在西图化学分析中，以检验水生生态系统中的微生物行为

摘要

这里介绍的是原位化疗的规程，这是一种最近开发的微流体装置，能够直接研究环境中的微生物行为。

摘要

微生物行为，如运动和化学（细胞改变其运动的能力，以响应化学梯度），在细菌和古生物领域广泛。在异构环境中，Chemotaxis 可产生巨大的资源获取优势。它还在共生相互作用、疾病和全球过程（如生物地球化学循环）中发挥关键作用。然而，目前的技术将化疗研究限制在实验室，并不容易应用于该领域。此处介绍的是部署原位化学测定 （ISCA） 的分步协议，该装置可直接在自然环境中对微生物化疗进行强健的检测。ISCA 是一种微流体装置，由 20 井阵列组成，可装载感兴趣的化学品。一旦部署在水环境中，化学物质会从水井中扩散出来，产生微生物通过化疗游入水井来感知和响应的浓度梯度。然后，可以对井内物质进行采样，并用于（1） 通过流式细胞学量化对特定化合物的化疗反应强度，（2） 分离和培养反应灵敏的微生物，（3） 通过分子技术描述反应群体的身份和基因组潜力。ISCA 是一个灵活的平台，可部署在水相的任何系统中，包括海洋、淡水和土壤环境。

引言

不同的微生物利用动力和化学利用来利用零碎的营养环境，寻找宿主，或避免有害条件^{1,1，2，3。,3}这些微生物行为反过来又会影响化学转化率^4，并促进陆地、淡水和海洋生态系统^{2、5的共生伙伴关系}。

在过去的60年里，切莫塔西在实验室条件下进行了广泛的^研究。研究化疗的第一个定量方法，毛细管测定，涉及一个毛细管充满了悬浮在细菌6的悬浮^液中。从管子中扩散出的化学物质会产生化学梯度，而化学细菌通过迁移到管7来响应这种^梯度。自毛细管测定开发以来，目前仍然广泛使用，在日益受控的物理/化学条件下，还开发了许多其他技术来研究化学化学，最近涉及^{使用微流体8、9、10。,9,10}

微流体与高速视频显微镜一起，能够跟踪单个细胞的行为，以响应精心控制的梯度。虽然这些技术极大地提高了我们对化疗的了解，但它们仅限于实验室使用，不容易转化为环境系统中的实地部署。因此，没有检查细菌自然群落在自然生态系统内使用化学药物的能力;因此，目前对化疗的潜在生态重要性的理解偏向于人工实验室条件和数量有限的实验室培养的细菌分离物。最近开发的 ISCA 克服了这些限制¹¹。

ISCA以毛细管测定的一般原则为上;然而，它利用现代微制造技术，提供一个高度复制的、易于部署的实验平台，用于对自然环境中感兴趣的化合物进行化学化学的定量化。它还允许通过直接隔离或分子技术识别和鉴定化疗微生物。虽然第一个工作装置是玻璃和PDMS^11自行制造和制造的，但最新的注塑成型版本由聚碳酸酯组成，采用高度标准化的制造程序（对于最新版本的装置感兴趣，可以联系相应的作者）。

ISCA 是信用卡大小的，由 20 口井组成，分布在 5 x 4 孔阵列中，每个井通过一个小端口（直径 800 μm）与外部水生环境相连; 图1）。装入井中的放药化疗物通过港口扩散到环境中，化疗微生物通过港口游入井中作出反应。由于许多因素会影响自然环境中的 ISCA 实验结果，因此此分步协议将帮助新用户克服潜在障碍并促进有效部署。

