חיסון של אשכי דרוזופילה הר שלם לניתוח קונפוקלי תלת מימדי של זרעונים גדולים

Summary

אנו מציגים כאן פרוטוקול משופר להכנה וחיסון של כל ההר של אשכי דרוזופילה, מתאים למיקרוסקופיה קונפוקלית וגם מאפשר תיוג ניתן לשחזור ואמין. אנו ממחישים פרוטוקול זה על ידי ייצוג תלת מימדי וכימות של ניסויי קולוקליזציה על זרעונים S4-S5 גדולים.

Abstract

אשכי דרוזופילה הם מערכת מודל רבת עוצמה לחקר תהליכים ביולוגיים כולל ביולוגיה של תאי גזע, ארכיטקטורה גרעינית, מיוזיס והתפתחות זרע. עם זאת, immunolabeling של האשכים Drosophila כולו קשורה לעתים קרובות עם אי אחידות משמעותית של כתמים עקב חדירת נוגדנים. ההכנות מעוכות רק חלקית להתגבר על הבעיה שכן הוא מקטין את איכות 3D של הניתוחים. בזאת, אנו מתארים פרוטוקול הרכבה שלם באמצעות NP40 והפטן במהלך הקיבעון יחד עם immunolabeling במדיה נוזלית. הוא משמר את עוצמת הקול המתאימה למיקרוסקופיה קונפוקלית יחד עם תיוג ניתן לשחזור ואמין. אנו מראים דוגמאות שונות של שחזור תלת מימדי של גרעיני זרע מחלקים קונפוקליים. השחזור התוך-אשכים והבין-אשכים מאפשר כימות תלת-ממדי והשוואה של פלואורסצנטיות בין תאים בודדים מגנוטיפים שונים. השתמשנו ברכיבים שונים של מבנה MINT תוך-גרעיני (הטריטוריה הגרעינית התוך-גרעינית המכילה Mad1) כמו גם בשני רכיבים הקשורים למתחם הנקבוביות הגרעיניות כדי להמחיש פרוטוקול זה ויישומים שלו על התאים הגדולים ביותר של האשכים, הזרעונים S4-S5.

Introduction

אשכי דרוזופילה הם מודל בעל ערך לחקר האדריכלות הגרעינית. בתאי זרע מיטוטיים, הנפח הגרעיני תפוס במידה רבה על ידי כרומטין. תאים אלה עוברים ארבעה סבבים של חלוקה, לייצר ציסטה של 16 זרעונים ראשוניים. במהלך הימים הבאים, spermatocytes לעבור 6 שלבים התפתחותיים (S1-S6), גדל מאוד בנפח, בקירוב 20-פי^1,2. הם גם משנים את המורפולוגיה הגרעינית שלהם. קווי המתאר של הגרעין, המתגלה על ידי למין Dm0, הופך לא סדיר ומראה invaginations עמוק^1,3. זה מלווה בשינויים ושינויים נרחבים בביטוי גנים בארגון כרומטין^1,4,5,6,7. הכרומוזומים הבין-פאזיים מוגדרים היטב בשלב S4-S5, ויוצרים שלוש מסות נפרדות המתאימות ל-2 האוטוסומים הדו-כיווניים העיקריים ולזוג ה-X-Y המעוגן בגרעין.

Mad1 היה מבודד במקור כמרכיב מרכזי במחסום המיטוטי (נבדק בשנת⁸). ב interphase, הוא מתואר כממוקם בעיקר על המעטפה הגרעינית, אלא גם בגרעין^9,10,11. במבחן דרוזופילה, דיווחנו כי Mad1 בולט בגרעין, הקשור באופן אינטימי עם שתי מסות כרומטין אוטוזומליות גדולות ובמידה פחותה עם כרומטין XY. הגדרנו מבנה זה הקשור לכרומטין כ- MINT (טריטוריה תוך-גרעינית המכילה Mad1)¹². ארבעה חלבונים אחרים היו קשורים MINTs ב spermatocytes: הגרעין Mtor / Tpr, פפטידאז SUMO Ulp1, חלבון מחסום מיטוטי Mad2 ו subunit של קומפלקס דמוי פוליקומב Raf2¹².

