Imunostaining de Testes Drosophila de Monte Inteiro para Análise Confocal 3D de Grandes Espermatocitos

Resumo

Apresentamos aqui um protocolo aprimorado para a preparação e imunossagem completa de testículos Drosophila, adequados para microscopia confocal e também permitindo rotulagem reprodutível e confiável. Ilustramos este protocolo por representação 3D e quantificação de experimentos de colocalização nos grandes espermatos S4-S5.

Resumo

Os testículos de drosophila são um poderoso sistema modelo para estudar processos biológicos, incluindo biologia de células-tronco, arquitetura nuclear, meiose e desenvolvimento de espermatozoides. No entanto, a imunolabelação de todo o teste de Drosophila é frequentemente associada com significativa não uniformidade da coloração devido à penetração de anticorpos. As preparações esmagadas só superam parcialmente o problema, pois diminui a qualidade 3D das análises. Aqui, descrevemos um protocolo de montagem inteira usando NP40 e heptano durante a fixação, juntamente com a imunolabelagem em mídia líquida. Preserva o volume adequado para microscopia confocal juntamente com rotulagem reprodutível e confiável. Mostramos diferentes exemplos de reconstituição 3D de núcleos espermatocitocitos de seções confocal. A reprodutibilidade intra e inter-testes permite quantificação 3D e comparação da fluorescência entre células únicas de diferentes genótipos. Utilizamos diferentes componentes da estrutura de MINT intranuclear (Território Intra Nuclear Contendo Mad1), bem como dois componentes associados ao complexo de poros nucleares para ilustrar este protocolo e suas aplicações nas maiores células dos testis, os espermatozoides S4-S5.

Introdução

Os testículos de drosophila são um modelo valioso para o estudo da arquitetura nuclear. Em células espermatogoniais mitóticas, o volume nuclear é em grande parte ocupado por cromatina. Essas células passam por quatro rodadas de divisão, produzindo um cisto de 16 espermatos primários. Nos dias seguintes, os espermatocitos passam por 6 estágios de desenvolvimento (S1-S6), aumentando consideravelmente em volume, aproximadamente 20^{vezes 1,2}. Eles também mudam sua morfologia nuclear. O contorno do núcleo, revelado pelo lamin Dm0, torna-se irregular e mostra profundas invaginações^1,3. Isso é acompanhado por extensas alterações de expressão genética e modificações na organização cromatina^1,4,5,6,7. Os cromossomos interfásicos são bem definidos no estágio S4-S5, formando três massas distintas correspondentes aos 2 principais autossomos bivalentes e o par X-Y ancorado com o nucleolus.

Mad1 foi originalmente isolado como um componente-chave do ponto de verificação mitótico (revisado em⁸). Na interfase, é descrito como localizado principalmente no envelope nuclear, mas também no nucleoplasma^9,10,11. Em Drosophila testis, relatamos que Mad1 é proeminente no nucleoplasma, intimamente associado com as duas principais massas de cromatina autossômica e em menor grau com a cromatina XY. Definimos esta estrutura associada à cromatina como MINT (Território IntraNuclear contendo Mad1)¹². Quatro outras proteínas foram associadas com MINTs em espermatotos: o nucleoporina Mtor/Tpr, o SUMO peptidase Ulp1, a proteína de checkpoint mitotístico Mad2 e uma subunidade de um complexo de Policomb Raf2¹².

Para completar a descrição dos MINTs, precisávamos usar anticorpos e fomos confrontados com os problemas técnicos geralmente encontrados com imunostendências em testículas: uma má permeabilidade resultando em uma significativa não uniformidade da coloração na profundidade dos testítes, particularmente nos grandes espermatocitos. Aspreparações anuladas aumentaram o acesso a anticorpos, mas levaram a imagens compactadas, restringindo as análises 3D e impedindo a medição da fluorescência quantitativa, incluindo a colocalização. O problema da penetração de anticorpos também poderia ser resolvido por agentes permeabilizadores como 0,3% Na desoxicolato^13,mas este procedimento não resultou em nossas mãos resultados reprodutíveis. Como realizamos muitos experimentos de co-rotulagem, procuramos melhorar o protocolo de permeabilização. A combinação de 1% NP40 mais heptano resultou em mais reprodutibilidade, particularmente no estudo dos grandes espermatos.

Este protocolo realiza a fixação e a imunostenção de testículos na suspensão, melhorando a qualidade da amostra, bem como melhorando a reprodutibilidade, e tornando-a adequada para microscopia confocal. Usamos o protocolo para definir melhor as relações espaciais de certas proteínas de envelope nuclear com as estruturas nucleoplasmáticas de grandes espermatotos. Esse método permitirá melhores investigações das mudanças que acompanham o desenvolvimento de espermatotocitos, como por exemplo as dinâmicas mudanças estruturais do núcleo, incluindo cromatina, nucleoplasma e os poros nucleares.