研究方案

我们建议在实地实验之前执行第 1 节以优化结果。

1. 实验室优化

注:优化过程中描述的体积足以满足单个 ISCA（由 20 口井组成）。

1. 感兴趣的化学品的制备
   注:在实地部署之前，通常需要在实验室条件下确定每种化疗物的最佳浓度。化学浓度场将随着与源的距离（ISCA井）而减少，这意味着环境中微生物经历的浓度将低于设备内部的浓度。在 ISCA 井中使用的最佳浓度取决于化疗物的扩散速率。如果井中的浓度过低（接近微生物的检测极限），将不观察到正化学。相反，如果井中的浓度过高，在直接环境中浓度也会很高，微生物积累将发生在 ISCA 油井上方，而不是内部。因此，应在实验室条件下对每种化合物进行稀释序列，以确定现场部署的最佳浓度。理想情况下，还应现场测试浓度范围，以确认实验室结果。
   1. 准备含有适当盐浓度的合适介质2.5升（例如磷酸盐缓冲盐水[PBS]或人工海水）。使用 0.2 μm 过滤器使用近光泵或真空泵和自用管滤器过滤介质。
   2. 在无菌介质的1 mL中准备10 mM的化疗剂溶液。使用 0.2 μm 注射器过滤器过滤化学刺激液，以去除颗粒和潜在污染物。
      注:理想情况下，最终溶液中不应存在除化学抗性物质以外的有机化合物。
2. 通过稀释系列的浓度范围
   1. 系列稀释过滤的化学刺激剂溶液，范围从 10 mM 到 100 μM。
      注:每测试一次浓度至少需要0.7 mL的最终体积。
3. 加载 ISCA
   1. 用过滤的化疗剂填充 1 mL 注射器，然后将其连接到 27 G 注射器。将 ISCA 与端口朝上，缓慢注入物质，直到端口顶部出现一个小液滴。
      注: 1） 每次稀释或物质必须注射单独的注射器和针头，以防止交叉污染。2） 这个小液滴很重要，因为它确保端口内没有气泡，这可能会损害微生物通过端口迁移的能力。3） 建议每物质或浓度（五孔）填充整排，以便为进一步分析提供足够的最小体积。4） 每个 ISCA 的一行应充当负对，并且应填充将悬浮微生物的过滤介质。这种治疗考虑到微生物进入 ISCA 井的随机运动效应，应用于使含有化疗物的治疗正常化。
4. 在实验室部署
   1. 过夜时，孵育含有1%海洋汤（海洋细菌）或1%异质肉汤（LB，淡水细菌）的5 mL培养。
      注:可分离细菌或天然细菌群落可用于实验室部署。
   2. 在室温 （RT） 和 180 rpm 下孵育培养 12 小时。12小时后，通过显微镜直接观察，确保微生物群落的动体。
   3. 以 1，500 x g 旋转培养物 10 分钟，并在 150 mL 的适当介质（例如过滤海水、过滤淡水）中重新暂停 1/100。
   4. 将两小块双面胶带放在 200 mL 容量托盘的平面上（1 mL 尖端盒的盖子具有理想的尺寸，易于自 <3>自式）。将一个 ISCA 放在上面，确保它牢固地连接到磁带上。使用 50 mL 血清移液器，用细菌溶液慢慢填充部署托盘。
      注:填充托盘，直到 ISCA 浸入大约 1~2 厘米的液体下。如果使用多个纸盒，则在所有纸盒中使用相同的卷。
   5. 让 ISCA 孵育 1 小时，以允许细菌化疗。1 小时后，用 50 mL 血清移液器非常轻轻地拆下介质，以最大限度地减少湍流。
   6. 从部署托盘中检索 ISCA，而不接触上表面。使用移液器和一次性雨刷器去除 ISCA 表面上的剩余液体。
      注:在这个过程中，避免接触端口非常重要，因为由此产生的压力变化会将外部环境中的细菌清除或添加到井中，从而影响井内的细菌密度和成分。
5. 检索样本
   1. 将 ISCA 与端口朝下保持，使用连接到 1 mL 注射器的无菌 27 G 注射器针检索孔的体积。
      注:每一行（如果含有相同的物质）可以汇集，以提供约550μL的工作样本。根据所需的下游应用，此示例随后可以等分到不同的管中。
   2. 通过用流式细胞仪¹²分析样品，确定每个化疗物浓度吸引的细菌数量。选择化学跟踪剂的浓度，以最大限度地提高化疗，以便进行后续的实地部署。