כדי להשלים את התיאור של MINTs, היינו צריכים להשתמש בנוגדנים והתמודדנו עם הבעיות הטכניות שנתקלו בדרך כלל עם immunostaining ב testis: חדירות ירודה וכתוצאה מכך אי אחידות משמעותית של כתמים בעומק האשכים, במיוחד בזרעונים הגדולים. ההכנות המודלגות הגבירו את הגישה לנוגדנים אך הובילו לתמונות דחוסות, הגבילו את הניתוחים התלת-ממדיים ומניעת מדידה של פלואורסצנטיות כמותית, כולל קולוקליזציה. הבעיה של חדירת נוגדנים יכולה להיות מטופלת גם על ידי סוכנים מחלחלים כגון 0.3% Na deoxycholate¹³, אבל הליך זה לא בידיים שלנו להניב תוצאות לשחזור. מכיוון שביצענו ניסויים רבים בתיוג משותף, חיפשנו לשפר את פרוטוקול ההחלחלה. השילוב של 1% NP40 בתוספת הפטאן הביא לשחזור רב יותר, במיוחד בחקר הזרעונים הגדולים.

פרוטוקול זה מבצע קיבעון ו immunostaining של האשכים בהשעיה, שיפור איכות המדגם, כמו גם שיפור הרבייה, ועיבוד זה מתאים מיקרוסקופיה confocal. השתמשנו בפרוטוקול כדי להגדיר טוב יותר את היחסים המרחביים של חלבוני מעטפה גרעינית מסוימים עם המבנים הגרעיניים של זרעונים גדולים. שיטה זו תאפשר חקירות טובות יותר של השינויים המלווים את התפתחות הזרע, למשל השינויים המבניים הדינמיים של הגרעין כולל כרומטין, גרעין והנקבוביות הגרעיניות.

Protocol

1. אוסף האשכים של דרוזופילה

הערה: זכרים צעירים (0-15 שעות לאחר eclosion) נחוצים לבדיקת תאי נבט דיפלואיד (כלומר, זרעונים וזרע).

1. בחר זבובים צעירים ככל האפשר כדי למזער את ההפרעה מפיתוח spermatids.
2. הרדמה זבובים על ידי חשיפה קצרה פחמן דו חמצני ולהעביר כרית זבוב^14,15.
3. תחת מיקרוסקופ מנתח (הגדלה 10x), השתמש במלקחיים כדי להסיר את הראש.
4. העבר 5 עד 10 זבובים ערופים ל 100 μL של חיץ של רינגר (183 mM KCI, 47 mM NaCl, 10 mM Tris-HCI, 1 מ"מ EDTA, מעכב חלבון מלא, pH 6.8) על שקופית זכוכית מצופה סיליקון על תמיכה ברקע שחור.
5. עם ניתוח מיקרוסקופ בהגדלה של פי 40, השתמש בזוג אחד של מלקחיים מספר 5 כדי להחזיק זבוב בין בית החזה לבטן, ועם מלקחיים אחרים, משוך את הבטן מבית החזה. לבודד במהירות את האשכים ואת הרקמות הסמוכות מן פגר זבוב¹⁵ ומניחים טיפה חדשה של חיץ של רינגר על אותה שקופית.
6. לאחר כל האשכים מוכנים, לנקות את האשכים מן הרקמות הנותרות (בלוטת עזר ואברי מין חיצוניים).
7. הסר מאגר עודף מהשחרור המכיל את האשכים המנותחים. בדרך כלל, השתמש פיפטה p200 עם קצה μL 10 מצויד על גבי קצה 200 μL. זה מאפשר הסרת עודף נוזלי דרך צמצם קטן. מניחים טיפה של 4% תיקון paraformaldehyde על גבי טיפה המכילה את האשכים מנותח, ולאחר מכן להעביר במהירות את האשכים לצינור המכיל פתרון קיבוע טרי.

