Immunostaining dei test di Drosophila a montaggio intero per l'analisi confocale 3D di grandi spermatociti

Riepilogo

Presentiamo qui un protocollo migliorato per la preparazione a montaggio intero e l'immunostaining dei tester Drosophila, adatto per la microscopia confocale e che consente anche un'etichettatura riproducibile e affidabile. Illustriamo questo protocollo attraverso la rappresentazione 3D e la quantificazione degli esperimenti di colocalizzazione sui grandi spermatociti S4-S5.

Abstract

I test di Drosophila sono un potente sistema modello per lo studio dei processi biologici tra cui la biologia delle cellule staminali, l'architettura nucleare, la meiosi e lo sviluppo dello sperma. Tuttavia, l'immunoetichettatura dell'intero testicolo drosophila è spesso associata a una significativa non uniformità di colorazione dovuta alla penetrazione degli anticorpi. I preparati schiacciati superano solo parzialmente il problema poiché diminuisce la qualità 3D delle analisi. Qui, descriviamo un protocollo a montaggio intero usando NP40 ed eptano durante la fissazione insieme all'immunoetichettatura nei mezzi liquidi. Preserva il volume adatto alla microscopia confocale insieme a etichette riproducibili e affidabili. Mostriamo diversi esempi di ricostituzione 3D dei nuclei di spermatociti da sezioni confocali. La riproducibilità intra- e inter-testes consente la quantificazione 3D e il confronto della fluorescenza tra singole cellule di diversi genotipi. Abbiamo utilizzato diversi componenti della struttura MINT intranucleare (Mad1-containing Intra Nuclear Territory) e due componenti associati al complesso dei pori nucleari per illustrare questo protocollo e le sue applicazioni sulle più grandi cellule del testicolo, gli spermatociti S4-S5.

Introduzione

I test di Drosophila sono un modello prezioso per lo studio dell'architettura nucleare. Nelle cellule spermatogoniche mitotiche, il volume nucleare è in gran parte occupato dalla cromatina. Queste cellule subiscono quattro cicli di divisione, producendo una cisti di 16 spermatociti primari. Nei giorni successivi, gli spermatociti passano attraverso 6 stadi di sviluppo (S1-S6), aumentando notevolmente di volume, approssimativamente 20 volte^1,2. Cambiano anche la loro morfologia nucleare. Il contorno del nucleo, rivelato dal lamina Dm0, diventa irregolare e mostra profonde invaginazioni^1,3. Questo è accompagnato da ampi cambiamenti di espressione genica e modifiche nell'organizzazione della cromatina^1,4,5,6,7. I cromosomi interfase sono ben definiti nello stadio S4-S5, formando tre masse distinte corrispondenti ai 2 principali autosomi bivalenti e alla coppia X-Y agganciata al nucleolo.

Mad1 è stato originariamente isolato come componente chiave del checkpoint mitotico (esaminato in⁸). Nell'interfase, è descritto come situato principalmente all'involucro nucleare ma anche nel nucleoplasma^9,10,11. In Drosophila testis, abbiamo riferito che Mad1 è prominente nel nucleoplasma, intimamente associato alle due principali masse di cromatina autosomica e in misura minore alla cromatina XY. Abbiamo definito questa struttura associata alla cromatina come MINT (Mad1-containing IntraNuclear Territory)¹². Altre quattro proteine erano associate ai TT negli spermatociti: la nucleoporina Mtor/Tpr, la peptidasi Ulp1 suMO, la proteina del checkpoint mitotico Mad2 e una subunità di un complesso simile a Policomb Raf2¹².

Per completare la descrizione dei MINT, dovevamo usare gli anticorpi e ci siamo trovati di fronte ai problemi tecnici generalmente incontrati con l'immunostaining nel testicolo: una scarsa permeabilità con conseguente significativa non uniformità di colorazione nella profondità del testicolo, in particolare nei grandi spermatociti. Ipreparati s annullati aumentavano l'accesso agli anticorpi ma portavano a immagini compresse, limitando le analisi 3D e impedendo la misurazione della fluorescenza quantitativa, compresa la colocalizzazione. Il problema della penetrazione degli anticorpi potrebbe anche essere affrontato da agenti permeabilizzanti come lo 0,3% di Na deossicholato¹³, ma questa procedura non ha prodotto nelle nostre mani risultati riproducibili. Poiché abbiamo eseguito molti esperimenti di co-etichettatura, abbiamo cercato di migliorare il protocollo di permeabilizzazione. La combinazione di 1% NP40 più eptano ha portato a una maggiore riproducibilità, in particolare nello studio dei grandi spermatociti.

