Иммуноокрашивание яичек дрозофилы цельной горы для 3D конфокального анализа крупных сперматоцитов

Резюме

Здесь мы представляем улучшенный протокол для получения и иммуноокрашивания яичек Drosophila, подходящий для конфокальной микроскопии, а также позволяющий воспроизводимую и надежную маркировку. Мы иллюстрируем этот протокол 3D-представлением и количественной оценкой экспериментов по колокализации на больших сперматозоидах S4-S5.

Аннотация

Яички Drosophila являются мощной модельной системой для изучения биологических процессов, включая биологию стволовых клеток, ядерную архитектуру, мейоз и развитие сперматозоидов. Однако иммуномаркировка всего яичка дрозофилы часто связана со значительной неравномерностью окрашивания из-за проникновения антител. Раздавленные препараты лишь частично преодолевают проблему, так как это снижает качество 3D анализов. Здесь мы описываем протокол цельного крепления с использованием NP40 и гептана во время фиксации вместе с иммуномаркировкой в жидких средах. Он сохраняет объем, пригодный для конфокальной микроскопии, вместе с воспроизводимой и надежной маркировкой. Показаны различные примеры 3D-восстановления ядер сперматоцитов из конфокальных срезов. Воспроизводимость внутри- и межясыков позволяет проводить 3D-количественную оценку и сравнение флуоресценции между отдельными клетками разных генотипов. Мы использовали различные компоненты внутриядерной структуры MINT (Mad1-содержащую Intra Nuclear Territory), а также два компонента, связанных с комплексом ядерных пор, чтобы проиллюстрировать этот протокол и его приложения на крупнейших клетках яичка, сперматоцитах S4-S5.

Введение

Яички дрозофилы являются ценной моделью для изучения ядерной архитектуры. В митотических сперматозоидах ядерный объем в значительной степени занят хроматином. Эти клетки проходят четыре раунда деления, производя кисту из 16 первичных сперматоцитов. В течение следующих нескольких дней сперматоциты проходят через 6 стадий развития (S1-S6), значительно увеличиваясь в объеме, примерно в 20 раз^{в 1,2}раза. Они также меняют свою ядерную морфологию. Очертания ядра, выявленные ламином Dm0, становятся неровными и показывают глубокие инвагинации^1,3. Это сопровождается обширными изменениями экспрессии генов и модификациями в организации хроматина^1,4,5,6,7. Межфазные хромосомы хорошо определены на стадии S4-S5, образуя три различные массы, соответствующие 2 основным двухвалентным аутосомам и паре X-Y, состыковывающейся с ядрышком.

Mad1 был первоначально изолирован как ключевой компонент митотического контрольно-пропускного пункта (рассмотрен в^8). В интерфазе он описывается как расположенный в основном в ядерной оболочке, но также и в нуклеоплазме^9,10,11. В Drosophila testis мы сообщили, что Mad1 занимает видное место в нуклеоплазме, тесно связанной с двумя основными аутосомными массами хроматина и в меньшей степени с хроматином XY. Мы определили эту хроматин-ассоциированную структуру как MINT (Mad1-содержащая внутриядерная территория)^12. Четыре других белка были связаны с MINT в сперматоцитах: нуклеопорин Mtor/Tpr, пептидаза SUMO Ulp1, белок митотической контрольной точки Mad2 и субъединица поликомбоподобного комплекса Raf2^12.

Чтобы завершить описание MINT, нам нужно было использовать антитела, и мы столкнулись с техническими проблемами, обычно встречающимися с иммуноокрашиванием в яичках: плохая проницаемость, приводящая к значительной неравномерности окрашивания в глубине яичка, особенно в крупных сперматоцитах. Sподавлял препараты, увеличивая доступ антител, но приводил к сжатию изображений, ограничивая 3D-анализы и предотвращая измерение количественной флуоресценции, включая колокализацию. Проблема проникновения антител также может быть решена с помощью пермеабилизирующих агентов, таких как 0,3% Na дезоксихолат^13,но эта процедура в наших руках не дала воспроизводимых результатов. Поскольку мы провели много экспериментов по совместной маркировке, мы хотели улучшить протокол пермеабилизации. Комбинация 1% NP40 плюс гептан привела к большей воспроизводимости, особенно при изучении крупных сперматоцитов.

