In Situ Chemotaxis Assay para examinar o comportamento microbiano em ecossistemas aquáticos

Resumo

Apresentado aqui está o protocolo para um ensaio in situ chemotaxis, um dispositivo microfluido recentemente desenvolvido que permite estudos de comportamento microbiano diretamente no ambiente.

Resumo

Comportamentos microbianos, como motilidade e quimiotaxis (a capacidade de uma célula alterar seu movimento em resposta a um gradiente químico), são difundidos através dos domínios bacteriano e arqueológico. A quimiotaxis pode resultar em vantagens substanciais de aquisição de recursos em ambientes heterogêneos. Também desempenha um papel crucial nas interações simbióticas, doenças e processos globais, como o ciclismo biogeoquímico. No entanto, as técnicas atuais restringem a pesquisa de quimitaxis ao laboratório e não são facilmente aplicáveis no campo. Apresentado aqui é um protocolo passo-a-passo para a implantação do ensaio in situ chemotaxis (ISCA), um dispositivo que permite um interrogatório robusto de quimitaxis microbianas diretamente no ambiente natural. O ISCA é um dispositivo microfluido que consiste em uma matriz de 20 poços, na qual produtos químicos de interesse podem ser carregados. Uma vez implantados em ambientes aquosos, os produtos químicos difundem-se dos poços, criando gradientes de concentração que os micróbios sentem e respondem nadando nos poços via quimiotaxis. Os conteúdos do poço podem então ser amostrados e utilizados para (1) quantificar a força das respostas quimotacticas a compostos específicos através da citometria de fluxo, (2) microrganismos responsivos isolados e culturais, e (3) caracterizar a identidade e o potencial genômico das populações que respondem através de técnicas moleculares. O ISCA é uma plataforma flexível que pode ser implantada em qualquer sistema com uma fase aquosa, incluindo ambientes marinhos, de água doce e solo.

Introdução

Diversos microrganismos usam motilidade e quimiotaxis para explorar ambientes de nutrientes irregulares, encontrar hospedeiros ou evitar condições deletérios^1,,2,3. Esses comportamentos microbianos podem, por sua vez, influenciar as taxas de transformação química⁴ e promover parcerias simbióticas entre os ecossistemas terrestres, de água doce e marinha^2,,5.

A quimiotaxis tem sido extensivamente estudada em condições laboratoriais nos últimos 60 anos^. O primeiro método quantitativo para estudar quimiotaxis, o ensaio capilar, envolve um tubo capilar preenchido com um quimioattractant putativo imerso em uma suspensão de bactérias⁶. A difusão do produto químico fora do tubo cria um gradiente químico, e as bactérias quimotacticas respondem a este gradiente migrando para o tubo⁷. Desde o desenvolvimento do ensaio capilar, ainda amplamente utilizado hoje, muitas outras técnicas têm sido desenvolvidas para estudar quimotáxis em condições físicas/químicas cada vez mais controladas, com a mais recente envolvendo o uso de microfluidos^8,,9,,10.

Microfluidos, juntamente com microscopia de vídeo de alta velocidade, permite o rastreamento do comportamento de células únicas em resposta a gradientes cuidadosamente controlados. Embora essas técnicas tenham melhorado muito nossa compreensão das quimotáxis, elas foram restritas ao uso laboratorial e não se traduzem facilmente na implantação de campo em sistemas ambientais. Como consequência, a capacidade das comunidades naturais de bactérias de usar quimitaxis dentro dos ecossistemas naturais não foi examinada; assim, a compreensão atual da potencial importância ecológica da quimiotaxis é tendenciosa em relação às condições artificiais de laboratório e a um número limitado de isolados bacterianos cultivados em laboratório. O ISCA recém-desenvolvido supera essas limitações¹¹.

A ISCA baseia-se no princípio geral do ensaio capilar; no entanto, faz uso de técnicas modernas de microfabricação para fornecer uma plataforma experimental altamente replicada e facilmente implantável para a quantificação de quimitaxis em direção a compostos de interesse no ambiente natural. Também permite a identificação e caracterização de microrganismos quimotacticos por meio de isolamento direto ou técnicas moleculares. Enquanto o primeiro dispositivo de trabalho foi auto-fabricado e construído de vidro e PDMS¹¹, a versão mais recente moldada por injeção é composta de policarbonato, usando um procedimento de fabricação altamente padronizado (para interesse na versão mais recente do dispositivo, os autores correspondentes podem ser contatados).