2. 外地部署准备

注:在部署之前，必须进行物料准备和流量阻尼外壳的施工（第 2 节）。

1. 材料准备
   1. 准备表 1 中列出的所有材料。
      注:为一个 ISCA 提供物料数量。
2. 流量阻尼外壳的建造和准备
   注:流量阻尼外壳可最大限度地减少不必要的湍流，否则会阻止从 ISCA 产生的化学梯度的建立。
   1. 使用 3 mm 丙烯酸片中激光切割机切割部署外壳的碎片。
      注:可以使用以下链接找到这些片段的文件:
   2. 使用丙烯酸胶水组装激光切割件 ，如图 2 所示。
      注:小心地组装这些碎片。漏洞或错位在部署时可能会造成泄漏，从而直接影响数据质量。
   3. 将组装的外壳晾干过夜。
   4. 用去压水清洗外壳。
   5. 通过将去化水倒入机柜来识别潜在的泄漏。通过添加更多丙烯酸胶水修复任何潜在的泄漏接头，然后重复步骤 2.2.3=2.2.5。
   6. 将螺钉螺纹切入丙烯酸片中，用于固定 ISCA。这可以通过直径的水龙头和与安装螺钉匹配的间距实现。
      1. 首先，将水龙头贴在水龙头扳手上，然后将丙烯酸片固定在台式副件中。为了获得最佳效果，请确保丙烯酸片尽可能平。确保水龙头垂直于丙烯酸片，并开始转动水龙头扳手（顺时针），对水龙头施加轻压。
      2. 在丙烯酸片中旋转数圈后，将水龙头的旋转（逆时针）反转为四分之一的旋转，以清除水龙头中的丙烯酸。重复此过程，直到挖掘丙烯酸片的整个深度。
      3. 最后，拆下水龙头（逆时针转动）并使用螺钉测试螺纹。