2. קיבעון פרפורמלדהיד

1. הכן 2 מ"ל של פתרון קיבוע ממש לפני השימוש: 600 μL של 4% paraformaldehyde מדולל מלוחים אגירה פוספט (PBS) עם 30 μL של NP40 20% בתוספת 1200 μL של heptane בצינור מיקרוצנטריפוגה סיליקון 2 mL. השתמש 4% paraformaldehyde ב PBS מוכן 600 μL aliquots ומאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
   זהירות: הפטן ופרפורמלדהיד רעילים ויש לטפל בהם במכסה המנוע. יש להשליך אותם בהתאם לתקנות המכון המארח.
2. העבר את האשכים באמצעות מיקרופיפט p200 עם קצה צמצם רחב לפתרון PFA / NP40 / heptane. לנער את הצינור למעלה ולמטה במשך 30 s ביד. ממשיכים לתקן את האשכים על מערבל סיבובי בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
3. עצרו את המיקסר הסיבובי והניחו את הצינור בארון תקשורת צינורי כדי לאפשר הפרדת פאזה ואת האשכים להתיישב לתחתית הצינור.
4. הסר את כל heptane ואת הפתרון התיקון ולשטוף את האשכים במהירות שלוש פעמים עם 1x PBS.
5. העבר לצינור בודד נקי של 200 μL. בצע את כל הדגירות בצינורות קטנים אלה כדי למזער את כמויות הנוגדנים המועסקים.
6. הסר מאגר עודף באמצעות מיקרופיפט 200 μL עם P200 וגם קצה P10 מצורף. היזהר לא לשאוף אשכים.
7. יש לשמור את האשכים ב-1x PBS על הקרח עד שכל הדגימות יהיו מוכנות.

3. כתמי נוגדנים בתמיסה

1. להשליך את PBS ולהשאיר אשכים ב 0.3% PBS-T במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לחלחל קרום התא.
2. טרום דגירה באותו חיץ בתוספת 5% סרום עיזים רגיל (NGS) במשך 1 שעות.
3. הוסף 200 μL של הנוגדן העיקרי מדולל ב 0.3% PBS-T בתוספת 5% NGS(שולחן החומרים).
4. דגירה הנוגדן העיקרי לילה ב 4 °C (או טמפרטורת החדר) עם תסיסה עדינה על נדנדה.
5. לשטוף 3 פעמים ב 0.3% PBS-T במשך 15 דקות על נדנדה בטמפרטורת החדר. אפשר האשכים להתיישב לתחתית הצינור על ידי כוח הכבידה.
6. הוסף 200 μL של נוגדן משני מדולל 1:500 מהסדרה מצומד DyLight.
7. דגירה הנוגדן המשני בתא כהה במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר.
8. לשטוף 0.3% PBS-T במשך 15 דקות על נדנדה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן חזרו על הפעולה עם 0.2% PBS-T ו-0.1% PBS-T, בכל פעם למשך 30 דקות על נדנדה בטמפרטורת החדר. בצע שטיפה סופית ב 1x PBS במשך 30 דקות כדי להסיר את חומר הניקוי.
9. הוסף 180 μL של פתרון DAPI ב 1 מיקרוגרם / מ"ל ב 1x PBS במשך 15 דקות. פתרון המניה הוא 10 מ"ג / מ"ל ב H₂O. הימנעו מפתרון מלאי ב- PBS, אשר יכול להפחית את אות הכתמת DAPI על כרומטין מפוזר בזרע גדול יותר.
10. לשטוף 3x במשך 5 דקות כל אחד.
11. השתמש בעט מחסום הידרופובי כדי לצייר עיגול על שקופית נקייה.
12. שאפתן אשכים ולשים אותם על השקופית. שטיפת קצה הצמצם הרחב ב-0.1% PBS-T מונעת מה האשכים להידבק לקצה. הסר PBS עודף.
13. הוסף טיפה (כ 100 μL) של Citifluor AF1.
14. מניחים בעדינות כיסוי זכוכית על הרקמה, מקפידים להימנע מלכידה של בועות אוויר.
15. לאטום את הכיסוי לשקופית באמצעות לק ברור.
16. שים לב לשקופיות במיקרוסקופ.