Этот протокол выполняет фиксацию и иммуноокрашивание яичек во суспензии, улучшая качество образца, а также повышая воспроизводимость и делая его пригодным для конфокальной микроскопии. Мы использовали протокол для лучшего определения пространственных отношений определенных белков ядерной оболочки с нуклеоплазмическими структурами крупных сперматоцитов. Этот метод позволит лучше изучать изменения, которые сопровождают развитие сперматоцитов, например, динамические структурные изменения ядра, включая хроматин, нуклеоплазму и ядерные поры.

протокол

1. Коллекция яичек дрозофилы

ПРИМЕЧАНИЕ: Молодые самцы (0-15 ч после эклозии) необходимы для исследования диплоидных половых клеток (т.е. сперматогонии и сперматоцитов).

1. Выбирайте молодых мух как можно больше, чтобы свести к минимуму помехи от развивающихся сперматид.
2. Обезболивают мух при кратковременном воздействии углекислого газа и переносят на налетную площадку^14,15.
3. Под рассекающим микроскопом (10-кратное увеличение) используйте щипцы для удаления головы.
4. Перенесите от 5 до 10 обезглавленных мух в 100 мкл буфера Рингера (183 мМ KCI, 47 мМ NaCl, 10 мМ Tris-HCI, 1 мМ ЭДТА, полный ингибитор белка, рН 6,8) на стеклянной горке с силиконовым покрытием на черной фоновой подложке.
5. С рассекающим микроскопом при 40-кратном увеличении используйте одну пару щипцов числа 5, чтобы удерживать муху между грудной клеткой и брюшком, а с другими щипцами оттягивайте брюшную полость от грудной клетки. Быстро изолируют яички и прилегающие ткани от туши мухи¹⁵ и помещают в новую каплю буфера Рингера на том же слайде.
6. Как только все яички будут готовы, очистите яички от оставшихся тканей (дополнительной железы и наружных половых органов).
7. Удалите из капли лишний буфер, содержащий рассеченные яички. Как правило, используйте пипетку p200 с наконечником 10 мкл, установленным поверх наконечника 200 мкл. Это позволяет удалить избыток жидкости через небольшое отверстие. Поместите каплю 4% параформальдегида фиксатора поверх капли, содержащей рассеченные яички, а затем быстро перенесите яички в пробирку, содержащую свежий фиксаторный раствор.

2. Фиксация параформальдегида

1. Перед применением готовят 2 мл фиксаторного раствора: 600 мкл 4% параформальдегида, разведенного в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) с 30 мкл NP40 20% плюс 1200 мкл гептана в 2 мл силиконизированной микроцентрифужной трубки. Используйте 4% параформальдегид в PBS, приготовленный в 600 мкл аликвот и хранящийся при -20°C.
   Внимание: Гептан и параформальдегид токсичны и должны обрабатываться в вытяжном капюшоне. Распоряжайтесь ими в соответствии с правилами принимающего института.
2. Перенесите яички с помощью микропипетки p200 с широким наконечником диафрагмы в раствор PFA/NP40/гептан. Встряхните трубку вверх и вниз в течение 30 с вручную. Продолжайте фиксацию яичек на ротационном смесителе при комнатной температуре в течение 30 мин.
3. Остановите вращающийся смеситель и поместите трубку в стойку для труб, чтобы обеспечить разделение фаз и чтобы яички осели на дно трубки.
4. Удалите весь гептан и фиксаторный раствор и быстро промойте яички три раза с 1x PBS.
5. Переложить в чистую индивидуальную трубку 200 мкл. Выполните все инкубации в этих небольших трубках, чтобы свести к минимуму количество используемых антител.
6. Удалите лишний буфер с помощью микропипетки 200 мкл с прикрепленными наконечниками P200 и P10. Позаботьтесь о том, чтобы не аспирировать яички.
7. Держите яички в 1x PBS на льду, пока все образцы не будут готовы.

