institut Jacques Monod, UMR 7592, Paris, France)
Mad1-GFP			J Cell Sci. 2011 May 15;124(Pt 10):1664-71.
Mtor RNAi	VDRC	ID 110218	Vienna Drosophila RNAi Center
Materials
DAPI	Thermo	D1306	Stock solution must be prepared in H2O
Dumont # 5 Fine Forseps	Fine Science Tools
MBP Wide Bore Pipette Tips	Fisherbrand	11917744	Wide aperture tip
Thermo Scientific 0.2 mL Individual Tube	Thermo	AB-0620
2 ml micro centrifuge tubes	Sigma	T3531-200EA	Siliconized 2ml tube
Citifluor AF1	Citifluor	AF1
Dakopen	Sigma	Z377821-1EA
Normal Goat Serum (NGS)	Sigma	NS02L-1ML
Paraformaldehyde 4%	Sigma	P6148-500G	Paraformaldehyde (4%) dissolved in PBS 1X ; aliquot by 600 ml
PBS 1X	Thermo	14190094	DPBS, no calcium, no magnesium
0.1% (0.2 or 0.3%) PBS-T			PBS 1X  containing 0.1% (0.2 % or 0.3%) Triton X-100
Triton X-100, for molecular biology,	Sigma	T8787
Antibodies
GFP booster	Chromotek	gba488	1/200
Mouse anti-Mtor			1/40 gift from J. Johansen, Iowa State University
Rat anti-Nup62			1/200 gift from H. Ohkura (University of Edinburgh, UK
Guinea-pig anti-Ulp1			1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam
Rabbit anti-Raf2			1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam
DyLight conjugated series	Thermo		1/500 Donkey anti-(guinea-pig, mouse,  rabbit or rat) as second antibodies