Protocolo

1. Coleção de testículos de Drosophila

NOTA: Machos jovens (0-15 h pós-eclosão) são necessários para examinar células germinativas diploides (ou seja, espermatogonia e espermatocitocitos).

1. Selecione moscas jovens o máximo possível para minimizar a interferência do desenvolvimento de espermatóides.
2. Anesthetize voa por breve exposição ao dióxido de carbono e transferência para uma plataforma^{de moscas 14,15}.
3. Sob um microscópio dissecando (ampliação de 10x), use fórceps para remover a cabeça.
4. Transfira 5 a 10 moscas decapitadas para 100 μL do buffer de Ringer (183 mM KCI, 47 mM NaCl, 10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, inibidor completo de proteína, pH 6.8) em uma lâmina de vidro revestida de silicone em um suporte de fundo preto.
5. Com microscópio dissecado em uma ampliação de 40x, use um par de fórceps número 5 para segurar uma mosca entre o tórax e o abdômen, e, com outros fórceps, puxe o abdômen para longe do tórax. Isole rapidamente os testículos e tecidos adjacentes da carcaça¹⁵ e coloque em uma nova gota do tampão de Ringer no mesmo slide.
6. Quando todos os testículos estiverem prontos, limpe os testículos dos tecidos restantes (glândula acessório e genitália externa).
7. Remova o excesso de tampão da gota contendo os testículos dissecados. Normalmente, use uma pipeta p200 com uma ponta de 10 μL instalada em cima de uma ponta de 200 μL. Isso permite a remoção do excesso de líquido através de uma pequena abertura. Coloque uma queda de 4% de paraformaldeído fixador em cima da gota contendo os testículos dissecados e, em seguida, transfira rapidamente os testículos para um tubo contendo solução fixativa fresca.

2. Fixação de paraformaldeído

1. Prepare 2 mL de solução fixa pouco antes do uso: 600 μL de 4% de paraformaldeído diluído em soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) com 30 μL de NP40 20% mais 1200 μL de heptano em um tubo de microcentrifuge siliconado de 2 mL. Use 4% de paraformaldeído em PBS preparado em alíquotas de 600 μL e armazenado a -20°C.
   Atenção: Heptano e paraformaldeído são tóxicos e devem ser manuseados em um capô de fumaça. Elimine-os de acordo com as normas do instituto anfitrião.
2. Transfira os testículos usando uma micropipette p200 com uma ampla ponta de abertura para a solução PFA/NP40/heptane. Aperte o tubo para cima e para baixo por 30 s à mão. Continue consertando os testículos em uma batedeira rotativa à temperatura ambiente por 30 minutos.
3. Pare a batedeira rotativa e coloque o tubo em um rack de tubo para permitir a separação de fase e para que os testículos se acomodem na parte inferior do tubo.
4. Remova todo o heptano e a solução fixa e enxágue os testículos rapidamente três vezes com 1x PBS.
5. Transfira para um tubo individual limpo de 200 μL. Realizar todas as incubações nestes pequenos tubos para minimizar as quantidades de anticorpos empregados.
6. Remova o excesso de tampão usando uma micropipette de 200 μL com uma p200 e uma ponta P10 anexada. Tome cuidado para não aspirar testículos.
7. Mantenha os testículos em 1x PBS no gelo até que todas as amostras estejam prontas.