3. Окрашивание антител в растворе

1. Откажитесь от PBS и оставьте яички в 0,3% PBS-T в течение 30 мин при комнатной температуре для пермеабилизации клеточных мембран.
2. Предварительно инкубировать в том же буфере плюс 5% нормальную козью сыворотку (NGS) в течение 1 ч.
3. Добавьте 200 мкл первичного антитела, разведенного в 0,3% PBS-T плюс 5% NGS(Таблица материалов).
4. Инкубировать первичное антитело в течение ночи при 4 °C (или комнатной температуре) с легким перемешиванием на коромысле.
5. Промыть 3 раза по 0,3% PBS-T в течение 15 мин на коромысле комнатной температуры. Дайте яичкам осязить на дно трубки под действием силы тяжести.
6. Добавьте 200 мкл вторичного антитела, разбавленного 1:500 из конъюгированного ряда DyLight.
7. Инкубируют вторичное антитело в темной камере в течение 4 ч при комнатной температуре.
8. Промывайте в 0,3% PBS-T в течение 15 мин на коромысле комнатной температуры. Затем повторяют с 0,2% PBS-T и 0,1% PBS-T, каждый раз в течение 30 мин на коромысле при комнатной температуре. Сделайте окончательную стирку в 1x PBS в течение 30 минут, чтобы удалить моющее средство.
9. Добавьте 180 мкл раствора DAPI при 1 мкг/мл в 1x PBS в течение 15 мин. Стандартный раствор составляет 10 мг/мл в_H2O. Избегайте приготовления стока раствора в PBS, который может уменьшить сигнал окрашивания DAPI на диффузном хроматине в более крупных сперматоцитах.
10. Стирайте по 3 раза по 5 минут.
11. Используйте гидрофобную барьерную ручку, чтобы нарисовать круг на чистом слайде.
12. Аспирируйте яички и положите их на слайд. Предварительное промывание широкоугольного наконечника отверстия с 0,1% PBS-T предотвращает прилипание яичек к наконечнику. Удалите излишки PBS.
13. Добавьте каплю (примерно 100 мкл) Citifluor AF1.
14. Осторожно поместите стеклянную крышку поверх ткани, заботясь о том, чтобы избежать захвата пузырьков воздуха.
15. Запечатайте крышку на слайде прозрачным лаком для ногтей.
16. Наблюдайте за слайдами на микроскопе.

4. Анализы колокализации

1. Получайте конфокальные изображения. Мы использовали конфокальный микроскоп Zeiss LSM 710 (63x План Апохроматическое масло) с z-разрешением 0,5 или 1 мкм.
2. Выделите разные клетки из независимых яичек.
3. Импорт изображений в программное обеспечение для обработки (например, Imaris).
4. Определите ядро путем ручной сегментации, чтобы исключить соседние ядра. Использовать программное обеспечение Coloc; он собирает коэффициенты корреляции Пирсона (PCC) внутри всего объема между 2 флуорофорами.

Результаты

Основным препятствием для получения адекватного окрашивания яичек Drosophila является ограниченная проникаемость антител, которая была частично устранена с помощью раздавленных препаратов, но за счет ограничения 3D-анализов (например, 3D-представление или мера колокализации). Процедура по?...

Обсуждение

Этот протокол обеспечивает метод успешной иммуномаркировки цельноукладных яичек взрослых дрозофил. Как сообщалось в других процедурах, необходимо использовать молодых мужчин (мы даже сократили возраст до менее чем 20 часов после эклозии), чтобы свести к минимуму наличие развивающейся...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila srains
ketelGFP y; ketelGFP/y+CyO			Gift from A. Debec (Institut Jacques Monod, UMR 7592, Paris, France)
Mad1-GFP			J Cell Sci. 2011 May 15;124(Pt 10):1664-71.
Mtor RNAi	VDRC	ID 110218	Vienna Drosophila RNAi Center
Materials
DAPI	Thermo	D1306	Stock solution must be prepared in H2O
Dumont # 5 Fine Forseps	Fine Science Tools
MBP Wide Bore Pipette Tips	Fisherbrand	11917744	Wide aperture tip
Thermo Scientific 0.2 mL Individual Tube	Thermo	AB-0620
2 ml micro centrifuge tubes	Sigma	T3531-200EA	Siliconized 2ml tube
Citifluor AF1	Citifluor	AF1
Dakopen	Sigma	Z377821-1EA
Normal Goat Serum (NGS)	Sigma	NS02L-1ML
Paraformaldehyde 4%	Sigma	P6148-500G	Paraformaldehyde (4%) dissolved in PBS 1X ; aliquot by 600 ml
PBS 1X	Thermo	14190094	DPBS, no calcium, no magnesium
0.1% (0.2 or 0.3%) PBS-T			PBS 1X  containing 0.1% (0.2 % or 0.3%) Triton X-100
Triton X-100, for molecular biology,	Sigma	T8787
Antibodies
GFP booster	Chromotek	gba488	1/200
Mouse anti-Mtor			1/40 gift from J. Johansen, Iowa State University
Rat anti-Nup62			1/200 gift from H. Ohkura (University of Edinburgh, UK
Guinea-pig anti-Ulp1			1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam
Rabbit anti-Raf2			1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam
DyLight conjugated series	Thermo		1/500 Donkey anti-(guinea-pig, mouse,  rabbit or rat) as second antibodies