Questo protocollo esegue la fissazione e l'immunosocienza dei test in sospensione, migliorando la qualità del campione e migliorando la riproducibilità e rendendolo adatto per la microscopia confocale. Abbiamo usato il protocollo per definire meglio le relazioni spaziali di alcune proteine dell'involucro nucleare con le strutture nucleoplasmatiche dei grandi spermatociti. Questo metodo consentirà di esaminare meglio i cambiamenti che accompagnano lo sviluppo degli spermatociti, ad esempio i cambiamenti strutturali dinamici del nucleo, tra cui cromatina, nucleoplasma e pori nucleari.

Protocollo

1. Raccolta testes Drosophila

NOTA: I giovani maschi (0-15 ore dopo l'eclosion) sono necessari per esaminare le cellule germinali diploidi (ad esempio spermatogonia e spermatociti).

1. Seleziona le mosche giovani il più possibile per ridurre al minimo le interferenze derivanti dallo sviluppo di spermatidi.
2. Anestetizza le mosche con una breve esposizione all'anidride carbonica e si trasferisce su un fly pad^14,15.
3. Al microscopio sezionato (ingrandimento 10x), utilizzare le flessione per rimuovere la testa.
4. Trasferire da 5 a 10 mosche decapitate a 100 μL del tampone di Ringer (183 mM KCI, 47 mM NaCl, 10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, inibitore proteico completo, pH 6,8) su uno scivolo di vetro rivestito di silicone su un supporto di sfondo nero.
5. Con il microscopio sezionato con un ingrandimento di 40x, utilizzare un paio di forcep numero 5 per tenere una mosca tra il torace e l'addome e, con altre forcep, allontanare l'addome dal torace. Isolare rapidamente i tester e i tessuti adiacenti dalla carcassa^{di mosca 15} e posizionare in una nuova goccia del buffer di Ringer sullo stesso scivolo.
6. Una volta che tutti i teste sono pronti, pulire i teste dai tessuti rimanenti (ghiandola accessoria e genitali esterni).
7. Rimuovere il buffer in eccesso dalla goccia contenente i teste sezionati. In genere, utilizzare una pipetta p200 con una punta da 10 μL montata sopra una punta da 200 μL. Ciò consente la rimozione dell'eccesso di liquido attraverso una piccola apertura. Posizionare una goccia del 4% di paraformaldeide fissativa sopra la goccia contenente i tester sezionati, quindi trasferire rapidamente i tester su un tubo contenente soluzione fissante fresca.

2. Fissazione della paraformaldeide

1. Preparare 2 ml di soluzione fissativa poco prima dell'uso: 600 μL di paraformaldeide al 4% diluita in salina tamponata di fosfato (PBS) con 30 μL di NP40 20% più 1200 μL di eptano in un tubo di microcentrifugo siliconato da 2 ml. Utilizzare il 4% di paraformaldeide in PBS preparata in aliquote 600 μL e conservata a -20°C.
   Attenzione: Eptano e paraformaldeide sono tossici e devono essere maneggiati in una cappa aspirante. Smaltirli secondo il regolamento dell'istituto ospitante.
2. Trasferire i tester utilizzando una micropipetta p200 con un'ampia punta di apertura alla soluzione PFA/NP40/eptano. Agitare il tubo su e giù per 30 s a mano. Continuare a fissare i tester su un miscelatore rotativo a temperatura ambiente per 30 minuti.
3. Arrestare il miscelatore rotante e posizionare il tubo in un rack per tubi per consentire la separazione di fase e per i tester di depositarsi sul fondo del tubo.
4. Rimuovere tutto l'eptano e la soluzione fissante e risciacquare rapidamente i tester tre volte con 1x PBS.
5. Trasferire in un singolo tubo pulito da 200 μL. Eseguire tutte le incubazioni in questi piccoli tubi per ridurre al minimo le quantità di anticorpi impiegati.
6. Rimuovere il buffer in eccesso utilizzando una micropipetta da 200 μL con una punta P200 e una punta P10 attaccata. Fare attenzione a non aspirare teste.
7. Conservare i test in 1x PBS sul ghiaccio fino a quando tutti i campioni non sono pronti.