O ISCA é do tamanho de um cartão de crédito e consiste em 20 poços distribuídos em uma matriz de poços 5 x 4, cada um ligado ao ambiente aquático externo por uma pequena porta (800 μm de diâmetro; Figura 1). Quimioattractants putativos carregados nos poços difusam para o meio ambiente através do porto, e micróbios quimotacticos respondem nadando pelo porto até o poço. Como muitos fatores podem influenciar o resultado de um experimento isca no ambiente natural, este protocolo passo a passo ajudará novos usuários a superar potenciais obstáculos e facilitar implantações eficazes.

Protocolo

Recomendamos executar a seção 1 antes de experimentos de campo para otimizar resultados.

1. Otimização laboratorial

NOTA: Os volumes descritos no procedimento de otimização são suficientes para um único ISCA (composto por 20 poços).

1. Preparação do produto químico de interesse
   NOTA: A concentração ideal para cada quimioattractant muitas vezes precisa ser determinada em condições laboratoriais antes das implantações de campo. O campo de concentração química diminuirá em magnitude com distância da fonte (poço ISCA), o que significa que a concentração experimentada por microrganismos no ambiente será menor do que a presente dentro do dispositivo. A concentração ideal para usar no poço ISCA depende da taxa de difusão do quimioattractant. Se a concentração no poço for muito baixa (perto do limite de detecção dos micróbios), não será observada quimiotaxis positivas. Por outro lado, se a concentração no poço for muito alta, a concentração também será alta no ambiente imediato e o acúmulo microbiano ocorrerá acima dos poços isca e não dentro. Portanto, a série de diluição deve ser realizada em condições laboratoriais para cada composto, a fim de determinar a concentração ideal para implantações de campo. O ideal é que uma faixa de concentração também seja testada no campo para confirmar os resultados laboratoriais.
   1. Prepare 2,5 L de um meio adequado contendo a concentração de sal apropriada (por exemplo, soro fisiológico tamponado por fosfato [PBS] ou água do mar artificial). Filtre o meio com um filtro de 0,2 μm usando uma bomba peristáltica ou de vácuo e autoclave.
   2. Prepare uma solução de 10 mM de quimioattractant em 1 mL do meio estéril. Filtre a solução de quimioterapia com um filtro de seringa de 0,2 μm para remover partículas e potenciais contaminantes.
      NOTA: Idealmente, nenhum composto orgânico além do quimioattractant deve estar presente na solução final.
2. Faixa de concentração por série de diluição
   1. Diluir a solução de estoque quimiofada filtrada em série, variando (por exemplo) de 10 mM a 100 μM.
      NOTA: É necessário pelo menos um volume final de 0,7 mL por concentração testada.
3. Carregando o ISCA
   1. Encha uma seringa de 1 mL com o quimioattractant filtrado e conecte-a a uma seringa de 27 G. Segurando o ISCA com a porta voltada para cima, injete lentamente a substância até que uma pequena gota apareça no topo da porta.
      NOTA: 1) Cada diluição ou substância deve ser injetada com uma seringa e uma agulha separadas para evitar a contaminação cruzada. 2) Esta pequena gotícula é importante porque garante que nenhuma bolha de ar esteja presa dentro da porta, o que poderia prejudicar a capacidade dos micróbios de migrar pela porta. 3) Recomenda-se preencher uma linha inteira por substância ou concentração (cinco poços) para fornecer um volume mínimo adequado para análises posteriores. 4) Uma linha por ISCA deve atuar como controle negativo e deve ser preenchida com o meio filtrado no qual os micróbios serão suspensos. Este tratamento explica o efeito da motilidade aleatória por micróbios nos poços isca e deve ser usado para normalizar os tratamentos que contenham um quimioattractant.
4. Implantação em laboratório
   1. Durante a noite, incubar uma cultura de 5 mL enriquecida com caldo marinho de 1% (para bactérias marinhas) ou 1% de caldo de lysogenia (LB, para bactérias de água doce).
      NOTA: Isolados bacterianos motile ou comunidades bacterianas naturais podem ser usados para implantações laboratoriais.
   2. Incubar a cultura por 12h em temperatura ambiente (RT) e 180 rpm. Após 12 h, certifique-se de que as comunidades microbianas são motile por observação direta sob um microscópio.
   3. Gire a cultura a 1.500 x g por 10 min e resuspend 1/100 em 150 mL de meio apropriado (por exemplo, água do mar filtrada, água doce filtrada).
   4. Coloque dois pequenos pedaços de fita adesiva de dupla face na superfície plana de uma bandeja de capacidade de 200 mL (as tampas de caixas de ponta de 1 mL têm as dimensões ideais para este fim e podem ser facilmente autoclavadas). Coloque um ISCA em cima, garantindo que ele se conecte com segurança à fita. Encha lentamente a bandeja de implantação com a solução bacteriana usando uma pipeta sorológica de 50 mL.
      NOTA: Encha a bandeja até que a ISCA esteja submersa sob aproximadamente 1-2 cm de líquido. Se estiver usando várias bandejas, use o mesmo volume em todos.
   5. Deixe o ISCA para incubar por 1h para permitir quimotaxis bacterianos. Depois de 1h, remova o meio suavemente com uma pipeta sorológica de 50 mL para minimizar o fluxo turbulento.
   6. Recupere o ISCA da bandeja de implantação sem tocar na superfície superior. Use uma pipeta e limpadores descartáveis para remover o líquido restante na superfície ISCA.
      NOTA: É importante evitar tocar nas portas durante esse processo, pois as mudanças resultantes da pressão podem remover ou adicionar bactérias do ambiente externo ao poço e, assim, influenciar a densidade bacteriana e a composição dentro do poço.
5. Recuperação das amostras
   1. Segurando o ISCA com a porta voltada para baixo, recupere o volume dos poços usando uma agulha de seringa estéril de 27 G presa a uma seringa de 1 mL.
      NOTA: Cada linha (se conter a mesma substância) pode ser agrupada para fornecer uma amostra de trabalho de aproximadamente 550 μL. Esta amostra pode ser posteriormente aliquo em diferentes tubos, dependendo das aplicações a jusante necessárias.
   2. Determine o número de bactérias atraídas para cada concentração de quimioattractant analisando as amostras com citometria de fluxo¹². Escolha a concentração de quimioattractant que maximiza a quimiotaxis para implantações de campo subsequentes.