4. ניתוחי קולוקליזציה

1. השג תמונות קונפוקל. השתמשנו במיקרוסקופ קונפוקל Zeiss LSM 710 (63x Plan שמן אפוכרומטי) ברזולוציית z של 0.5 או 1 מיקרומטר.
2. בחר תאים שונים מתוך אשכים עצמאיים.
3. יבא תמונות לתוכנת עיבוד (למשל, Imaris).
4. הגדר את הגרעין לפי פילוח ידני כדי לא לכלול את הגרעינים השכנים. השתמש בתוכנת קולוק; הוא אוסף את מקדמי המתאם (PCCs) של פירסון בתוך כל אמצעי האחסון בין 2 פלואורופורים.

תוצאות

המכשול העיקרי להשגת כתמים נאותים של אשכי Drosophila הוא חדירה מוגבלת של נוגדנים, אשר נפתרה חלקית באמצעות הכנות מעוכות אבל במחיר של גרימת הגבלה של ניתוחים 3D (למשל ייצוג 3D או מידה של colocalization). הנוהל מאפשר תיוג אחיד ומשמר את נפח כל תאי האשכים. כאן מיקדנו את האיור של השיטה על ייצוג 3D של זרע S4-S5, כפי שהם...

Discussion

פרוטוקול זה מספק שיטה לאימונולאבלינג מוצלח של אשכי דרוזופילה בוגרים בכל ההר. כפי שדווח בהליכים אחרים יש להשתמש בזכרים צעירים (אפילו קיצרנו את הגיל לפחות מ -20 שעות לאחר eclosion) כדי למזער את נוכחותם של זרע מתפתח, אשר מסתכן בשיבוש הזרע. הניתוח צריך להיות מהיר ואת דילול הנוגדן חייב להיות מותאם כד?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila srains
ketelGFP y; ketelGFP/y+CyO			Gift from A. Debec (Institut Jacques Monod, UMR 7592, Paris, France)
Mad1-GFP			J Cell Sci. 2011 May 15;124(Pt 10):1664-71.
Mtor RNAi	VDRC	ID 110218	Vienna Drosophila RNAi Center
Materials
DAPI	Thermo	D1306	Stock solution must be prepared in H2O
Dumont # 5 Fine Forseps	Fine Science Tools
MBP Wide Bore Pipette Tips	Fisherbrand	11917744	Wide aperture tip
Thermo Scientific 0.2 mL Individual Tube	Thermo	AB-0620
2 ml micro centrifuge tubes	Sigma	T3531-200EA	Siliconized 2ml tube
Citifluor AF1	Citifluor	AF1
Dakopen	Sigma	Z377821-1EA
Normal Goat Serum (NGS)	Sigma	NS02L-1ML
Paraformaldehyde 4%	Sigma	P6148-500G	Paraformaldehyde (4%) dissolved in PBS 1X ; aliquot by 600 ml
PBS 1X	Thermo	14190094	DPBS, no calcium, no magnesium
0.1% (0.2 or 0.3%) PBS-T			PBS 1X  containing 0.1% (0.2 % or 0.3%) Triton X-100
Triton X-100, for molecular biology,	Sigma	T8787
Antibodies
GFP booster	Chromotek	gba488	1/200
Mouse anti-Mtor			1/40 gift from J. Johansen, Iowa State University
Rat anti-Nup62			1/200 gift from H. Ohkura (University of Edinburgh, UK
Guinea-pig anti-Ulp1			1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam
Rabbit anti-Raf2			1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam
DyLight conjugated series	Thermo		1/500 Donkey anti-(guinea-pig, mouse,  rabbit or rat) as second antibodies