3. Colorazione anticorpale in soluzione

1. Scartare il PBS e lasciare i tester nello 0,3% di PBS-T per 30 minuti a temperatura ambiente per permeabilizzare le membrane cellulari.
2. Pre-incubare nello stesso tampone più il 5% di siero di capra normale (NGS) per 1 h.
3. Aggiungere 200 μL dell'anticorpo primario diluito nello 0,3% pbs-t più 5% NGS(Tabella dei materiali).
4. Incubare l'anticorpo primario durante la notte a 4 °C (o temperatura ambiente) con delicata agitazione su un rocker.
5. Lavare 3 volte in 0,3% PBS-T per 15 minuti su un rocker a temperatura ambiente. Lasciare che i tester si sistemino sul fondo del tubo per gravità.
6. Aggiungere 200 μL di anticorpo secondario diluito 1:500 dalla serie coniugata DyLight.
7. Incubare l'anticorpo secondario in una camera scura per 4 ore a temperatura ambiente.
8. Lavare in 0,3% PBS-T per 15 minuti su un rocker a temperatura ambiente. Quindi ripetere con 0,2% PBS-T e 0,1% PBS-T, ogni volta per 30 minuti su un rocker a temperatura ambiente. Fare un lavaggio finale in 1x PBS per 30 minuti per rimuovere il detergente.
9. Aggiungere 180 μL di soluzione DAPI a 1 μg/mL in 1x PBS per 15 min. La soluzione stock è di 10 mg/mL in H₂O. Evitare di fare soluzione stock in PBS, che può ridurre il segnale di colorazione DAPI sulla cromatina diffusa negli spermatociti più grandi.
10. Lavare 3 volte per 5 minuti ciascuno.
11. Utilizzare una penna barriera idrofobica per disegnare un cerchio su uno scivolo pulito.
12. Aspirare i teste e metterli sulla diapositiva. Il preri risciacquo della punta di apertura ampia con PBS-T dello 0,1% impedisce ai tester di attaccarsi alla punta. Rimuovere il PBS in eccesso.
13. Aggiungere una goccia (circa 100 μL) di Citifluor AF1.
14. Posizionare delicatamente una coverlip di vetro sul tessuto, facendo attenzione a evitare di intrappolare bolle d'aria.
15. Sigillare il coverslip allo scivolo utilizzando smalto chiaro.
16. Osservare le diapositive al microscopio.

4. Analisi di colocalizzazione

1. Acquisire immagini confocali. Abbiamo usato un microscopio confocale Zeiss LSM 710 (olio apocromatico a piano 63x) con una risoluzione z di 0,5 o 1 μm.
2. Selezionare celle diverse da tester indipendenti.
3. Importare immagini nel software di elaborazione (ad esempio, Imaris).
4. Definire il nucleo mediante segmentazione manuale per escludere i nuclei vicini. Utilizzare il software Coloc; raccoglie i coefficienti di correlazione di Pearson (PCC) all'interno dell'intero volume tra 2 fluorofori.

Risultati

Il principale ostacolo all'ottenimento di un'adeguata colorazione dei test di Drosophila è la limitata penetrabilità degli anticorpi, che è stata parzialmente risolta utilizzando preparati schiacciati ma a costo di indurre una restrizione delle analisi 3D (ad esempio rappresentazione 3D o misura della colocalizzazione). La procedura consente un'etichettatura uniforme e preserva il volume di tutte le cellule del testicolo. Qui abbiamo focalizzato l'illustrazione del metodo sulla rappresentazione 3D degli spermatociti S...

Discussione

Questo protocollo fornisce un metodo per l'immunoetichettatura di tester di Drosophila adulti a montaggio intero. Come riportato in altre procedure devono essere utilizzati giovani maschi (abbiamo anche ridotto l'età a meno di 20 ore dopo l'eclosion) per ridurre al minimo la presenza di spermatozoi in via di sviluppo, che rischia di ostruire gli spermatociti. La dissezione deve essere rapida e la diluizione degli anticorpi deve essere regolata per ottimizzare il rapporto segnale-rumore^21,

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila srains
ketelGFP y; ketelGFP/y+CyO			Gift from A. Debec (Institut Jacques Monod, UMR 7592, Paris, France)
Mad1-GFP			J Cell Sci. 2011 May 15;124(Pt 10):1664-71.
Mtor RNAi	VDRC	ID 110218	Vienna Drosophila RNAi Center
Materials
DAPI	Thermo	D1306	Stock solution must be prepared in H2O
Dumont # 5 Fine Forseps	Fine Science Tools
MBP Wide Bore Pipette Tips	Fisherbrand	11917744	Wide aperture tip
Thermo Scientific 0.2 mL Individual Tube	Thermo	AB-0620
2 ml micro centrifuge tubes	Sigma	T3531-200EA	Siliconized 2ml tube
Citifluor AF1	Citifluor	AF1
Dakopen	Sigma	Z377821-1EA
Normal Goat Serum (NGS)	Sigma	NS02L-1ML
Paraformaldehyde 4%	Sigma	P6148-500G	Paraformaldehyde (4%) dissolved in PBS 1X ; aliquot by 600 ml
PBS 1X	Thermo	14190094	DPBS, no calcium, no magnesium
0.1% (0.2 or 0.3%) PBS-T			PBS 1X  containing 0.1% (0.2 % or 0.3%) Triton X-100
Triton X-100, for molecular biology,	Sigma	T8787
Antibodies
GFP booster	Chromotek	gba488	1/200
Mouse anti-Mtor			1/40 gift from J. Johansen, Iowa State University
Rat anti-Nup62			1/200 gift from H. Ohkura (University of Edinburgh, UK
Guinea-pig anti-Ulp1			1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam
Rabbit anti-Raf2			1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam
DyLight conjugated series	Thermo		1/500 Donkey anti-(guinea-pig, mouse,  rabbit or rat) as second antibodies