2. Preparação para implantação de campo

NOTA: A preparação do material e a construção do compartimento de amortecimento de fluxo (seção 2) devem ser realizadas antes da implantação.

1. Preparação de materiais
   1. Prepare todos os materiais listados na Tabela 1.
      NOTA: As quantidades materiais são fornecidas para um ISCA.
2. Construção e preparação do gabinete de amortecimento de fluxo
   NOTA: O compartimento de amortecimento de fluxo minimiza turbulências indesejadas que, de outra forma, impedem o estabelecimento de gradientes químicos emanando do ISCA.
   1. Corte as peças para o gabinete de implantação com um cortador a laser de uma folha de acrílico de 3 mm.
      NOTA: O arquivo das peças pode ser encontrado usando o seguinte link: .
   2. Monte as peças cortadas a laser como demonstrado na Figura 2 usando cola acrílica.
      NOTA: Monte as peças com cuidado. Buracos ou desalinhamento podem criar vazamentos após a implantação, o que impacta diretamente na qualidade dos dados.
   3. Deixe o gabinete montado para secar durante a noite.
   4. Lave o gabinete com água deionizada.
   5. Identifique um possível vazamento despejando água desionizada no recinto. Corrija as juntas de vazamento potenciais adicionando mais cola acrílica e, em seguida, repita as etapas 2.2.3-2.2.5.
   6. Corte os fios do parafuso na peça acrílica que será usada para fixar o ISCA. Isso pode ser conseguido usando uma torneira com um diâmetro e um tom que corresponda aos parafusos de montagem.
      1. Primeiro, afixe a torneira em uma chave de toque, em seguida, fixar a peça acrílica para ser tocado em um vício de bancada. Para obter os melhores resultados, certifique-se de que a peça acrílica esteja o mais nivelada possível. Certifique-se de que a torneira é perpendicular à peça acrílica e comece a girar a chave de toque (no sentido horário), aplicando pressão leve na torneira.
      2. Depois de várias revoluções completas na peça acrílica, inverta a rotação da torneira (no sentido anti-horário) para um quarto de rotação para limpar o acrílico da torneira. Repita o processo até que toda a profundidade da peça acrílica seja aproveitada.
      3. Por fim, remova a torneira (girando no sentido anti-horário) e teste os fios usando um parafuso.