3. Coloração de anticorpos em solução

1. Descarte o PBS e deixe testículos em 0,3% PBS-T por 30 minutos à temperatura ambiente para permeabilizar as membranas celulares.
2. Pré-incubação no mesmo tampão mais 5% de soro de cabra normal (NGS) por 1 h.
3. Adicionar 200 μL do anticorpo primário diluído em 0,3% PBS-T mais 5% NGS(Tabela de Materiais).
4. Incubar o anticorpo primário durante a noite a 4 °C (ou temperatura ambiente) com agitação suave em um roqueiro.
5. Lave 3 vezes em 0,3% PBS-T por 15 minutos em um roqueiro à temperatura ambiente. Deixe os testículos se acomodarem na parte inferior do tubo pela gravidade.
6. Adicione 200 μL de anticorpo secundário diluído 1:500 da série conjugada DyLight.
7. Incubar o anticorpo secundário em uma câmara escura por 4h à temperatura ambiente.
8. Lave em 0,3% PBS-T por 15 minutos em um roqueiro à temperatura ambiente. Em seguida, repita com 0,2% PBS-T e 0,1% PBS-T, cada vez por 30 min em um roqueiro à temperatura ambiente. Faça uma lavagem final em 1x PBS por 30 minutos para remover o detergente.
9. Adicione 180 μL de solução DAPI a 1 μg/mL em 1x PBS por 15 min. A solução de estoque é de 10 mg/mL em H₂O. Evite fazer solução de estoque em PBS, o que pode reduzir o sinal de coloração da DAPI em cromatina difusa em espermatocitocitos maiores.
10. Lave 3x por 5 min cada.
11. Use uma caneta de barreira hidrofóbica para desenhar um círculo em um escorregador limpo.
12. Aspirar testículos e colocá-los no slide. Pré-enxaguar a ponta de abertura larga com 0,1% pbs-t impede que os testículos grudem na ponta. Remova o excesso de PBS.
13. Adicione uma gota (aproximadamente 100 μL) do Citifluor AF1.
14. Coloque delicadamente uma tampa de vidro sobre o tecido, tomando cuidado para evitar a captura de bolhas de ar.
15. Sele a mancha de cobertura no slide usando esmalte transparente.
16. Observe slides em um microscópio.

4. Análises de colocalização

1. Adquira imagens confocal. Utilizamos um microscópio confocal Zeiss LSM 710 (óleo apocromático plano 63x) com uma resolução z de 0,5 ou 1 μm.
2. Selecione diferentes células de testículos independentes.
3. Importar imagens para software de processamento (por exemplo, Imaris).
4. Defina o núcleo por segmentação manual, a fim de excluir os núcleos vizinhos. Use o software Coloc; ele coleta os coeficientes de correlação (PCCs) do Pearson dentro de todo o volume entre 2 fluoroforos.

Resultados

O principal obstáculo para a obtenção de uma coloração adequada dos testículos de Drosophila é a penetrabilidade limitada dos anticorpos, que foi parcialmente resolvida por meio de preparações esmagadas, mas ao custo de induzir uma restrição das análises 3D (por exemplo, representação 3D ou medida de colocalização). O procedimento permite rotulagem uniforme e preserva o volume de todas as células do testis. Aqui focamos a ilustração do método na representação 3D dos espermatos S4-S5, pois são as ma...

Discussão

Este protocolo fornece um método para o bem sucedido imunolabeling de testículos de Drosophila adultos de montagem inteira. Conforme relatado em outros procedimentos, devem ser utilizados os machos jovens (até encurtamos a idade para menos de 20 horas após a eclosão) para minimizar a presença de espermatozoides em desenvolvimento, o que corre o risco de obstruir os espermatocitos. A dissecção deve ser rápida e a diluição do anticorpo deve ser ajustada para otimizar a relação sinal-ruído^21,...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila srains
ketelGFP y; ketelGFP/y+CyO			Gift from A. Debec (Institut Jacques Monod, UMR 7592, Paris, France)
Mad1-GFP			J Cell Sci. 2011 May 15;124(Pt 10):1664-71.
Mtor RNAi	VDRC	ID 110218	Vienna Drosophila RNAi Center
Materials
DAPI	Thermo	D1306	Stock solution must be prepared in H2O
Dumont # 5 Fine Forseps	Fine Science Tools
MBP Wide Bore Pipette Tips	Fisherbrand	11917744	Wide aperture tip
Thermo Scientific 0.2 mL Individual Tube	Thermo	AB-0620
2 ml micro centrifuge tubes	Sigma	T3531-200EA	Siliconized 2ml tube
Citifluor AF1	Citifluor	AF1
Dakopen	Sigma	Z377821-1EA
Normal Goat Serum (NGS)	Sigma	NS02L-1ML
Paraformaldehyde 4%	Sigma	P6148-500G	Paraformaldehyde (4%) dissolved in PBS 1X ; aliquot by 600 ml
PBS 1X	Thermo	14190094	DPBS, no calcium, no magnesium
0.1% (0.2 or 0.3%) PBS-T			PBS 1X  containing 0.1% (0.2 % or 0.3%) Triton X-100
Triton X-100, for molecular biology,	Sigma	T8787
Antibodies
GFP booster	Chromotek	gba488	1/200
Mouse anti-Mtor			1/40 gift from J. Johansen, Iowa State University
Rat anti-Nup62			1/200 gift from H. Ohkura (University of Edinburgh, UK
Guinea-pig anti-Ulp1			1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam
Rabbit anti-Raf2			1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam
DyLight conjugated series	Thermo		1/500 Donkey anti-(guinea-pig, mouse,  rabbit or rat) as second antibodies