3. 现场程序

1. 水过滤
   1. 准备好开始实验时，从现场收集水。通过 0.2 μm 注射器过滤器（带 50 mL 注射器）将每个 ISCA 5 mL 的水过滤到 50 mL 锥形离心管中。
      注:大约需要3 mL的过滤水来填充 ISCA 的所有水井;但是，建议对每台设备进行 1） 过滤 5 mL，以考虑四次过滤过程中的损失，2） 保留滤物的等分物，作为流动细胞学和分子程序的阴性控制。
   2. 使用新的 50 mL 注射器，通过 0.2 μm 亲水 GP 滤芯过滤滤芯两次（同时使用同一个滤芯），放入新的 50 mL 锥形离心管中。通过 0.02 μm 注射器过滤器（使用新的 50 mL 注射器）过滤滤芯，放入新的 50 mL 锥形管中。
      注:这种四重过滤应去除水中几乎所有的微生物和颗粒。在使用之前，请保持最终滤气器远离任何热源。这种水将用于重新暂停 ISCA 中使用的所有化学品，并且应保持与部署地点的水相同的温度。否则，ISCA 井与外部环境之间的温度差异会触发对流。
   3. 使用滤液的等分将所有感兴趣的化学刺激物（通常为干燥）重新用于 15 mL 锥形离心管中所需的浓度。
   4. 通过 0.2 μm 注射器过滤器将重新悬浮的化疗剂与 10 mL 注射器过滤到无菌的 15 mL 锥形离心管中，以去除不需要的颗粒或水溶性化合物（如果使用提取物）。
      注:轻轻过滤以防止颗粒通过过滤器。重要的是从现场重新向超滤水中的化学刺激物中增发，而不是将它们溶解到其他解决方案中。使用现场用水是必要的:（1） 获得与散装环境水中相同的盐浓度，以防止密度驱动的流动，（2） 保证井内和井外的背景营养水平相等。
2. ISCA 灌装
   1. 执行第 1.3 节以填充 ISCA。
      注:建议每物质填充一排（五孔）（即每个 ISCA 三种不同物质和一个超滤海水控制）。
3. 在外地部署
   1. 拧入 ISCA （图 3A）到外壳的第 9 件（图 2K 和图 3B）。
      注:上面概述的流量阻尼外壳可以包含两个并排的 ISCA 或一个放置在其中心的 ISCA。
   2. 关闭外壳（图 3C），用胶带密封（图 3D）。
      注:必须避免皱纹，以确保完美的密封。首先密封所有侧面，然后（在第二步中）密封侧孔，该侧孔将用于在取样结束时从外壳排出水。请勿密封顶部和底部孔。不要将 ISCA 倒置，因为密度驱动的流量可能发生在含有化疗物的井中，这将偏向井中的细胞数量。
   3. 由于机柜在部署过程中必须保持稳定，因此建议使用蹦极绳将其连接到人造结构（如浮桥、梯子）。
      注:在浸泡在水中之前，外壳可以使用蹦极绳连接到部署臂（此处为带垂直平台的改装夹具）。或者，外壳可以在浅基材上用少量重量填充和固定。如果部署在中上层海洋中，则外壳可以连接到网中，一侧有浮标，另一侧有潜水重量。
   4. 完全淹没机柜以开始加注。加注时，牢牢握住外壳，防止内部过度水运动。一旦水位到达外壳的顶部，请确保里面没有空气。
      注:如果一些气泡被捕获，则将通风孔朝上轻轻倾斜外壳，使气泡逸出。
   5. 一旦完全满，用两个插头密封底部和顶部孔，这可以通过硅或橡胶制成，或者通过密封 20 μL 移液器尖端的四肢（图 4）。
      注:此步骤可防止在采样期间在机柜内流动。
   6. 将 ISCA 留到位进行采样 1~3 小时。
      注:理想的部署时间主要取决于水的温度和细菌社区的翻倍时间。当水温高于 20°C 时，不建议在 1.5~2.0 小时后在含有化疗剂的井中部署 ISCA 超过 1 小时。但是，在 ISCA 实验之前，可以通过使用加载的化学品修正自然群落并量化细胞数量来测试最佳部署时间。
   7. 从水中拆下外壳。将水放在容器上，使水从外壳中排出。
   8. 非常轻轻地从前孔中取下胶带的上部。
      注:离开外壳的水流必须以滴水速度。一次继续一个孔，从机柜顶部到底部。将机柜完全排空大约需要 10~15 分钟。
   9. 一旦水线通过到 ISCA 顶部下方，拆下底部塞子，然后排干其余水。
   10. 当 ISCA 仍连接到机柜时，用 1 mL 移液器小心地清除卡在 ISCA 顶部的水。
   11. 在不接触上表面的情况下拆下 ISCA，并使用一次性擦拭去除表面剩余的液体。
       注:在这个过程中，不要接触端口，因为由此产生的压力变化会去除或添加大量细菌进入井中，并偏向细菌计数。
   12. 通过重复步骤 1.5.1 从 ISCA 检索样本。

4. 下游应用

注:根据 550 μL 样本（ISCA 的一行）给出卷。

1. 用谷胱甘肽（2%的最终浓度）修复100μL的井内装物，用于流式细胞仪，以量化每个吸引物的化疗。
   注:储存在冰上（或在4°C），并在同一天分析样品。或者，如果在同一天分析不可行，样品在固定后可以闪冻在液氮中。流细胞学是定量 ISCA 井中细胞数的推荐方法，因为它简单、快速、^{准确 12}。
2. 捕捉冻结300μL的液氮中井的含量，用于后续DNA提取和分析¹¹。
   注:将样品存放在-80°C，直到分析。
3. 将 90 μL 的井内含量添加到 10 μL 的 TE-甘油缓冲液中，并快速冻结单细胞基因组学¹³的样品。
4. 将 10~20 μL 铺在含有细菌分离所需介质的汞板上。

结果

本节介绍实验室结果，利用 ISCA 测试海洋微生物对谷氨酰胺浓度范围的化学反应，谷氨酰胺是一种已知能吸引土壤细菌^的氨基酸。在实验室测试中引起最强化学反应的谷氨酰胺浓度用于在海洋环境中进行化学测定。

为了进行实验室测试，从澳大利亚悉尼沿海水域取样的海水群落通过简单的营养修正^4（如步骤1.4所述）为动体细胞提供了丰富?...