3. Procedimento no campo

1. Filtragem de água
   1. Colete água do local do campo quando estiver pronto para iniciar o experimento. Filtre 5 mL de água por ISCA através de um filtro de seringa de 0,2 μm (com uma seringa de 50 mL) em um tubo de centrífuga cônica de 50 mL.
      NOTA: Aproximadamente 3 mL de água filtrada são necessários para encher todos os poços de uma ISCA; no entanto, recomenda-se a 1) filtrar 5 mL por dispositivo para contabilizar perdas durante o processo de filtragem quádrupla, e 2) preservar alíquotas dos filtros como controles negativos tanto para citometria de fluxo quanto para procedimentos moleculares.
   2. Filtre o filtrado duas vezes através de um cartucho de filtro GP hidrofílico de 0,2 μm (usando o mesmo, ambas as vezes) com uma nova seringa de 50 mL em um novo tubo de centrífuga cônica de 50 mL. Filtre o filtrado através de um filtro de seringa de 0,02 μm (com uma nova seringa de 50 mL) em um novo tubo cônico de 50 mL.
      NOTA: Esta filtragem quádrupla deve remover quase todos os microrganismos e partículas da água. Mantenha o filtrado final longe de qualquer fonte de calor até usar. Esta água será usada para resususpensar todos os produtos químicos utilizados no ISCA, e deve ser mantida na mesma temperatura que a água no local de implantação. Fluxos convectivos desencadeados por diferenças de temperatura entre os poços isca e o ambiente externo podem ocorrer de outra forma.
   3. Use alíquotas do filtrado para resuspensar todos os quimioattractants de interesse (tipicamente secos) às concentrações desejadas em tubos de centrífuga cônica de 15 mL.
   4. Filtre os quimioattractants resuspended através de um filtro de seringa de 0,2 μm com uma seringa de 10 mL em tubos de centrífuga concítrida estéreis de 15 mL para remover partículas indesejadas ou compostos insolúveis em água (se usar extratos).
      NOTA: Filtrar suavemente para evitar que as partículas passem pelo filtro. É importante resuspensar os quimioattractants na água ultrafiltrada do local do campo e não solubilizá-los em outras soluções. O uso da água do local do campo é necessário para (1) obter a mesma concentração de sal dentro dos poços que na água ambiental a granel para evitar o fluxo orientado pela densidade, e (2) garantir que os níveis de nutrientes de fundo sejam iguais dentro e fora do poço.
2. Enchimento isca
   1. Realize a seção 1.3 para preencher o ISCA.
      NOTA: Recomenda-se preencher uma linha (cinco poços) por substância (ou seja, três substâncias diferentes por ISCA e um controle ultrafilterado da água do mar).
3. Implantação no campo
   1. Enrosque o ISCA (Figura 3A) para a peça 9 do gabinete(Figura 2K e Figura 3B).
      NOTA: O gabinete de amortecimento de fluxo descrito acima pode conter dois ISCAs lado a lado ou um ISCA colocado no centro.
   2. Feche o gabinete(Figura 3C) e sele-o com fita adesiva(Figura 3D).
      NOTA: As rugas devem ser evitadas para garantir um selo perfeito. Sele todos os lados primeiro, depois (em um segundo passo) sele os orifícios laterais, que serão usados para drenar a água do gabinete no final da amostragem. Não feche os orifícios superior e inferior. Não coloque o ISCA de cabeça para baixo, pois o fluxo orientado pela densidade pode ocorrer em poços que contenham quimioattractants, o que influenciará o número de células nos poços.
   3. Como o gabinete deve permanecer estável durante a implantação, recomenda-se anexá-lo às estruturas artificiais (por exemplo, pontão, escada) usando cabos de bungee.
      NOTA: O gabinete pode ser anexado a um braço de implantação (aqui, um grampo modificado com uma plataforma perpendicular) usando cabos de bungee antes da imersão na água. Alternativamente, o gabinete pode ser preenchido e fixado com um pequeno peso em substratos rasos. Se as implantações forem destinadas no oceano pelagico, o recinto pode ser anexado a uma rede com uma boia de um lado e peso de mergulho do outro.
   4. Submergir completamente o gabinete para começar a encher. Durante o enchimento, segure firmemente o compartimento para evitar o excesso de movimento de água no interior. Uma vez que o nível da água atinja o topo do recinto, certifique-se de que nenhum ar está preso dentro.
      NOTA: No caso de algumas bolhas de ar estarem presas, incline o gabinete suavemente com o orifício de ventilação voltado para cima, o que permitirá que as bolhas escapem.
   5. Uma vez completamente cheio, sele os orifícios inferior e superior com dois plugues, que podem ser feitos de silício ou borracha ou selando as extremidades de 20 pontas de pipeta μL(Figura 4).
      NOTA: Esta etapa impede o fluxo dentro do compartimento durante a amostragem.
   6. Deixe a ISCA no lugar para amostragem por 1-3 h.
      NOTA: O tempo ideal de implantação é ditado principalmente pela temperatura da água e pelo tempo de duplicação da comunidade bacteriana. Quando a temperatura da água estiver acima de 20 °C, não é recomendável implantar o ISCA por mais de 1h, pois a divisão celular pode ocorrer nos poços que contêm quimioattractants após 1,5-2,0 h. No entanto, o tempo ideal de implantação pode ser testado antes do experimento isca, alterando comunidades naturais com os produtos químicos carregados e quantificando o número de células ao longo do tempo.
   7. Retire o compartimento da água. Coloque-o sobre um recipiente que permita que a água seja drenada do compartimento.
   8. Remova a parte superior da fita adesiva dos orifícios dianteiros com muita cuidado.
      NOTA: O fluxo de água que sai do compartimento deve estar em uma velocidade de gotejamento. Prossiga um buraco de cada vez, do topo do gabinete até o fundo. Deve levar aproximadamente 10-15 min para drenar completamente o gabinete.
   9. Uma vez que a linha d'água passe abaixo da parte superior do ISCA, remova o plugue inferior e escorra o resto da água.
   10. Enquanto os ISCAs ainda estiverem ligados ao gabinete, remova cuidadosamente a água presa em cima do ISCA com uma pipeta de 1 mL.
   11. Remova a ISCA sem tocar na superfície superior e use um lenço descartável para remover qualquer líquido restante na superfície.
       NOTA: É importante não tocar nas portas durante esse processo, pois as mudanças resultantes na pressão podem remover ou adicionar bactérias a granel no poço e viés da contagem bacteriana.
   12. Recupere as amostras do ISCA repetindo o passo 1.5.1.