讨论

在水生微生物的规模上，环境远非同质，其特征往往是物理/化学梯度，这些梯度结构微生物群落^1,1，15。动性微生物使用行为的能力（即化疗）有助于在这些异质微环境中觅食^1。直接在环境中研究化学化学具有识别重要特异性相互作用和化学偏好的潜力，这可以帮助解开特定微生物对生物地球化学过程的贡献。提出的协议将 ISCA 部署?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylic glue	Evonik	1133	Acrifix 1S 0116
Acrylic sheet	McMaster-Carr	8505K725	Or different company
Adhesive tape	Scotch	3M 810	Scotch Magic tape
Autoclave	Systec	D-200	Or different company
Benchtop centrifuge	Fisher Scientific	75002451	Or different company
Bungee cord	Paracord Planet	667569184000	Or different company
Centrifuge tube - 2 mL	Sigma Aldrich	BR780546-500EA	Eppendorf tube
Conical centrifuge tube - 15 mL	Fisher Scientific	11507411	Falcon tube
Conical centrifuge tube - 50 mL	Fisher Scientific	10788561	Falcon tube
Deployment arm	Irwin	1964719	Or different company
Deployment enclosure plug	Fisher Scientific	21-236-4	See alternatives in manuscript
Disposable wipers	Kimtech - Fisher Scientific	06-666	Kimwipes
Flow cytometer	Beckman	C09756	CYTOFlex
Glutaraldehyde 25%	Sigma Aldrich	G5882	Or different company
Green fluorescent dye	Sigma Aldrich	S9430	SYBR Green I - 1:10,000 final dilution
Hydrophilic GP filter cartridge - 0.2 µm	Merck	C3235	Sterivex filter
In Situ Chemotaxis Assay (ISCA)	-	-	Contact corresponding authors
Laser cutter	Epilog Laser	Fusion pro 32	Or different company
Luria Bertani Broth	Sigma Aldrich	L3022	Or different company
Marine Broth 2216	VWR	90004-006	Difco
Nylon slotted flat head screws	McMaster-Carr	92929A243	M 2 × 4 × 8 mm
Pipette set	Fisher Scientific	05-403-151	Or different company
Pipette tips - 1 mL	Fisher Scientific	21-236-2A	Or different company
Pipette tips - 20 µL	Fisher Scientific	21-236-4	Or different company
Pipette tips - 200 µL	Fisher Scientific	21-236-1	Or different company
Sea salt	Sigma Aldrich	S9883	For artificial seawater
Serological pipette - 50 mL	Sigma Aldrich	SIAL1490-100EA	Or different company
Syringe filter - 0.02 µm	Whatman	WHA68091002	Anatop filter
Syringe filter - 0.2 µm	Fisher Scientific	10695211	Or different company
Syringe needle 27G	Henke Sass Wolf	4710004020	0.4 × 12 mm
Syringes - 1 mL	Codau	329650	Insulin Luer U-100
Syringes - 10 mL	BD	303134	Or different company
Syringes - 50 mL	BD	15899152	Or different company
Tube rack - 15 mL	Thomas Scientific	1159V80	Or different company
Tube rack - 50 mL	Thomas Scientific	1159V80	Or different company
Uncoated High-Speed Steel General Purpose Tap	McMaster-Carr	8305A77	Or different company
Vacuum filter - 0.2 µm	Merck	SCGPS05RE	Steritop filter