4. Aplicações a jusante

NOTA: Os volumes são dados com base em uma amostra de 550 μL (uma linha de isca).

1. Fixar 100 μL de conteúdo de poço com glutaraldeído (concentração final de 2%) para citometria de fluxo para quantificar a quimiotaxis a cada atrativo.
   NOTA: Armazene no gelo (ou a 4 °C) e analise as amostras no mesmo dia. Alternativamente, as amostras podem ser congeladas em nitrogênio líquido após a fixação se a análise não for viável no mesmo dia. A citometria de fluxo é o método recomendado para quantificar o número de células nos poços isca, pois é simples, rápida e precisa¹².
2. Estomule 300 μL de conteúdo de poço em nitrogênio líquido para extração e análise de DNA subsequentes¹¹.
   NOTA: Armazene as amostras a -80 °C até a análise.
3. Adicione 90 μL de conteúdo de poço a 10 μL de tampão TE-glicerol e congele as amostras para genômica unicelular¹³.
4. Espalhe de 10 a 20 μL em placas de ágar contendo o meio desejado para isolamento bacteriano.

Resultados

Esta seção apresenta resultados laboratoriais usando o ISCA para testar a resposta quimotactica de micróbios marinhos a uma faixa de concentração de glutamina, um aminoácido conhecido por atrair bactérias do solo¹⁴. A concentração de glutamina que provocou a resposta quimotactica mais forte nos testes laboratoriais foi utilizada para a realização de um ensaio de quimiotaxis no ambiente marinho.

Para realizar os testes laboratoriais, as comunidades de água do...

Discussão

Na escala dos microrganismos aquáticos, o ambiente está longe de ser homogêneo e muitas vezes é caracterizado por gradientes físicos/químicos que estruturam comunidades microbianas^1,,15. A capacidade dos microrganismos motile de usar o comportamento (ou seja, quimiotaxis) facilita o forrageamento dentro desses microambientes heterogêneos¹. Estudar quimiotaxis diretamente no ambiente tem o potencial de identificar importantes intera?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylic glue	Evonik	1133	Acrifix 1S 0116
Acrylic sheet	McMaster-Carr	8505K725	Or different company
Adhesive tape	Scotch	3M 810	Scotch Magic tape
Autoclave	Systec	D-200	Or different company
Benchtop centrifuge	Fisher Scientific	75002451	Or different company
Bungee cord	Paracord Planet	667569184000	Or different company
Centrifuge tube - 2 mL	Sigma Aldrich	BR780546-500EA	Eppendorf tube
Conical centrifuge tube - 15 mL	Fisher Scientific	11507411	Falcon tube
Conical centrifuge tube - 50 mL	Fisher Scientific	10788561	Falcon tube
Deployment arm	Irwin	1964719	Or different company
Deployment enclosure plug	Fisher Scientific	21-236-4	See alternatives in manuscript
Disposable wipers	Kimtech - Fisher Scientific	06-666	Kimwipes
Flow cytometer	Beckman	C09756	CYTOFlex
Glutaraldehyde 25%	Sigma Aldrich	G5882	Or different company
Green fluorescent dye	Sigma Aldrich	S9430	SYBR Green I - 1:10,000 final dilution
Hydrophilic GP filter cartridge - 0.2 µm	Merck	C3235	Sterivex filter
In Situ Chemotaxis Assay (ISCA)	-	-	Contact corresponding authors
Laser cutter	Epilog Laser	Fusion pro 32	Or different company
Luria Bertani Broth	Sigma Aldrich	L3022	Or different company
Marine Broth 2216	VWR	90004-006	Difco
Nylon slotted flat head screws	McMaster-Carr	92929A243	M 2 × 4 × 8 mm
Pipette set	Fisher Scientific	05-403-151	Or different company
Pipette tips - 1 mL	Fisher Scientific	21-236-2A	Or different company
Pipette tips - 20 µL	Fisher Scientific	21-236-4	Or different company
Pipette tips - 200 µL	Fisher Scientific	21-236-1	Or different company
Sea salt	Sigma Aldrich	S9883	For artificial seawater
Serological pipette - 50 mL	Sigma Aldrich	SIAL1490-100EA	Or different company
Syringe filter - 0.02 µm	Whatman	WHA68091002	Anatop filter
Syringe filter - 0.2 µm	Fisher Scientific	10695211	Or different company
Syringe needle 27G	Henke Sass Wolf	4710004020	0.4 × 12 mm
Syringes - 1 mL	Codau	329650	Insulin Luer U-100
Syringes - 10 mL	BD	303134	Or different company
Syringes - 50 mL	BD	15899152	Or different company
Tube rack - 15 mL	Thomas Scientific	1159V80	Or different company
Tube rack - 50 mL	Thomas Scientific	1159V80	Or different company
Uncoated High-Speed Steel General Purpose Tap	McMaster-Carr	8305A77	Or different company
Vacuum filter - 0.2 µm	Merck	SCGPS05RE	Steritop filter